Methodenartikel

Generierung von braunfettspezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus-Single-Guide-RNA-Systems

DOI:

10.3791/65083

⸱

24. März 2023

 ,  , 
1Section on Integrative Physiology and Metabolism, Research Division, Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Protokoll beschreiben wir die technischen Verfahren zur Erzeugung von braunem Fettgewebe (BAT)-spezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus (AAV) Single-Guide RNA (sgRNA)-Systems. Die beschriebenen Schritte umfassen das Design der sgRNAs, die Herstellung der AAV-sgRNA-Partikel und die Mikroinjektion von AAV in die BAT-Lappen.

Zusammenfassung

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Braunes Fettgewebe (BAT) ist ein auf Energiedissipation spezialisiertes Fettdepot, das über die Sekretion bioaktiver Moleküle auch als endokrines Organ dienen kann. Die Züchtung von BVT-spezifischen Knockout-Mäusen ist einer der populärsten Ansätze, um den Beitrag eines Gens von Interesse zur BVT-vermittelten Energieregulation zu verstehen. Die konventionelle Gen-Targeting-Strategie unter Verwendung des Cre-LoxP-Systems war der Hauptansatz, um gewebespezifische Knockout-Mäuse zu erzeugen. Dieser Ansatz ist jedoch zeitaufwändig und mühsam. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für den schnellen und effizienten Knockout eines Gens, das für BAT von Interesse ist, unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus (AAV)-Single-Guide-RNA (sgRNA)-Systems. Die BAT interscapularis befindet sich in der tiefen Schicht zwischen den Muskeln. Daher muss die BVT freigelegt werden, um die AAV präzise und direkt in die BVT innerhalb des Gesichtsfeldes zu injizieren. Eine angemessene chirurgische Behandlung ist entscheidend, um Schäden an den sympathischen Nerven und Gefäßen zu vermeiden, wie z. B. der Sultzer-Vene, die mit dem BAT verbunden ist. Um Gewebeschäden zu minimieren, ist es von entscheidender Bedeutung, die dreidimensionale anatomische Lage des BVT und die chirurgischen Fähigkeiten, die in den technischen Schritten erforderlich sind, zu verstehen. Dieses Protokoll hebt die wichtigsten technischen Verfahren hervor, einschließlich des Designs von sgRNAs, die auf das interessierende Gen abzielen, der Herstellung von AAV-sgRNA-Partikeln und der Operation für die direkte Mikroinjektion von AAV in beide BAT-Lappen zur Erzeugung von BVT-spezifischen Knockout-Mäusen, die breit angewendet werden können, um die biologischen Funktionen von Genen in BAT zu untersuchen.

Einleitung

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Adipositas nimmt weltweit deutlich zu und führt zu einem breiten Spektrum von Stoffwechselerkrankungen 1,2,3. Das Fettgewebe ist der Schlüssel zu diesen Pathologien. Die beiden funktionell unterschiedlichen Arten von Fettgewebe, die es gibt, sind weißes Fettgewebe (WAT), das überschüssige Kalorien speichert, und braunes Fettgewebe (BAT) und das damit verbundene beige/britische Fett, das Energie für die Thermogenese abführt. Während BAT für seine energieableitende Funktion anerkannt ist, hat es auch endokrine Funktionen durch die Produktion bioaktiver Moleküle, die den Stoffwechsel in distalen Organen regulieren 4,5. Zahlreiche Studien an Nagetieren haben gezeigt, dass eine Erhöhung der Menge oder Aktivität von braunem oder beigem Fett zu einem erhöhten Energieverbrauch und einer verbesserten Insulinsensitivität führt. Beim Menschen haben Menschen mit nachweisbarer BAT eine signifikant geringere Prävalenz von kardiometabolischen Erkrankungen6. Somit birgt BAT ein ausgezeichnetes therapeutisches Potenzial für Adipositas-bedingte metabolische Folgeerkrankungen 7,8,9.

Um die Physiologie und Pathophysiologie der BAT-Entwicklung und -Funktion zu untersuchen und die molekularen Mechanismen aufzuklären, die an diesen Prozessen beteiligt sind, ist das BVT-spezifische transgene Mausmodell eine Methode der Wahl10. Das Cre-LoxP-Rekombinationssystem ist die am häufigsten verwendete Methode, um bedingte Knockout-Mäuse durch Editierung des Mausgenoms zu erzeugen. Dieses System hat die Modifikation (Überexpression oder Knockout) von Genen von Interesse auf gewebe-/zellspezifische Weise ermöglicht11. Es kann auch verwendet werden, um einen bestimmten Zelltyp zu markieren, indem ein selektives fluoreszierendes Reportergen exprimiert wird.

