Summary
ترتبط المنتجات Xenogenec (الكيميائية أو المشتقة من الحيوانات) التي يتم إدخالها في خطوات تحضير / معالجة العلاج بالخلايا بزيادة خطر التفاعل المناعي وانتقال مسببات الأمراض في المرضى المضيفين. هنا ، يتم وصف طريقة كاملة خالية من xenogenec لعزل وتوسيع الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون في المختبر .
Abstract
وبالنظر إلى التأثير المتزايد للعلاج بالخلايا الجذعية، أثيرت شواغل تتعلق بالسلامة البيولوجية فيما يتعلق بالتلوث المحتمل أو انتقال العدوى بسبب إدخال المنتجات المشتقة من الحيوانات أثناء التلاعب في المختبر . يمكن أن ترتبط المكونات الغريبة ، مثل كولاجيناز أو مصل الجنين البقري ، الذي يشيع استخدامه أثناء عزل الخلايا وخطوات التوسع بالمخاطر المحتملة للتفاعل المناعي أو العدوى الفيروسية والبكتيرية والبريون في المرضى المستقبلين. باتباع إرشادات ممارسات التصنيع الجيدة ، يجب تجنب تفكك الأنسجة الكيميائية ، بينما يمكن استبدال مصل الأبقار الجنيني (FBS) بمكملات خالية من الزينوجينيك. علاوة على ذلك ، لضمان سلامة المنتجات الخلوية ، من المهم تحديد طرق أكثر موثوقية وقابلة للتكرار. لقد طورنا طريقة مبتكرة وخالية تماما من الزينوجينيا لعزل الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون وتوسيعها في المختبر دون تغيير خصائصها مقارنة بالبروتوكولات القياسية المستزرعة بالكولاجيناز FBS. هنا ، تم عزل الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون (hASCs) من الأنسجة الدهنية البطنية. تم فرم العينة ميكانيكيا بمقص / مشرط ، وتم تشريحها بدقة وتشتيتها ميكانيكيا في طبق بتري 10 سم ، وتحضيرها بشقوق مشرط لتسهيل ربط شظايا الأنسجة وهجرة hASCs. بعد خطوات الغسيل ، تم اختيار hASCs بسبب التصاق البلاستيك دون هضم إنزيمي. تم استزراع hASCs المعزولة بوسط مكمل بمحلول الصفائح الدموية البشري الخالي من الهيبارين بنسبة 5٪ وفصله ببديل التربسين الخالي من الحيوانات. باتباع توجيهات ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) بشأن إنتاج منتجات الخلايا المخصصة للعلاج البشري ، لم يتم استخدام أي مضادات حيوية في أي وسائط ثقافية.
Introduction
في العقود الماضية ، أدى الطلب المتزايد على العلاجات العلاجية المبتكرة إلى بذل جهود كبيرة واستثمار الموارد في مجال الطب الانتقالي1. ترتبط المنتجات القائمة على الخلايا بالمخاطر التي يحددها مصدر الخلية ، وعملية التصنيع (العزل ، أو التوسع ، أو التعديل الوراثي) ، والمكملات غير الخلوية (الإنزيمات ، وعوامل النمو ، ومكملات الثقافة ، والمضادات الحيوية) ، وتعتمد عوامل الخطر هذه على المؤشر العلاجي المحدد. يمكن أن تتأثر جودة وسلامة وفعالية المنتج النهائي بعمق بالعناصر المشار إليها أعلاه2. يتطلب العلاج بالخلايا الجذعية الالتزام بمبادئ السلامة البيولوجية. يمكن أن تكون المخاطر المحتملة لانتقال مسببات الأمراض مع المنتجات المشتقة من الحيوانات في زراعة الخلايا مشكلة ، والاختبار الشامل لأي منتج يتم إدخاله في التصنيع ضروري3.
