Methodenartikel

Effiziente Vaskularisierung von Nierenorganoiden durch intracelome Transplantation in Hühnerembryonen

DOI:

10.3791/65090

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17. Februar 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine - Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory of Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 3IBPS, CNRS UMR7622, Developmental Biology Laboratory, Sorbonne Université, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In dieser Arbeit stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Transplantation von Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Hühnerembryonen vor. Diese Methode induziert eine Vaskularisierung und eine verbesserte Reifung der Organoide innerhalb von 8 Tagen und kann verwendet werden, um diese Prozesse auf effiziente Weise zu untersuchen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nierenorganoide, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen werden, enthalten nephronähnliche Strukturen, die denen in der erwachsenen Niere bis zu einem gewissen Grad ähneln. Leider wird ihre klinische Anwendbarkeit durch das Fehlen eines funktionellen Gefäßsystems und die daraus resultierende eingeschränkte Reifung in vitro erschwert. Die Transplantation von Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Hühnerembryonen induziert die Vaskularisierung durch perfundierte Blutgefäße, einschließlich der Bildung glomerulärer Kapillaren, und fördert deren Reifung. Diese Technik ist sehr effizient und ermöglicht die Transplantation und Analyse einer großen Anzahl von Organoiden. Diese Arbeit beschreibt ein detailliertes Protokoll für die intracelome Transplantation von Nierenorganoiden in Hühnerembryonen, gefolgt von der Injektion von fluoreszenzmarkiertem Lektin zur Färbung des perfundierten Gefäßsystems und der Entnahme von transplantierten Organoiden für die bildgebende Analyse. Diese Methode kann verwendet werden, um die Organoid-Vaskularisierung und -Reifung zu induzieren und zu untersuchen, um Hinweise zur Verbesserung dieser Prozesse in vitro zu finden und die Krankheitsmodellierung zu verbessern.

Einleitung

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Es hat sich gezeigt, dass aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) gewonnenen Nierenorganoiden Potenzial für Entwicklungsstudien 1,2,3,4, Toxizitätsscreening 5,6 und Krankheitsmodellierung5,7,8,9,10,11,12,13 haben. Ihre Anwendbarkeit für diese und spätere klinische Transplantationszwecke ist jedoch durch das Fehlen eines vaskulären Netzwerks eingeschränkt. Während der embryonalen Nierenentwicklung interagieren Podozyten, Mesangialzellen und vaskuläre Endothelzellen (ECs), um die komplizierte Struktur des Glomerulus zu bilden. Ohne diese Wechselwirkung kann sich die glomeruläre Filtrationsbarriere, bestehend aus Podozyten, der glomerulären Basalmembran (GBM) und ECs, nicht richtig entwickeln14,15,16. Obwohl Nierenorganoide in vitro einige ECs enthalten, bilden diese kein richtiges Gefäßnetzwerk und nehmen mit der Zeit ab17. Es ist daher nicht verwunderlich, dass die Organoide unreif bleiben. Die Transplantation in Mäusen induziert eine Vaskularisierung und Reifung der Nierenorganoide 18,19,20,21. Leider ist dies ein arbeitsintensiver Prozess, der für die Analyse einer großen Anzahl von Organoiden ungeeignet ist.

Hühnerembryonen werden seit über einem Jahrhundert verwendet, um die Vaskularisierung und Entwicklung zu untersuchen22. Sie sind leicht zugänglich, wartungsarm, verfügen nicht über ein voll funktionsfähiges Immunsystem und können sich nach dem Öffnen der Eierschale normal entwickeln23,24,25,26. Es konnte gezeigt werden, dass die Transplantation von Organoiden auf deren chorioallantoische Membran (CAM) zu einer Vaskularisation führt27. Die Dauer der Transplantation auf dem CAM sowie der Reifegrad des Transplantats sind jedoch durch die CAM-Bildung begrenzt, die bis zum 7. Embryonaltag dauert. Daher wurde kürzlich eine Methode entwickelt, um Nierenorganoide durch intracelome Transplantation in Hühnerembryonen effizient zu vaskularisieren und reifenzu lassen 28. Seit den 1930er Jahren ist bekannt, dass die Zölomhöhle von Hühnerembryonen eine günstige Umgebung für die Differenzierung von embryonalem Gewebedarstellt 29,30. Es ist früh in der Embryonalentwicklung zugänglich und ermöglicht eine relativ unbegrenzte Ausdehnung des Transplantats in alle Richtungen.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden in die Zölomhöhle von Tag-4-Hühnerembryonen beschrieben. Diese Methode induziert eine Vaskularisierung und eine verbesserte Reifung der Organoide innerhalb von 8 Tagen. Die Injektion von fluoreszenzmarkiertem Lens culinaris Agglutinin (LCA) vor der Opferung der Embryonen ermöglicht die Visualisierung von perfundierten Blutgefäßen in den Organoiden durch konfokale Mikroskopie.