In jüngster Zeit wurde der Cre-LoxP-Systemansatz durch die Kombination der CRISPR-Cas9-Technologie und des Adeno-assoziierten Virus (AAV) Single-Guide RNA (sgRNA)-Systems weiterentwickelt12. Das CRISPR-Cas9-System ist ein spezifisches und effizientes Werkzeug zur Genom-Editierung, um bestimmte Regionen des Genoms zu modifizieren, zu regulieren oder gezielt anzusprechen13. Die CRISPR-Cas9-basierte Genom-Editierung ermöglicht eine schnelle genetische Manipulation genomischer Loci, da sie keine homologe Rekombination mit einem Gen-Targeting-Vektor erfordert. Kombinierte Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und AAV-sgRNA-Techniken ermöglichen es Forschern, Genfunktionen genauer zu verstehen, indem sie die Untersuchung der Rolle von Genen von Interesse zu gewünschten Zeitpunkten in Geweben/Zellen ermöglichen. Darüber hinaus reduzieren diese kombinierten Techniken den Zeit- und Arbeitsaufwand für die Erzeugung transgener Mäuse und ermöglichen die zeitliche Kontrolle der CRISPR-Cas9-Aktivität für die induzierbare Genom-Editierung in Mäusen, wenn eine induzierbare Cre-Linie verwendet wird14.

AAV-Vektoren sind sichere und effektive In-vivo-Gentransfersysteme. AAVs, die auf Fettgewebe abzielen, hinken jedoch der Anwendung in anderen Geweben wie Gehirn, Herz, Leber und Muskel hinterher15. Aufgrund der relativ geringen Transduktionseffizienz und des Tropismus mit natürlich vorkommenden Serotyp-Vektoren ist der AAV-gesteuerte Gentransport in das Fettgewebe nach wie vor eine Herausforderung15. In den letzten 5 Jahren haben wir und andere erfolgreich effektive und minimalinvasive Wege etabliert, um AAV-gesteuerte Gene in das Fettgewebe einzuschleusen, und Mausmodelle erstellt, die es uns ermöglichen, ein Verständnis der Gene zu erlangen, die an der Regulation der BAT-Funktion beteiligt sind16,17,18,19. Zum Beispiel haben wir durch die Verwendung von AAV8 zur Einschleusung von sgRNA, die auf Alox12 abzielt, die für 12-Lipoxygenase (12-LOX) kodiert, in die BAT der Ucp1-Cre/Cas9-Mäuse entdeckt, dass aktivierte BAT 12-LOX-Metaboliten produziert, nämlich 12-Hydroxy-Eicosapentaensäure (12-HEPE) und 13R, 14S-Dihydroxydocosahexaensäure (Maresin 2), um den Glukosestoffwechsel zu regulieren bzw. Adipositas-assoziierte Entzündungen zu beheben16. 17. Der Teufel Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zu den technischen Verfahren zur Verfügung, insbesondere zur Operation zur direkten Mikroinjektion von AAV-sgRNA in die BAT-Lappen, um BAT-spezifische Knockout-Mäuse mit dem kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und AAV-sgRNA-System zu erzeugen.

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Protokoll

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Alle Tierversuche und Pflegeverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Joslin Diabetes Center genehmigt.

1. Screening effektiver sgRNAs in kultivierten Zellen

HINWEIS: Um den Assay kostengünstig zu gestalten, empfehlen wir, vor dem Verpacken der sgRNAs in AAV-Partikel verschiedene sgRNAs in kultivierten Zellen über ein Lentivirus-basiertes System auf Cas9/sgRNA-Expression zu testen (Abbildung 1) und die sgRNAs auszuwählen, die die höchste Knockdown-Effizienz für In-vivo-Experimente bieten.