تتضمن الطريقة التقليدية لعزل الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون (hASCs) عملية هضم إنزيمية يتم إجراؤها باستخدام كولاجيناز تليها خطوات غسيل من خلال الطرد المركزي4. في حين أن العزل الأنزيمي يعتبر عموما أكثر كفاءة من التقنيات الميكانيكية الأخرى من حيث غلة الخلايا وصلاحيتها ، فإن المكونات المشتقة من الحيوانات المستخدمة ، مثل الكولاجين ، تعتبر أكثر من الحد الأدنى من التلاعب بها من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية. هذا يعني أن هناك خطرا متزايدا بشكل كبير من ردود الفعل المناعية أو انتقال المرض ، مما يحد من ترجمة علاج hASC إلى الإعدادات السريرية 5,6.
الهضم القائم على التربسين هو بروتوكول إنزيمي آخر لعزل ASCs. تم وصف تقنيات مختلفة مع تعديلات طفيفة من حيث تركيز التربسين وسرعة الطرد المركزي ووقت الحضانة. لسوء الحظ ، لم يتم وصف هذه الطريقة بشكل جيد ، ويوجد نقص في المقارنة في الأدبيات ، لا سيما مع بروتوكولات العزل الميكانيكية7. ومع ذلك ، من حيث قابلية ترجمة النهج ، فإن التربسين له نفس عيوب الكولاجيناز.
تتضمن طرق العزل البديلة للحصول على ASCs ، بناء على القوى الميكانيكية وبدون إضافة إنزيم ، الطرد المركزي عالي السرعة (800 × جم أو 1280 × جم ، 15 دقيقة) لشظايا الأنسجة الدهنية. بعد ذلك ، يتم تحضين الحبيبات بمخزن مؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (5 دقائق) ، تليها خطوة طرد مركزي أخرى عند 600 × جم قبل إعادة التعليق في وسط الاستزراع. على الرغم من وجود عدد أكبر من الخلايا التي تم عزلها في الأيام الأولى مقارنة بطرق الزرع ، أظهرت دراسة سابقة انتشارا أقل أو غائبا بعد الأسبوع الثاني من الثقافة8.
إلى جانب ذلك ، يرتبط المزيد من التلاعب بالوسط المضاف xenogenec ، مثل مصل الأبقار الجنيني (FBS) ، والذي يستخدم كمكمل لعامل النمو لزراعة الخلايا ، بزيادة خطر التفاعل المناعي والتعرض للعدوى الفيروسية أو البكتيرية أو البريون للمريض المضيف 9,10. تم بالفعل وصف ردود الفعل المناعية وتطور الطفح الجلدي الشروي في الأفراد الذين يتلقون عدة جرعات من الخلايا الجذعية الوسيطة المنتجة باستخدام FBS11. علاوة على ذلك، تخضع FBS لتقلبات من دفعة إلى أخرى، والتي يمكن أن يكون لها تأثير على جودة المنتج النهائي12.
وفقا لإرشادات ممارسات التصنيع الجيدة (GMP) ، يجب تجنب تفكك الأنسجة الأنزيمية ، ويجب استبدال FBS بمكملات خالية من الجينات. هذه الخطوات ، جنبا إلى جنب مع بروتوكولات أكثر موثوقية وقابلة للتكرار ، ضرورية لدعم تطبيق العلاج الخلوي 3,13.
في هذا السياق ، تم اقتراح تحلل الصفائح الدموية البشرية (hPL) كبديل ل FBS لأنه مكمل خال من الخلايا ويحتوي على البروتين وغني بعامل النمو ، وقد تم تقديمه سابقا بين المنتجات القائمة على الخلايا السريرية كمادة مضافة لوسط النمو لزراعة الخلايا في المختبر والتوسع14,15. نظرا لأن hPL منتج مشتق من الإنسان ، فإنه يستخدم بشكل متكرر كبديل ل FBS أثناء الثقافة المختبرية ل hASCs المخصصة للتطبيقات السريرية ، وبالتالي تقليل المشكلات المتعلقة بالتفاعلات المناعية والالتهابات المتعلقة بقابلية ترجمة FBS15,16.