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Protokoll

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Nach niederländischem Recht war für diese Forschung keine Genehmigung durch den Tierschutzausschuss erforderlich.

1. Vorbereitung von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden für die Transplantation

  1. Unterscheidung von hiPS-Zellen zu Nierenorganoiden unter Verwendung des von Takasato et al.4,18,31 entwickelten Protokolls. Kultivieren Sie die Organoide nach diesem Protokoll auf Polyester-Zellkultureinsätzen mit 0,4 μm Poren (Zellkultureinsätze) bis zum Tag 7 + 12 der Differenzierung. Jeder Zellkultureinsatz enthält drei Organoide.
  2. Entfernen Sie die Organoide aus dem Zellkultureinsatz.
    1. Machen Sie mit einer Präparierzange ein Loch in die Mitte der Membran des Zellkultureinsatzes. Machen Sie mit einer Präparierschere drei Schnitte in die Membran vom Loch in der Mitte bis zum Rand des Zellkultureinsatzes und schneiden Sie zwischen den Organoiden. So entstehen drei Membranstücke mit je einem Organoid, die an ihrem äußeren Rand noch mit dem Zellkultureinsatz verbunden sind.
    2. Fassen Sie eines der Membranstücke in der Nähe des äußeren Randes mit einer Pinzette und reißen Sie es vom Zellkultureinsatz ab. Legen Sie das Stück Membran mit dem angehängten Organoid in eine Petrischale. Geben Sie ein paar Tropfen der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco ohne Kalzium und Magnesium (DPBS-/-) in das Organoid, um eine Austrocknung zu vermeiden. Wiederholen Sie dies für die anderen beiden Organoide.
  3. Halbieren Sie die Organoide, indem Sie ihre Membran mit einer Pinzette festhalten und sie mit einer zweischneidigen Rasierklinge aus rostfreiem Stahl in zwei Hälften schneiden (ein ganzes Organoid ist zu groß, als dass das Celom es in diesem Entwicklungsstadium aufnehmen könnte). Drücken Sie die beiden Organoidhälften vorsichtig mit einem Dura-Dissektor von der Membran ab. Die Membran wird verworfen und die Organoide bis zur Transplantation in DPBS-/- belassen.
    HINWEIS: Bereiten Sie maximal drei Organoide gleichzeitig für die Transplantation vor, um Stress für die Organoide vor der Transplantation zu vermeiden. Im Idealfall bereitet eine Person die Organoide vor, während eine andere die Transplantation durchführt.

