Summary
Xenogene (chemische of dierlijke afgeleide) producten die worden geïntroduceerd in de voorbereidings-/manipulatiestappen voor celtherapie zijn geassocieerd met een verhoogd risico op immuunreactiviteit en pathogene overdracht bij gastheerpatiënten. Hier wordt een volledig xenogeneïsche vrije methode beschreven voor de isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen.
Abstract
Gezien de toenemende impact van stamceltherapie zijn er zorgen geuit over de bioveiligheid met betrekking tot mogelijke besmetting of infectieoverdracht als gevolg van de introductie van dierlijke producten tijdens in vitro manipulatie. De xenogene componenten, zoals collagenase of foetaal runderserum, die vaak worden gebruikt tijdens de celisolatie en expansiestappen, kunnen worden geassocieerd met de potentiële risico's van immuunreactiviteit of virale, bacteriële en prioninfectie bij de ontvangende patiënten. Volgens de richtlijnen voor goede productiepraktijken moet dissociatie van chemisch weefsel worden vermeden, terwijl foetaal runderserum (FBS) kan worden vervangen door xenogene-vrije supplementen. Om de veiligheid van celproducten te waarborgen, is bovendien de definitie van betrouwbaardere en reproduceerbare methoden belangrijk. We hebben een innovatieve, volledig xenogeneïsche vrije methode ontwikkeld voor de isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen zonder hun eigenschappen te veranderen in vergelijking met collagenase FBS-gekweekte standaardprotocollen. Hier werden menselijke vet-afgeleide stamcellen (hASCs) geïsoleerd uit abdominaal vetweefsel. Het monster werd mechanisch gehakt met een schaar / een scalpel, micro-ontleed en mechanisch gedispergeerd in een petrischaal van 10 cm, en bereid met scalpelincisies om de aanhechting van de weefselfragmenten en de migratie van hASCs te vergemakkelijken. Na de wasstappen werden hASC's geselecteerd vanwege hun plastische hechting zonder enzymatische vertering. De geïsoleerde hASCs werden gekweekt met medium aangevuld met 5% heparinevrij humaan bloedplaatjeslysaat en losgemaakt met een diervrij trypsinesubstituut. Volgens de aanwijzingen voor goede productiepraktijken (GMP) voor de productie van celproducten die bedoeld zijn voor menselijke therapie, werden in geen enkel kweekmedium antibiotica gebruikt.
Introduction
In de afgelopen decennia heeft de toenemende vraag naar innovatieve therapeutische behandelingen geleid tot aanzienlijke inspanningen en investeringen in middelen op het gebied van translationele geneeskunde1. Celgebaseerde producten worden geassocieerd met risico's die worden bepaald door de celbron, het productieproces (isolatie, expansie of genetische modificatie) en de niet-cellulaire supplementen (enzymen, groeifactoren, kweeksupplementen en antibiotica), en deze risicofactoren zijn afhankelijk van de specifieke therapeutische indicatie. De kwaliteit, veiligheid en werkzaamheid van het eindproduct kunnen sterk worden beïnvloed door de hierboven aangegeven elementen2. Stamceltherapie vereist naleving van bioveiligheidsprincipes; De potentiële risico's van pathogene overdracht met dierlijke producten in celkweek kunnen problematisch zijn, en het grondig testen van elk product dat bij de productie wordt geïntroduceerd, is essentieel3.
De traditionele methode om menselijke vet-afgeleide stamcellen (hASCs) te isoleren, omvat een enzymatische vertering uitgevoerd met collagenase gevolgd door wasstappen door centrifugatie4. Hoewel enzymatische isolatie over het algemeen als efficiënter wordt beschouwd dan andere mechanische technieken in termen van celopbrengst en levensvatbaarheid, worden de gebruikte dierlijke componenten, zoals collagenase, beschouwd als meer dan minimaal gemanipuleerd door de Amerikaanse Food and Drug Administration. Dit betekent dat er een significant verhoogd risico is op immuunreacties of ziekteoverdracht, waardoor de vertaling van hASC-therapie naar klinische settingswordt beperkt 5,6.
Op trypsine gebaseerde spijsvertering is een ander enzymatisch protocol om ASC's te isoleren. Verschillende technieken zijn beschreven met kleine wijzigingen in termen van de trypsineconcentratie, centrifugatiesnelheid en incubatietijd. Helaas is deze methode niet goed beschreven en bestaat er een gebrek aan vergelijking in de literatuur, met name met de mechanische isolatieprotocollen7. In termen van de vertaalbaarheid van de aanpak heeft trypsine echter dezelfde nadelen van collagenase.