على الرغم من ارتفاع تكاليف الإنتاج ، فقد ثبت بالفعل أنه بالمقارنة مع FBS ، فإن hPL يدعم صلاحية الخلية للعديد من أنواع الخلايا ، ويزيد من الانتشار ، ويؤخر الشيخوخة ، ويضمن الاستقرار الجيني ، ويحافظ على النمط المناعي الخلوي حتى في ممرات الخلايا المتأخرة. كل هذه العناصر تدعم التحول نحو ملحق الثقافةهذا 11.
كان الهدف من هذا العمل هو تطوير بروتوكول موحد لعزل وزراعة hASCs بطريقة كاملة خالية من الحيوانات ، دون تعديل فسيولوجيا الخلية وخصائص الجذعية مقارنة ب hASCs التقليدية المستزرعة FBS (الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم عزل hASCs من الأنسجة الدهنية البطنية لامرأة سليمة خضعت لإعادة بناء الثدي باستخدام اللوحات الذاتية البطنية (اللوحات المثقوبة الشرسوفية السفلية العميقة ، [DIEP]) في مستشفى جامعة لوزان ، CHUV ، لوزان ، سويسرا. تم الحصول على الجزء المهمل من السديلة والأنسجة الدهنية بعد توقيع المريض على الموافقة المستنيرة. تمت مراجعة جميع البروتوكولات والموافقة عليها من قبل قسم البنك الحيوي بالمستشفى DAL (رقم 314 GGC) ولجان الأخلاقيات وفقا لإعلان هلسنكي.
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء التدفق الصفحي ومع ظروف معقمة. يجب دائما ارتداء القفازات ومعاطف المختبر للحماية الشخصية ، ويجب غسل جميع الأسطح بالمبيدات الحيوية المناسبة. يجب التخلص من الأنسجة الزائدة بشكل صحيح كنفايات طبية حيوية.
1. المواد اللازمة وإعداد حلول الثقافة
- لعزل الخلايا وتوسيعها وحفظها بالتبريد ، احصل على الأدوات التالية: مقص معقم مشارط معقمة ملاقط معقمة طبق بتري 10 سم ؛ أنابيب 15 مل قوارير T25 غرفة بوركر كريوفيال. حاوية تجميد الخلية ؛ مجهر بصري بأهداف تكبير 4x و 10x ؛ وأجهزة طرد مركزي دلو متأرجحة.
- للتنميط المناعي ، احصل على الأدوات والكواشف التالية: أنابيب FACS ، محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ؛ الحد الأدنى من الوسط الأساسي لشركة Dulbecco (DMEM) ؛ hPL. ثنائي ميثيل كبريتيد والتربسين الخالي من الحيوانات.
- قم بإعداد وسط الاستزراع الكامل عن طريق استكمال DMEM ب 5٪ hPL خال من الهيبارين. قم بتخزين الوسط على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع ، واستخدمه دائما دافئا (بين درجة حرارة الغرفة و 37 درجة مئوية). باتباع إرشادات GMP لإنتاج الأدوية الخلوية المخصصة للعلاج البشري ، لا تضيف أي مضادات حيوية إلى وسط الثقافة.
- تحضير وسط تجميد يحتوي على 20٪ hPL و 10٪ ثنائي ميثيل كبريتيد في DMEM.
2. عزل hASCs من عينة الأنسجة الدهنية
- معالجة عينة الأنسجة الدهنية في غضون 6 ساعات من الحصول عليها. قبل الشروع في طريقة العزل الميكانيكية الخالية من الزينة ، اغسل المنديل 2x باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق حتى يتم إطلاق النسيج الضام والدم.
- قم بتخزين عينة الأنسجة الدهنية التي تم الحصول عليها من جراحة تجميل البطن في PBS عند 4 درجات مئوية حتى المعالجة ، وعلى أي حال ، لا تزيد عن 24 ساعة ، حتى لا تتلف صلاحية hASC.
- قطع الأنسجة الدهنية إلى قطع أصغر من حوالي 1 سم2 مع مقص معقم.