2. Vorbereitung von Hühnerembryonen für die Transplantation

  1. Befruchtete weiße Leghorn-Eier ausbrüten. Beginnen Sie mit der Inkubation der Eizellen am Tag 7 + 8 der Nierenorganoid-Differenzierung, um den richtigen Zeitpunkt der Transplantation zu gewährleisten.
    1. Legen Sie die befruchteten weißen Leghorn-Eier (Gallus domesticus) waagerecht auf einen Halter (Abbildung 1A; Tag 0), markieren Sie mit einem Bleistift die Mitte der nach oben gerichteten Seite.
      Anmerkungen: Als Halter für die Bebrütung der Eier können entweder maßgefertigte Kunststoffhalter oder Eierkartons verwendet werden.
    2. Stellen Sie den Halter mit den Eiern in einen befeuchteten Inkubator bei 38 ± 1 ºC (Abbildung 1A; Tag 0).
    3. Bebrüten Sie die Eier 3 Tage lang und halten Sie das Wasserbecken im Inkubator gefüllt.
  2. Erstellen Sie an Tag 3 der Inkubation ein Fenster in der Eierschale.
    1. Legen Sie am 3. Tag der Inkubation ein kleines Stück (~1 cm x 0,5 cm) transparentes Klebeband auf die spitze Spitze des Eies (kleines Ende). Machen Sie ein kleines Loch in die Eierschale in der Mitte des transparenten Klebebandes, indem Sie mit dem scharfen Ende einer Sezierschere darauf klopfen.
    2. Führen Sie eine 19-G-Nadel mit einer 5-ml-Spritze in einem Winkel von 45° in das Loch ein, um eine Beschädigung des Dottersacks zu vermeiden, und saugen Sie 2-3 ml Eiweiß aus der Eizelle ab, um den Embryo in die Eizelle zu senken. Verschließen Sie das Loch mit einem zweiten Stück (~1 cm x 0,5 cm) transparentem Klebeband.
    3. Lege ein großes Stück (~5 cm x 5 cm) transparentes Klebeband auf die mit Bleistift markierte, nach oben zeigende Seite des Eies. Machen Sie ein Loch in die Eierschale in der Mitte des transparenten Klebebandes, indem Sie mit dem scharfen Ende einer Sezierschere darauf klopfen (Abbildung 1A; Tag 3).
    4. Schneiden Sie von diesem Loch aus mit einer gebogenen Präparierschere ein kleines kreisförmiges Fenster in die Eierschale. Schauen Sie durch dieses Fenster, um den Embryo zu lokalisieren, und vergrößern Sie dann das Fenster, um den Zugang zum Embryo zu optimieren (Abbildung 1A; Tag 3).
    5. Entfernen Sie alle großen Stücke der Eierschale, die möglicherweise auf den Embryo gefallen sind, mit einer Pinzette. Entfernen Sie kleinere Stücke, indem Sie einige Tropfen DPBS mit Kalzium und Magnesium (DPBS+/+) mit einer Kunststofftransferpipette auf den Embryo geben und dann das DPBS+/+ mit der Eierschale in die Pipette aspirieren.
    6. Geben Sie drei Tropfen DPBS+/+ , ergänzt mit 0,5 % Penicillin/Streptomycin, mit einer Plastikpipette in die Eizelle.
    7. Verschließen Sie das Fenster vorsichtig mit einem großen Stück (~5 cm x 5 cm) transparentem Klebeband, bevor Sie das Ei bis zum 4. Tag der Inkubation wieder in den Inkubator legen, wenn sich der Embryo im Hamburger-Hamilton-Stadium 23-24 (HH 23-24)32 befindet.
      HINWEIS: Das Versiegeln des Fensters ist sehr wichtig, um eine Austrocknung und den Tod des Embryos zu vermeiden.
    8. Überprüfen Sie die Embryonen täglich auf Lebensfähigkeit, indem Sie sie durch das Klebeband betrachten (entfernen Sie das Klebeband nicht, um eine Austrocknung zu vermeiden). Während dieser ersten Tage der Inkubation ändert sich die Farbe des Eigelbs nach dem Tod des Embryos von hellgelb zu mattgelb. Entsorgen Sie verstorbene Embryonen.
    9. Halten Sie das Wasserbecken im Inkubator gefüllt.