  1. CRISPR-Cas9 sgRNA-Design
    1. Entwerfen Sie sgRNAs mit Online-Werkzeugen, wie z. B. dem Broad sgRNA-Design-Tool (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21, dem CRISPOR-Online-Tool (http://crispor.tefor.net/)22 und anderen verfügbaren Tools.
    2. Geben Sie Gennamen oder DNA-Zielsequenzen in das Feld Genname ein und wählen Sie NGG als Protospacer-benachbartes Motiv (PAM) für SpCas9 aus, um potenzielle sgRNA-Sequenzen zu generieren.
    3. Wählen Sie die sgRNAs mit hoher vorhergesagter On-Target-Effizienz und geringer Off-Target-Aktivität aus. So werden beispielsweise sgRNAs mit einem Spezifitätswert von mindestens 50 auf dem CRISPOR-Output empfohlen. Wählen Sie unter den spezifischen sgRNAs, die den Filter passieren, diejenigen mit hohen Effizienzwertenaus 23.
      HINWEIS: Im Allgemeinen werden drei oder vier sgRNAs ausgewählt, um die Identifizierung effektiver sgRNAs zu gewährleisten.
  2. Aufbau des CRISPR-Cas9 sgRNA-Plasmids
    1. Synthese von sgRNA-Oligopaaren, die für 20 Nukleotide (nt) mit Überhängen (sowohl 5' als auch 3') von der BsmBI-Restriktionsstelle (Tabelle 1) kodieren, über eine DNA-Syntheseplattform.
    2. Ligatgeglühte Oligopaare mit BsmBI-linearisiertem lentiCRISPR v2-Vektor.
    3. Transformieren Sie das Ligationsprodukt in den Stbl3 E. coli-Stamm und bestätigen Sie die sgRNA-Insertionen durch Sanger-DNA-Sequenzierung unter Verwendung des U6-Forward-Primers.
      HINWEIS: Siehe das detaillierte Klonierungsverfahren im Addgene-Protokoll mit dem Titel LentiCRISPRv2 und lentiGuide-Puro: lentivirales CRISPR/Cas9 und Single Guide RNA24.
  3. Produktion von lentiviralen Partikeln
    1. Ca. 24 h vor der Transfektion 7 x 105 HEK-293-Zellen in 4 ml komplettem Nährmedium in eine 6 cm große Gewebekulturplatte legen.
    2. Fügen Sie 15 μl LT1-Transfektionsreagenz zu 250 μl serumfreiem Medium hinzu und inkubieren Sie es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    3. Bereiten Sie für jede sgRNA einen Transfektionscocktail gemäß Tabelle 2 in 250 μl serumfreiem Medium vor. Das in Schritt 1.3.2 hergestellte Transfektionsreagenz wird mit dem Plasmidcocktail vermischt und 20-30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
    4. Ersetzen Sie das gesamte Nährmedium durch 3,5 ml frisches Nährmedium für HEK-293-Zellen und geben Sie dann die DNA-Transfektionsreagenzmischung tropfenweise zu den HEK-293-Zellen, die in den 3,5 ml frischem Nährmedium kultiviert wurden.
    5. Wechseln Sie nach 12-15 Stunden Transfektion das Medium, um das Transfektionsreagenz zu entfernen, und ersetzen Sie es durch 4 ml frisches Nährmedium.
    6. Sammeln Sie nach 24 Stunden Inkubation das Zellkulturmedium, das lentivirale Partikel enthält, und filtern Sie das Medium durch einen 0,45-μm-Filter, um alle HEK-293-Zellen zu entfernen. Die Viren können einige Tage bei 4 °C gelagert werden. Für die Langzeitlagerung sollten die Viren bei −80 °C eingefroren werden.
      HINWEIS: Befolgen Sie bei der Herstellung von lentiviralen Partikeln die Biosicherheitsrichtlinien und arbeiten Sie in einer Umgebung (z. B. BL2+), die für den Umgang mit Lentiviren geeignet ist. Siehe das detaillierte Verfahren zur Herstellung von Lentiviren im Protokoll von Addgene mit dem Titel pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G).
  4. Infektion brauner Präadipozyten und Bestimmung des sgRNA-vermittelten Knockdowns
    1. Platte 1 x 10: 6 Maus-immortalisierte braune Präadipozyten in 1 ml frischem Medium mit 8 μg/ml Polybren pro Well in einer 6-Well-Platte.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden die immortalisierten braunen Präadipozyten mit SV40 T-Antigen25 erzeugt. Braune Präadipozyten werden in DMEM mit hohem Glukosegehalt und 10% FBS kultiviert.
    2. Fügen Sie 1 ml lentivirale Partikellösung aus Schritt 1.3 hinzu, um die Zellen zu infizieren. Halten Sie parallel einen nicht infizierten Zelltopf bereit, der als Kontrolle der Antibiotikaauswahl dient.
    3. 24 Stunden nach der Infektion auf frisches Medium umstellen. Geben Sie die entsprechenden Antibiotika (z. B. Puromycin mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml) in das Medium, um die nicht infizierten Zellen abzutöten, und wählen Sie die infizierten Zellen aus. Wechseln Sie jeden zweiten Tag zu frischem Medium, das das ausgewählte Antibiotikum enthält, bis alle nicht infizierten Kontrollzellen abgestorben sind.
    4. Sammeln Sie Protein aus den virusinfizierten Zellen und bestimmen Sie die Knockdown-Effizienz der sgRNAs durch Western-Blot-Analyse. Befolgen Sie die detaillierte Western-Blotting-Prozedur in Eslami und Lujan26. Aufgrund der unterschiedlichen Fluktuationsrate zwischen Proteinen sollten Sie mehrere Zeitpunkte testen (z. B. von Tag 6 bis Tag 12 nach der Virusinfektion), um den Verlust des Proteinsignals zu beobachten.
      HINWEIS: Wenn kein Antikörper verfügbar ist, der das von dem interessierenden Gen kodierte Protein erkennt, kann alternativ die Sanger-Sequenzierung verwendet werden, um die Genom-Editing-Effizienz jeder sgRNA zu bestimmen. Kurz gesagt, amplifizieren Sie die genomische DNA mit Primern, die die sgRNA-Zielregion flankieren, um PCR-Amplikons mit einer Länge von ~700 bp zu erzeugen. Die projizierte Bruchstelle sollte vorzugsweise ~200 bp stromabwärts von der Startstelle der Sequenzierung liegen. Anschließend wird das PCR-Produkt einer Sanger-Sequenzierung unterzogen. Analysieren Sie die Sequenzierungsergebnisse mit den Online-Werkzeugen, wie z. B. Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE), um die Häufigkeit kleiner Indels zu bestimmen, die von jeder sgRNA in einem Zellpool erzeugtwerden 27.