- باستخدام مشرط ، قم بتشريح كل قطعة إلى أجزاء صغيرة بأقطار <5 مم ، وتفريق خمسة منها في طبق بتري 10 سم (الشكل 2 أ).
- من أجل إرفاق كل جزء ، استخدم المشرط لإنشاء شقوق على السطح البلاستيكي ، واسحب كل جزء حتى يلتصق بقوة بطبق بتري. استخدم الملقط للمساعدة في التعامل مع الجزء (الشكل 2 ب).
- أضف برفق 10 مل من وسط الاستزراع الكامل لتغطية جميع الأجزاء دون فصلها.
- احتضان أطباق بتري في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. سوف تهاجر hASCs من الأنسجة ويتم اختيارها بسبب التصاق البلاستيك دون الهضم الأنزيمي.
- حتى التقاء الخلية ، راقب تمدد hASC تحت المجهر الضوئي عند تكبير 4x مرة واحدة في اليوم. عندما تبدأ hASCs في الخروج من الأنسجة ، فإنها تظهر كمجموعات صغيرة حول قطع الأنسجة مع مورفولوجيا نموذجية تشبه الخلايا الليفية. يتم اختيار hASCs نظرا لقدرتها على الالتصاق بالسطح البلاستيكي. كل 72 ساعة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط ، واستبدله بوسط كامل جديد لإزالة بقايا الخلايا.
- اترك شظايا الأنسجة في مكانها حتى مرور الخلايا الأول ، والذي عادة ما يكون بعد 7 أيام.
3. ثقافة hASC بعد مرحلة العزل
- عندما تصل ثقافة hASC إلى التقاء 70٪ -80٪ ، تكون hASCs جاهزة للفصل والتوسع بشكل أكبر لاستخدامها إما في تجارب أخرى أو تخزين طويل الأجل.
- باستخدام ملاقط معقمة ، قم بإزالة وتجاهل جميع قطع الأنسجة من طبق بتري. قم بإزالة الوسط المنهك والتخلص منه ، مع الحرص على عدم لمس hASCs حتى لا يتم فصلها.
- اغسل الخلايا بعناية مرة واحدة باستخدام 10 مل من برنامج تلفزيوني. أضف 1 مل من 1x تربسين خال من الحيوانات ، واترك طبق بتري في الحاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تحقق تحت المجهر الضوئي عند تكبير 4x إذا كانت جميع الخلايا قد انفصلت ؛ خلاف ذلك ، اترك طبق بتري لمدة 2 دقيقة إضافية في الحاضنة ، وفي النهاية اضغط برفق على السطح البلاستيكي لدعم انفصال الخلايا.
- أوقف عمل التربسين بإضافة 2 مل من الوسط الكامل ، واجمع كل الخلايا في أنبوب سعة 15 مل.
- من أجل إزالة أي تربسين متبقي ، قم بطرد الأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وقم بتعليق الخلايا ب 5 مل من الوسط الكامل ، وانقل تعليق الخلية إلى قارورة T25 جديدة. احتفظ ب hASCs في الثقافة ، وقم بتوسيعها لحين الحاجة.
4. فحص النمط المناعي عن طريق قياس التدفق الخلوي
- عندما تصل ثقافة hASC إلى التقاء 70٪ -80٪ ، افصل hASCs كما هو موضح سابقا في القسم 3.
- بعد جمع الخلايا ، قم بتعليقها في 1 مل من الوسط الكامل ، واحسب حصة مع عداد الخلية تحت المجهر الضوئي عند تكبير 10x.
- أجهزة الطرد المركزي hASCs عند 300 × g لمدة 5 دقائق ، وتعليقها عند 1 × 106 خلايا / مل من المخزن المؤقت FACS. نقل 100 ميكرولتر من المعلق الذي يحتوي على 1 × 105 خلايا في أنبوب FACS واحد. استخدم أنبوب FACS واحدا لكل مستضد تم فحصه ، بالإضافة إلى أنبوب آخر لكل عنصر تحكم متماثل النمط.