3. Intracelomische Transplantation am 4. Tag der Inkubation

  1. Zugang zum Zölom-Hohlraum
    1. Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab.
    2. Legen Sie das Ei unter ein Seziermikroskop auf einen Gummihalter oder Eierkarton.
    3. Der Hühnerembryo befindet sich nun in HH 23-24 und liegt auf der linken Seite, wobei die rechte Seite dem Betrachter zugewandt ist (Abbildung 1A; Tag 4). Suchen Sie den rechten Flügel und die Beinknospe des Embryos, da das Celom zwischen diesen beiden Gliedmaßenknospen zugänglich ist. Schaffen Sie im Bereich zwischen rechtem Flügel und Beinknospe nacheinander eine Öffnung in der Vitellinmembran, dem Chorion und dem Amnion, indem Sie sie mit zwei Paaren Präparierzangen halten und vorsichtig in entgegengesetzte Richtungen ziehen.
      Anmerkungen: Die Vitellin-Membran ist die erste Membran, die nach dem Öffnen des Eies auftritt, und in einigen Fällen ist sie bereits nach dem Herstellen des Fensters am 3. Tag beschädigt. Wenn der Embryo gedreht wird, liegt er auf der rechten Seite und zeigt mit der linken Seite dem Betrachter zu (Abbildung 1A; Tag 4), ist es notwendig, es umzudrehen, um eine Transplantation zu ermöglichen. Machen Sie dazu eine große Öffnung in die Vitellin- und Chorionmembran und drehen Sie den Embryo vorsichtig mit einer Pinzette um.
    4. Prüfen Sie, ob ein ungehinderter Zugang zur Zölomhöhle besteht: Fassen Sie den Rand der Körperwand zwischen Flügel und Gliedmaßenknospe vorsichtig mit einer Präparierzange und ziehen Sie sie leicht in Richtung des Betrachters. Der Zölomhohlraum muss deutlich sichtbar sein. Führen Sie vorsichtig ein stumpfes, aber schlankes Instrument (z. B. einen stumpfen Wolframdraht in einem Mikroskalpellhalter) in die Zölomhöhle ein.
      HINWEIS: Wenn das stumpfe Instrument nicht in die Zölomhöhle eingeführt werden kann, bedeutet dies, dass eine oder mehrere der Membranen nicht richtig geöffnet wurden.
  2. Transplantation
    1. Legen Sie ein halbes Organoid in das Ei auf die Allantois mit einem Dura-Dissektor.
    2. Fassen Sie mit einer Präparierzange vorsichtig den Rand der Körperwand und ziehen Sie ihn leicht in Richtung des Betrachters, um die Öffnung zum Celom sichtbar zu machen.
      Anmerkungen: Vermeiden Sie es, die Blutgefäße in der Körperwand zu beschädigen.
    3. Bewegen Sie das Organoid vorsichtig in Richtung und durch die Öffnung in der Körperwand in das Celom mit einem stumpfen Wolframdraht in einem Mikroskalpellhalter. Drücken Sie das Organoid leicht nach kranial, um es im Celom zu verankern. Er ist nun direkt hinter der Flügelknospe sichtbar (Abbildung 1A; Tag 4).
    4. Geben Sie drei Tropfen DPBS+/+ mit einer Transferpipette aus Kunststoff in das Ei.
    5. Verschließen Sie das Fenster vorsichtig mit einem großen Stück (~5 cm x 5 cm) transparentem Klebeband, bevor Sie die Eizelle bis zum 12. Tag der Inkubation (8 Tage nach der Transplantation) wieder in den Inkubator legen.
    6. Kontrollieren Sie die Embryonen täglich auf Lebensfähigkeit, indem Sie sie durch das Klebeband betrachten (entfernen Sie das Klebeband nicht, um eine Austrocknung zu vermeiden). Entsorgen Sie verstorbene Embryonen.
      HINWEIS: Wenn die Embryonen und ihre Chorioallantoismembranen wachsen, werden sie durch das Klebeband deutlicher sichtbar. Mangelnde Bewegung des Embryos und kollabierte oder spärliche Blutgefäße sind ein Zeichen für den Tod des Embryos.
    7. Überprüfen Sie das Wasserbecken im Inkubator täglich und halten Sie es gefüllt.