2. Aufbau des AAV-sgRNA-Plasmids

HINWEIS: In diesem Schritt werden die effektiven sgRNAs, die im obigen Screening identifiziert wurden, in den pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP-Vektor28 kloniert (Abbildung 2). In der Zwischenzeit wird auch eine nicht-zielgerichtete sgRNA (z. B. TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29), die keine Sequenz im Mausgenom erkennt, in denselben Vektor kloniert, um als nicht-editierte Kontrolle zu dienen.

  1. Linearisieren Sie das pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP-Rückgrat unter Verwendung von BbsI, das identische Überhänge mit synthetisierten sgRNA-Oligos erzeugt.
  2. Ligatieren Sie die getemperten Oligopaare mit linearisiertem pAAV-Vektor und bestätigen Sie die sgRNA-Insertionen, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
    HINWEIS: Das Klonierungsverfahren für lentiCRISPRv2-sgRNA wird auch für die AAV-sgRNA-Plasmidkonstruktion angewendet.

3. AAV-Verpackungen

  1. Packen Sie die in Abschnitt 2 generierten AAV-Vektoren in den AAV-Serotyp 8. Bereiten Sie AAV mit hohem Titer gemäß einem früheren Protokoll30 vor oder fordern Sie einen AAV-Verpackungsservice von viralen Kernen oder kommerziellen Diensten an. Verdünnen Sie den Virustiter auf 1 x 1013 Genomkopien/ml.
    HINWEIS: Das modifizierte AAV2-Genom, das eine sgRNA exprimiert, wird in den AAV-Serotyp 8 verpackt. Dieser Serotyp wurde aufgrund seiner hohen Effizienz für Fettgewebe ausgewählt18,31. Um eine Immunantwort zu verhindern, die durch Verunreinigungen wie Zelltrümmer und kleine Mengen mittlerer Komponenten induziert wird, wird hochgereinigtes AAV für die In-vivo-Injektion benötigt. Die Ultrareinigung kann durch Iodixanolgradienten und Ultrazentrifugation30 erreicht werden.