- تلطيخ الخلايا ب 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة التالية المخففة في المخزن المؤقت FACS: مضاد CD73 (1: 1000 ، IgG1 ، المسمى FITC) ، مضاد CD105 (1: 200 ، IgG1 ، PE المسمى) ؛ مكافحة CD34 (1:66 ، IgG1 ، المسمى FITC) ؛ مكافحة CD45 (1:66 ، IgG1 ، المسمى FITC) ؛ وعناصر التحكم متساوية النمط لكل فلوروفور ، المسمى IgG1 FITC (1: 1,000) والمسمى IgG1 PE (1:50).
- احتضان العينات لمدة 1 ساعة في الظلام مع التحريك عند 4 درجات مئوية. قم بطرد الأنابيب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وقم بتعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
- قم بتقييم النمط المناعي للخلية باستخدام أداة قياس التدفق الخلوي ، وتسجيل 50000 حدث لكل أنبوب داخل البوابة المختارة لاستبعاد حطام الخلية. احسب النسبة المئوية للتعبير عن الخلايا كفرق عن عنصر التحكم المتماثل المحدد.
5. مقايسة انتشار hASC
- عندما تصل ثقافة hASC إلى التقاء 70٪ -80٪ ، افصل hASCs كما هو موضح في القسم 3.
- بعد جمع الخلايا ، قم بتعليقها في 1 مل من الوسط الكامل ، واحسب حصة مع عداد الخلية تحت المجهر الضوئي عند تكبير 10x.
- بذرة 5 × 102 hASCs في 200 ميكرولتر من الوسط الكامل في 96 لوحة شفافة جيدا. زرع الخلايا في النسخ المتماثلة التقنية ، مع بئر واحد لكل نقطة زمنية.
- في 3 أيام بعد البذر ، ابدأ في اكتشاف تكاثر الخلايا باستخدام مجموعة فحص الانتشار باتباع تعليمات الشركة المصنعة. باختصار ، استبدل وسط الاستزراع ب 100 ميكرولتر من الوسط الطازج مضافا إلى 20 ميكرولتر من كاشف الفحص لكل بئر. احتضان hASCs لمدة 2.5 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لتطوير الكاشف ، ثم اكتشف الامتصاص عند 490 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
- عبر عن انتشار hASC كنسبة امتصاص بعد إزالة الامتصاص الفارغ.
6. الحفظ بالتبريد وتخزين hASCs
- افصل الخلايا كما هو موضح في القسم 3 ، واحسب حصة مع عداد الخلية تحت المجهر الضوئي عند تكبير 10x.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 × غرام لمدة 5 دقائق ، والتخلص من المواد الطافية. قم بتعليق الخلايا بمزيج التجميد بكثافة 1 × 106 hASCs / mL ، وانقل 1 مل من محلول الخلية إلى cryovial واحد.
- ضع الكريوفيالات عند -80 درجة مئوية في وعاء تجميد يقلل درجة الحرارة بمقدار 1 درجة مئوية / دقيقة ، ثم انقل المبردات إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بتطبيق طريقة العزل المفصلة أعلاه ، تم الحصول على hASCs بنجاح من عينات الأنسجة الدهنية البطنية دون استخدام كولاجيناز. علاوة على ذلك ، تم توسيع hASCs في ظروف خالية تماما من xenogenec في وجود hPL وبدون أي مكونات أخرى من أصل حيواني. النتائج التالية تدعم البروتوكول ويتم الحصول عليها من hASCs المستزرعة بالتوازي مع hPL ومع FBS كشرط تحكم.