4. Injektion von fluoreszenzmarkiertem Lektin

  1. Vorbereitung der Injektion
    1. Stellen Sie Mikroinjektionsnadeln aus Glas her, indem Sie Glasmikrokapillaren in einem Mikropipettenzieher mit den folgenden Einstellungen ziehen: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Während Sie durch das Präpariermikroskop schauen, brechen Sie die Spitzen vorsichtig mit einer Präparierzange von den Mikroinjektionsnadeln ab, um eine Öffnung zu schaffen.
      Anmerkungen: Die erforderlichen Einstellungen für den Mikropipettenabzieher können je nach Gerät unterschiedlich sein.
    2. Montieren Sie das Einspritzsystem. Nehmen Sie zwei Stücke 38 cm Silikonschlauch und verbinden Sie sie miteinander, indem Sie einen 0,2 μm Filter dazwischen legen. Führen Sie ein Mundstück in das Ende des Schlauchs ein, der mit dem Filterauslass (Silikonschlauch 1) verbunden ist, und einen Anschluss in das Ende des Schlauchs, der mit dem Filtereinlass (Silikonschlauch 2) verbunden ist. Führen Sie abschließend die Mikroinjektionsnadel in den Konnektor ein (Abbildung 1B).
    3. Fluoreszenzmarkiertes Linsen-culinaris-Agglutinin (LCA) mit DPBS-/- auf eine Konzentration von 2,5 mg ml-1 in einem 0,5-ml-Röhrchen verdünnen und für ~30 s in einer Mikrozentrifuge herunterschleudern, um die Aggregate zum Boden des Röhrchens zu bewegen.
    4. Pipettieren Sie 20 μl LCA auf ein Stück Parafilm.
    5. Saugen Sie die 20 μl LCA aus dem Parafilm in die Mikrokapillarnadel des zusammengebauten Injektionssystems ab.
  2. Injektion
    1. Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab. Legen Sie das Ei unter ein Seziermikroskop in einen Gummihalter.
    2. Beurteilen Sie das Gefäßsystem und lokalisieren Sie die Venen, die sich durch ihre etwas hellere rote Farbe von den Arterien unterscheiden lassen (Abbildung 1A; Tag 12). Um den Zugang zum Gefäßsystem zu verbessern, vergrößern Sie das Fenster vorsichtig, indem Sie es mit einer gebogenen Präparierschere schneiden. Wählen Sie eine Vene für die Injektion basierend auf Zugänglichkeit und Größe aus.
    3. Führen Sie die Spitze der Mikrokapillarnadel in einem Winkel von 0°-20º in die ausgewählte Vene ein. Stellen Sie sicher, dass sich die Nadel in der Vene befindet, indem Sie die Spitze vorsichtig von einer Seite zur anderen bewegen. Blasen Sie vorsichtig und gleichmäßig in das Einspritzsystem, um die Ökobilanz einzuspritzen (Abbildung 1A; Tag 12).
      HINWEIS: Wenn sich die Nadel in der Vene in der richtigen Position befindet, sollte sie innerhalb der Grenzen der Vene bleiben.
    4. Legen Sie das Ei für 10 Minuten zurück in den Inkubator, damit die LCA zirkulieren kann.
      Anmerkungen: Es ist nicht notwendig, das Ei während dieser Zeit mit Klebeband zu verschließen.

5. Sammeln von transplantierten Organoiden am 12. Tag der Inkubation

  1. Den Hühnerembryo opfern
    1. Legen Sie das Ei in einen Gummihalter auf die Bank. Schneiden Sie das Klebeband mit einer gebogenen Präparierschere vom Fenster ab. Schneiden Sie dann die Membranen, die den Embryo umgeben, mit einer gebogenen Präparierschere durch.
      HINWEIS: Ein Präpariermikroskop ist für diesen Schritt nicht erforderlich.
    2. Schöpfen Sie den Embryo mit einem perforierten Löffel aus dem Ei und enthaupten Sie den Embryo sofort mit einer Schere. Legen Sie den Körper des Embryos in eine Petrischale unter das Seziermikroskop.
  2. Auffinden und Sammeln von Organoiden
    1. Legen Sie den Embryo auf den Rücken in die Petrischale und spreizen Sie seine Gliedmaßen.
    2. Öffnen Sie die Bauchdecke des Embryos vorsichtig mit einer Pinzette entlang der Längsachse.
    3. Lokalisieren Sie das Organoid im Inneren des Embryos. Das Organoid wird am häufigsten am rechten Leberlappen befestigt, entweder an der Schwanzspitze oder kranial direkt unter dem Brustkorb (Abbildung 1A; Tag 12). Es wird daher empfohlen, zunächst an diesen Orten zu suchen.
    4. Sobald das Organoid lokalisiert ist, entfernen Sie es aus dem Embryo, indem Sie es mit einer Mikroschere umschneiden. Legen Sie das Organoid und das unweigerlich daran haftende Hühnergewebe in eine Petrischale unter das Präpariermikroskop. Entfernen Sie so viel Hühnerfleisch wie möglich mit einer zweischneidigen Rasierklinge aus Edelstahl.
    5. Verarbeiten Sie das Organoid je nach gewünschter Analyse.

6. Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung

  1. Ein transplantiertes Organoid wird in eine 24-Well-Platte gegeben und in 500 μl 4%igem Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C für 24 h fixiert. 3x mit DPBS-/- waschen.
  2. Permeabilisieren und blockieren Sie das Organoid in 300 μL Blockierlösung (0,3 % Triton-X in DPBS-/- mit 10 % Eselsserum) für 2 h bei Raumtemperatur.
  3. Bereiten Sie die primäre Antikörpermischung vor: Für ein Organoid verdünnen Sie die primären Antikörper NPHS1 (Schaf-α-Mensch, Verdünnung 1:100), CD31 (Maus-α-Mensch, Verdünnung 1:100) und LTL (Biotin-konjugiert, Verdünnung 1:300) in 300 μl Blockierungslösung. Die Antikörpermischung wird in das Organoid gegeben und 72 h bei 4 °C inkubiert.
  4. 3x mit 0,3% TritonX in DPBS-/- waschen.
  5. Bereiten Sie die Sekundärantikörpermischung vor: Für ein Organoid verdünnen Sie die Sekundär α antikörper Alexa Fluor 647 (Verdünnung 1:500), Esel-α-Maus Alexa Fluor 488 (Verdünnung 1:500) und Streptavidin Alexa Fluor 405 (Verdünnung 1:200) in 300 μl Blockierlösung. Die sekundäre Antikörpermischung zum Organoid geben und 2-4 h bei Raumtemperatur inkubieren. Mit Alufolie abdecken, um eine Lichtexposition der Sekundärantikörper zu vermeiden.
  6. 3x mit DPBS-/- waschen.
  7. Das Organoid in ~30 μL Eindeckmedium in eine 35 mm Glasbodenschale einbetten und über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen, abgedeckt mit Alufolie. Bei 4 °C lagern.
  8. Aufnahme mit einem konfokalen Mikroskop.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Methode und der Zeitplan für die Differenzierung von hiPS-Zellen zu Nierenorganoiden, die Inkubation von befruchteten Hühnereiern, die Transplantation von Nierenorganoiden, die Injektion von LCA und die Entnahme der Organoide sind in Abbildung 1A zusammengefasst. Es ist wichtig, den Zeitpunkt der Organoid-Differenzierung und der Hühnerei-Inkubation zu koordinieren und mit der Differenzierung 15 Tage vor der Inkubation zu beginnen. Die Aktionen an Tag 0, 3, 4 und 12 der Inkubation werden ...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Manuskript wird ein Protokoll für die intracelome Transplantation von hiPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden in Hühnerembryonen demonstriert. Nach der Transplantation werden Organoide durch perfundierte Blutgefäße vaskularisiert, die aus einer Kombination von aus menschlichen Organoiden und Hühnern bestehen. Diese verteilen sich über das Organoid und dringen in die glomerulären Strukturen ein, was eine Wechselwirkung zwischen den ECs und Podozyten ermöglicht. Es konnte bereits gezeigt werden, dass dies zu einer ve...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken George Galaris (LUMC, Leiden, Niederlande) für seine Hilfe bei der Injektion von Hühnerembryonen. Wir bedanken uns für die Unterstützung von Saskia van der Wal-Maas (Institut für Anatomie und Embryologie, LUMC, Leiden, Niederlande), Conny van Munsteren (Institut für Anatomie und Embryologie, LUMC, Leiden, Niederlande), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Niederlande) und Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Niederlande). M. Koning wird unterstützt von "Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC". Diese Arbeit wurde zum Teil durch den Fonds der Universität Leiden "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02 unterstützt. Diese Arbeit wird von den Partnern Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) und Health Holland, Top Sector Life Sciences &; Health unterstützt. C.W. van den Berg und T.J. Rabelink werden vom Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW) unterstützt, das Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine wird durch Zuschüsse der Novo Nordisk Foundation unterstützt (NNF21CC0073729).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 &Mikro; m Filter: Whatman Puradisc 30 Spritzenvorsatzfilter 0,2 & Mikro; mWhatman10462200