4. Präparation von Ucp1 Cre/Cas9 Mäusen

  1. Kaufen Sie den Mausstamm Ucp1-Cre (siehe Materialtabelle), der die Cre-Rekombinase exprimiert, unter der Kontrolle des Ucp1-Promotors. Homozygote Rosa26-floxed STOP-Cas9 knock-in Mäuse32 (siehe Materialtabelle), in denen die Expression von Cas9 Cre-Rekombinase-abhängig reguliert ist.
  2. Kreuzen Sie diese Stämme, um Ucp1-Cre/Cas9-Mäuse zu erzeugen, wie zuvor beschrieben16,17. Halten Sie alle Mäuse in einem Raum mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit (23 °C, 30 % Luftfeuchtigkeit) in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (Licht an um 6:30 Uhr; Licht aus um 18:30 Uhr) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser.
  3. Die resultierenden Ucp1-Cre/Cas9-Mäuse werden mit AAVs behandelt, die entweder Kontroll-sgRNA oder sgRNA tragen, die auf das interessierende Gen abzielt, und zwar mit der unten beschriebenen Methode. In dieser Studie wurden 12-15 Wochen alte männliche Ucp1-Cre/Cas9-Mäuse mit einem Gewicht von ca. 30 g verwendet.

5. Operation zur AAV-Injektion in die BVT bei Mäusen

  1. Betäuben Sie die Mäuse mit kontinuierlicher Inhalation von 2,5 % Isofluran zur Induktion und Erhaltung.
  2. Schmieren Sie beide Augen, um ein Austrocknen zu verhindern. Anschließend werden den Mäusen Analgetika (Banamin, 2,5 mg/kg Körpergewicht [KG], subkutane Injektion, siehe Materialtabelle) verabreicht, um postoperative Schmerzen und Leiden zu minimieren und zu verhindern.
  3. Rasieren Sie das Mausfell im Zwischenkappelbereich mit einem Rasierer und sterilisieren Sie den Operationsbereich mit mindestens drei abwechselnden Runden eines Peelings auf Jod- oder Chlorhexidinbasis, gefolgt von 70% Ethanol. Legen Sie dann sterile chirurgische Abdecktücher um die Einschnittstelle an.
  4. Schneiden Sie die Haut zwischen den Schulterblättern mit einem Skalpell ein (Abbildung 3A-B) und ziehen Sie dann die rasierte Haut ab, um das Fettgewebe am Hals mit einer chirurgischen Schere freizulegen (Abbildung 3C-D). Die Größe des Schnittes hängt von der Körpergröße ab, aber im Allgemeinen sollte der Schnitt etwa 2 cm betragen, um das Fettgewebe im Zwischenkreisblatt freizulegen.
  5. Schneiden Sie das Fettgewebe an der Grenze zwischen der distalen Region des Fettgewebes und den Muskeln mit einem einzigen Schnitt ab (Abbildung 3E-F). Die Größe des Schnittes sollte ca. 1 cm betragen, um nur den Eingang für das Einführen der chirurgischen Schere zum stumpfen Peeling des Fettgewebes zu öffnen.
  6. Ziehen Sie mit der dominanten Hand das Fettgewebe stumpf und vertikal mit einer chirurgischen Schere ab, um die BVT freizulegen, während Sie das Fettgewebe, einschließlich der BVT, mit der nicht dominanten Hand einklemmen (Abbildung 3G). Verwenden Sie die Sultzer-Ader als Orientierungspunkt, um die genaue BAT-Position anzugeben.
    ANMERKUNG: Die BVT in Abbildung 3H wurde zum Zwecke einer Bilddemonstration vollständig belichtet. Eine übermäßige Dissektion kann zu einer Schädigung der Nerven des umgebenden BVT führen. Eine falsche Ausrichtung der Schere kann die umliegenden Muskeln und die Sultzer-Vene verletzen und die BVT entleeren und zu übermäßigen Blutungen führen.
  7. Injizieren Sie für jede Maus langsam 40 μl AAV in beide BAT-Lappen (20 μl pro Lappen des BVT) mit einer scharfen Nadel (32 G, siehe Materialtabelle), die mit einer Hamilton-Spritze verbunden ist (100 μl, siehe Materialtabelle; Abbildung 3I). Überprüfen Sie, ob die Injektion erfolgreich war, da während der AAV-Verabreichung keine Leckagen aus der injizierten Stelle vorhanden sind.
    ANMERKUNG: Die Fledermaus in Abbildung 3I wurde zum Zwecke einer Bilddemonstration vollständig belichtet. Das Volumen der AAV-Lösung, die in einen BAT-Lappen verabreicht werden soll, wird durch die Größe des BVT der Empfängermaus bestimmt. Wir haben festgestellt, dass 20 μl AAV-Lösung für einen BAT-Lappen mit einem Gewicht von ca. 0,05 g in einer normalen C57BL6/J-Maus mit einem Gewicht von 30 g geeignet sind. Falls erforderlich, muss die virale Lösung möglicherweise konzentriert werden, um das gewünschte Volumen zu erreichen.
  8. Vergewissern Sie sich, dass keine Blutung aus dem injizierten BVT oder dem umgebenden Gewebe erfolgt. Mit Wasserstoffperoxidlösung getränkte Gaze (siehe Materialtabelle) zur Hämostase auf eine Blutungsstelle drücken.
  9. Bringen Sie das freiliegende Fettgewebe wieder in seine normale Position. Nähen Sie den Rand des Fettgewebes und der Muskeln mit einem resorbierbaren 5-0-Monofilamentfaden (Abbildung 3J). Vernähen Sie die offene Haut mit 5-0 beschichteten ungefärbten geflochtenen Fäden (Abbildung 3K-L).
    Anmerkungen: Abbildung 4 beschreibt die Schritte zum Nähen des geschälten Fettgewebes und der Muskeln.
  10. Halten Sie die Tiere nach der Operation bis zur vollständigen Genesung auf einem Heizkissen. Bieten Sie den Tieren Zugang zu Futter, Wasser und ausreichend Einstreu zum Nisten. Überwachen Sie sie regelmäßig auf Anzeichen von Stress oder Krankheit für 7 Tage der Genesung vor Beginn des Experiments.
  11. Bestätigen Sie die Effizienz der gezielten Gendeletion durch Western-Blot-Analyse in der von Mäusen präparierten BAT, wie in Sugimoto et al.16.