بعد ظهور العنقود الأولي ، أظهرت hASCs الشكل الكلاسيكي الشبيه بالمغزل وكانت أصغر حجما وأكثر استطالة مقارنة بخلايا التحكم في وجود FBS (الشكل 3). يبدو أن النمط المناعي للخلية الذي تم تقييمه بواسطة قياس التدفق الخلوي متشابه بين hASCs المزروعة مع المكملين. على وجه الخصوص ، كان أكثر من 80٪ -90٪ من hASCs إيجابيا ل CD73 17 و CD10517 ، وأقل من 5٪ عبر عن CD34 17 و CD4517 (الشكل 4). أخيرا ، كشف فحص الانتشار عن زيادة كبيرة في نمو الخلايا عند إضافة hPL إلى الوسط مقارنة بعنصر تحكم FBS (الشكل 5).
الشكل 1: ملخص بياني للبروتوكول. طريقة خالية من Xenogeneic لعزل وتوسيع الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون في المختبر . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: عملية قطع وبذر الأنسجة الدهنية للحصول على hASCs في الثقافة المختبرية . أ: التشريح المجهري للأنسجة الدهنية إلى شظايا بأقطار <5 مم وتشتت الشظايا في طبق بتري طوله 10 سم. (ب) التعلق بطبق بتري بعد عمل شقوق على السطح البلاستيكي بمشرط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مورفولوجيا hASCs. أظهرت hASCs المستزرعة في حالة خالية من الجينات الأجنبية شكلا يشبه المغزل ومورفولوجيا ممدودة. كانت hASCs المستزرعة في وجود FBS كعنصر تحكم أكبر ولها شكل بولسي. يمثل شريط المقياس 100 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: النمط المناعي ل hASCs. كان النمط المناعي ل hASCs مشابها في وجود hPL و FBS. على وجه الخصوص ، يمكن اعتبار hASCs في كلتا الحالتين إيجابية ل CD73 و CD105 وسلبية ل CD34 و CD45. تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ القياسي (n = 3). الاختصارات: hPL = تحلل الصفائح الدموية البشرية. FBS = مصل الجنين البقري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: انتشار hASC. توسعت hASCs في ظروف خالية من الأجانب تكاثرت بشكل ملحوظ أكثر من تلك الموجودة في وجود FBS. ** p < 0.01 (تم تقييم الأهمية باستخدام اختبار t للطالب ، n = 3). يمثل المحور السيني الوقت من حيث عدد الأيام بعد البذر. الاختصارات: hPL = تحلل الصفائح الدموية البشرية. FBS = مصل الجنين البقري ؛ hASCs = الخلايا الجذعية البشرية المشتقة من الدهون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جذبت الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون اهتمام الأبحاث الانتقالية في العقد الماضي بسبب وفرتها ، وطرق عزلها السريعة وبأسعار معقولة ، وارتفاع معدل الانتشار في المختبر / في الجسم الحي ، وخصائص الجذعية / التمايز18،19،20. نتيجة لذلك ، تعتبر hASCs مرشحا ممتازا للاستراتيجيات القائمة على الخلايا في الطب التجديدي21. بعد العزل عن الأنسجة الدهنية ، تتطلب hASCs التوسع في المختبر ، وفي بعض الحالات ، يجب أن تخضع لخطوة تمايز قبل استخدامها لتطبيق علاجي معين. يجب إجراء العملية برمتها ، بما في ذلك العزل ، والتوسع في المختبر ، والتمايز النهائي ، وفقا لإرشادات GMP لتقليل أي مخاطر من منظور الترجمة22,23.
فيما يتعلق بعملية العزل ، في حين أن خطوات الهضم والطرد المركزي الأنزيمية تنتج بسرعة عددا كبيرا من hASCs في وقت قصير نسبيا ، فقد أظهرت التقارير السابقة أن هذه الطرق تسبب تغيرات محتملة في النمط الظاهري للخلايا من حيث علامات التمايز العنقودي مقارنة بطرق العزل الميكانيكية الأخرى ، مما يثير تساؤلات حول السلامة الحيوية وخصائص الخلية والقضايا السلوكية عند تطبيق هذه hASCs مع المرضى من البشر3 . علاوة على ذلك ، لتقليل المخاطر المتعلقة بالمكونات الأجنبية ، اقترحت الدراسات الحديثة استخدام الإنزيمات الاصطناعية أو الطرق الميكانيكية لعزل hASCs. ومع ذلك ، حتى الإنزيمات الاصطناعية قد تعدل ملف تعريف الخلية وتؤثر على جودة المنتج24. على العكس من ذلك ، قد تكون الطريقة القائمة على الزرع التي تم التحقيق فيها هنا بديلا صالحا للأغراض الانتقالية ، حيث تهاجر hASCs من الأنسجة وتلتصق بالأسطح البلاستيكية بشكل طبيعي ، دون استخدام أي كواشف أجنبيةالمنشأ 9. في الوقت نفسه ، يجب اعتبار أن هذه الطريقة أظهرت انخفاض إنتاجية الخلايا مقارنة بعزل الكولاجينالكلاسيكي 25.