35 mm Glasbodenschalen MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
Aspirator-Rohrbaugruppen für kalibrierte MikrokapillarpipettenSigma-AldrichA5177-5EAEnthält Silikonschläuche, Mundstück und Konnektor
Konfokales Mikroskop: Leica Weißlicht-Laser-Konfokalmikroskop LeicaTCS SP8
Präparierzange, einfache Ausführung. Titan, gebogen, mit feinen scharfen SpitzenHammacher KarlHAMMHTC091-10
Präparierzange, einfache Ausführung. Titan, gerade, mit feinen, scharfen SpitzenHammacher KarlHAMMHTC090-11
Präpariermikroskop Wild Heerbrugg355110
Präparierschere, gebogen, OP-special, extra scharf/scharfHammacher KarlHAMMHSB391-10
EselsserumSigma-AldrichD9663
Esel-Α-Maus Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-212-02Verdünnung 1:500
Esel-Α-Schaf Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA-21448Verdünnung 1:500
Zweischneidige Rasierklingen aus EdelstahlElectron Microsopy Sciences72000
DPBS, Calcium, Magnesium (DPBS-/-)ThermoFisher Scientific14040133
DPBS, kein Calcium, kein Magnesium (DPBS+/+)ThermoFisher Scientific14190094
Eierkartons oder maßgefertigte Eierhalter NANA
Befruchtete weiße Leghorn-Eier (Gallus Gallus Domesticus) Drost Loosdrecht B.V.
InkubatorElbanton BVET-3 combi
Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL) BiotinylatedVector LaboratoriesB-1325Verdünnung 1:300
Mikroschere, gerade, scharf/scharf, Schnittlänge 10 mmHammacher KarlHAMMHSB500-09
Mikrokapillaren: Dünnwandige Glaskapillaren 1,5 mm, FilamentWorld Precision InstrumentsTW150F-3
MikropipettenabzieherSutter Instrument CompanyModell P-97Wir verwenden die folgenden Einstellungen: Hitze 533, Zug 60, Geschwindigkeit 150, Zeit 200
Mikroskalpellhalter: Castroviejo Klingen- und Stifthalter, 12 cm, runder Griff, konische 10 mm Backen.EuronexiaL-120
Eindeckmedium: Prolong Gold Antifade EindeckmittelThermoFisher ScientificP36930
Olivecrona Dura Dissektor 18 cm Reda41146-18
Parafilm Heathrow ScientificHS234526B
Penicillin-Streptomycin 5.000 U/mlThermoFisher Scientific15070063
perforierter LöffelEuronexiaS-20-P
Petrischale 60 x 15 mm CELLSTAR628160
Transferpipetten aus Kunststoff ThermoFisher ScientificPP89SB
Gereinigter Maus-Anti-Human-CD31-AntikörperBD Biosciences555444Verdünnung 1:100
Rhodamin markierte Linse Culinaris Agglutinin (LCA)Vector LaboratoriesRL-1042Dieses Produkt wird seit kurzem nicht mehr hergestellt. Vectorlabs produziert nach wie vor Dylight 649-markierte LCA (DL-1048-1) und Fluorescein-markierte LCA (FL-1041-5).
D systemsAF4269Verdünnung 1:100
Sterile Injektionsnadeln, 19 GBD Mikrolanze301500
Streptavidin Alexa Fluor 405ThermoFisher ScientificS32351Verdünnung 1:200
Spritze 5 mLBD Emerald307731
Transparentes Klebeband Tesa4124Erhältlich in den meisten Baumärkten
Triton XSigma-AldrichT9284
Wolframdraht, Ø 0,25 mm;ThermoFisher Scientific010404.H2
NA

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
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  5. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167(2018).
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