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Ergebnisse

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Bei den oben genannten Verfahren ist die präzise Abgabe von AAV-sgRNA an die BVT entscheidend für den Erfolg des Protokolls. Um die Wirkung der AAV-sgRNA zu maximieren und die Gewebeschädigung während der Operation zu minimieren, ist es wichtig, die dreidimensionale (3D) anatomische Lage des BVT zu verstehen. Wie in Abbildung 3E dargestellt, ist es schwierig, die genaue Position der BVT zu identifizieren, ohne das Gewebe freizulegen. Eine übermäßige BVT-Exposition kann jedoch das Gewebe schä...

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Diskussion

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Die existierenden veröffentlichten Methoden für den AAV-vermittelten Gentransfer in den interscapularären BAT enthalten keine detaillierten Bilder und Videos, die die Operationstechniken und den Ansatz für die direkte AAV-Injektion in den BVT beschreiben. Bei den meisten publizierten Methoden33,34 wird das AAV in das Fettgewebe injiziert, das die interscapularäre BAT umgibt, und nicht in die BVT selbst. Daher gibt es mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll,...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde teilweise durch die Zuschüsse der U.S. National Institutes of Health (NIH) R01DK122808, R01DK102898 und R01DK132469 (an Y.-H.T.) sowie P30DK036836 (an das Diabetes Research Center des Joslin Diabetes Center) unterstützt. T. T. wurde durch das SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Stipendium, Sunstar Foundation, Japan) und das Stipendium der American Heart Association 903968 unterstützt. Y. Z. wurde durch das Charles A. King Trust Fellowship unterstützt. Wir danken Sean D. Kodani für das freundliche Korrekturlesen des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Chemikalien, Peptide und rekombinante Proteine
OPTI-MEM serumfreies MediumInvitrogen31985
Polybrene Infektions-/TransfektionsreagenzSigmaTR-1003-G
TransIT-LT1 TransfektionsreagenzMirusMIR 2300
Rekombinante DNA
lentiCRISPR v2 Vektor Addgen52961
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFPAddgen89060
pMD2.G HüllplasmidAddgene12259
psPAX2 VerpackungsplasmidAddgen12260
Experimentelle Modelle: Zelllinien
HEK-293 ZellenATCCCRL-1573
WT-1 ZellenEntwickelt im Tseng-LaborPMID: 14966273
Experimentelle Modelle: Organismen/Stämme
Cas9-Knockin-MäuseJackson Laboratories24857
Ucp1-CRE-MäuseJackson Laboratories24670
Andere
BanaminePatterson07-859-1323
Hamilton SpritzeHamiltonModell 710 RN Spritze
WasserstoffperoxidlösungFisher ScientificH325-500
NadelHamilton32 Gauge, kleine Nabe RN Nadel, Nadelspitze Typ 2
Naht 5-0 Unify PCL25 P-3 Ungefärbt 18 Zoll Monofilament 12/BxHenry Schein1273504
Naht 5-0 Unify Silk P-3 Schwarz 18 Zoll 12/BxHenry Schein
1294522

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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