فيما يتعلق بالوسيط المكمل ، استنادا إلى الأدبيات الحديثة ، التي توافق على أن hPL يدعم توسع hASC بدرجة أعلى من FBS دون تغيير الخصائص الفسيولوجية hASC 26،27،28،29 ، استبدلنا الوسيط التقليدي المضاف FBS ب hPL 16. من خلال دعم زراعة الخلايا باستخدام hPL ، تغلبنا على انخفاض غلة الخلايا والتعافي البطيء المتعلق بالعزلة الميكانيكية. انتشرت هذه hASCs الأقل تلاعبا في المختبر بمعدل يسمح بالتوسع المطلوب للوصول إلى الأحجام ذات الصلة سريريا بطريقة فعالة وآمنة30,31. علاوة على ذلك ، فإن الثقافة مع hPL لم تغير السمات الشبيهة بالساق والنمط المناعي النموذجي ل hASCs ، مما يعني الحفاظ على الاهتمام العلاجي لهذه الخلايا.
على حد علمنا ، في حين تم وصف مجموعة متنوعة من بروتوكولات عزل الزرع ل ASCs ، فإن طريقتنا هي أول دمج بين العزل الميكانيكي الخالي من الجينيات الأجنبية ل ASCs مع الثقافة المتوسطة المكملة ب hPL للحصول على مجموعة خلايا قيمة للتطبيقات الانتقالية.
إلى جانب ذلك ، فإن الطريقة الموضحة في هذا العمل لها بعض الجوانب الحاسمة التي تحتاج إلى مزيد من التفصيل. أولا ، يجب ألا تتجاوز أقطار شظايا الأنسجة الدهنية المفرومة 5 مم لتسهيل التصاقها بالسطح البلاستيكي والسماح بهجرة hASCs خارج الأنسجة. ثانيا ، يجب موازنة وجود شظايا الأنسجة الدهنية في الثقافة مع hASCs المرفقة بالفعل باللوحة ، مع مراعاة مخاطر التلوث والحاجة إلى عدد كاف من الخلايا المهاجرة. ثالثا ، يجب أن يكون الباحثون على دراية بمعدل نمو منخفض محتمل في أول 24 ساعة بعد البذر ؛ بعد هذه الفترة الزمنية، تحفز مكملات HPL استعادة الخلايا وتكاثرها مقارنة ب FBS30 الكلاسيكي.
في الوقت الحالي ، لم يتم إدخال أي خطوات أو تعديلات أخرى مقارنة بالبروتوكول الأصلي الموصوف أعلاه.
في الختام ، توفر الطريقة الكاملة الخالية من xenogeneic الموصوفة هنا طريقة بسيطة لعزل hASCs من الأنسجة الدهنية ، بما في ذلك كل من شفط الدهون والأنسجة الدهنية البطنية ، في غياب المنتجات المشتقة من الحيوانات أو الإنزيمات الكيميائية أو خطوات الطرد المركزي. علاوة على ذلك ، فإن الوسط المكمل ب hPL يوازن العائد المنخفض للخلية الأولية الناتج ويعزز تكاثر الخلايا مع الحفاظ على الخصائص العلاجية ل hASCs دون تغيير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ليس لدى المؤلفين أي اعترافات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
References
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