Alternatieve isolatiemethoden om ASC's te verkrijgen, gebaseerd op mechanische krachten en zonder enzymtoevoeging, omvatten snelle centrifugatie (800 x g of 1.280 x g, 15 min) van de vetweefselfragmenten. Vervolgens wordt de pellet geïncubeerd met een rode bloedcellysisbuffer (5 min), gevolgd door een andere centrifugatiestap bij 600 x g voordat deze in kweekmedium wordt geresuspenseerd. Ondanks dat een groter aantal cellen in de eerste dagen werd geïsoleerd in vergelijking met de explantatiemethoden, toonde een eerdere studie een lagere of afwezige proliferatie na de tweede week van cultuur8.
Daarnaast is verdere manipulatie met xenogeen toegevoegd medium, zoals foetaal runderserum (FBS), dat wordt gebruikt als groeifactorsupplement voor celkweek, geassocieerd met een verhoogd risico op immuunreactiviteit en blootstelling aan virale, bacteriële of prioninfecties van de gastheerpatiënt 9,10. Immuunreacties en de ontwikkeling van urticariforme huiduitslag zijn al beschreven bij personen die verschillende doses mesenchymale stamcellen kregen die werden geproduceerd met FBS11. Bovendien is FBS onderhevig aan batch-to-batch variabiliteit, wat van invloed kan zijn op de uiteindelijke productkwaliteit12.
In overeenstemming met de richtlijnen voor goede productiepraktijken (GMP) moet enzymatische weefseldissociatie worden vermeden en moet FBS worden vervangen door xenogene-vrije supplementen. Deze stappen, samen met betrouwbaardere en reproduceerbare protocollen, zijn essentieel om de toepassing van celtherapiete ondersteunen 3,13.
In deze context is humaan bloedplaatjeslysaat (hPL) voorgesteld als een substituut voor FBS, omdat het een celvrij, eiwitbevattend, met groeifactor verrijkt supplement is, en het werd eerder geïntroduceerd onder op klinische kwaliteit op cellen gebaseerde producten als een additief van groeimedium voor in vitro celkweek en expansie14,15. Aangezien hPL een van de mens afgeleid product is, wordt het vaak gebruikt als vervanging voor FBS tijdens de in vitro kweek van hASCs bedoeld voor klinische toepassingen, waardoor problemen met immunologische reacties en infecties gerelateerd aan FBS-vertaalbaarheid worden verminderd15,16.
Ondanks de hogere productiekosten is al aangetoond dat hPL in vergelijking met FBS de levensvatbaarheid van cellen voor veel celtypen ondersteunt, de proliferatie verhoogt, de senescentie vertraagt, genomische stabiliteit garandeert en het cellulaire immunofenotype behoudt, zelfs in late celpassages; Al deze elementen ondersteunen de omschakeling naar dit cultuursupplement11.
Het doel van dit werk was om een gestandaardiseerd protocol te ontwikkelen om hASCs te isoleren en te kweken met een volledige diervrije methode, zonder de celfysiologie en stamheidseigenschappen te wijzigen in vergelijking met klassieke FBS-gekweekte hASCs (figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
hASCs werden geïsoleerd uit het buikvetweefsel van een gezonde vrouw die een borstreconstructie onderging met behulp van abdominale autologe flappen (diepe inferieure epigastrische perforatorflappen, [DIEP]) in het Universitair Ziekenhuis van Lausanne, CHUV, Lausanne, Zwitserland. Het weggegooide deel van de flap en het vetweefsel werd verkregen nadat de patiënt geïnformeerde toestemming had ondertekend. Alle protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Biobank afdeling DAL (nummer 314 GGC) van het ziekenhuis en ethische commissies in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.
OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder een laminaire stromingskap en met aseptische omstandigheden. Handschoenen en laboratoriumjassen voor persoonlijke bescherming moeten altijd worden gedragen en alle oppervlakken moeten worden gewassen met geschikte biociden. Overtollig weefsel moet op de juiste manier worden afgevoerd als biomedisch afval.
1. Benodigde materialen en voorbereiding van de kweekoplossingen
- Voor celisolatie, expansie en cryopreservatie kunt u de volgende instrumenten aanschaffen: steriele schaar; steriele scalpels; steriel pincet; een petrischaal van 10 cm; 15 ml buizen; T25-kolven; een Burker-kamer; cryovialen; een celvriescontainer; een optische microscoop met 4x en 10x vergrotingsobjectieven; en een draaiende emmercentrifuge.
- Verkrijg voor immunofenotypering de volgende instrumenten en reagentia: FACS-buizen, steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS); Dulbecco's minimal essential medium (DMEM); hPL; dimethylsulfide; en diervrij trypsine.
- Bereid het volledige kweekmedium door DMEM aan te vullen met 5% heparinevrij hPL. Bewaar het medium bij 4 °C gedurende maximaal 3 weken en gebruik het altijd warm (tussen kamertemperatuur en 37 °C). Volg de GMP-richtlijnen voor de productie van celgeneesmiddelen die bedoeld zijn voor menselijke therapie en voeg geen antibiotica toe aan het kweekmedium.
- Bereid vriesmedium met 20% hPL en 10% dimethylsulfide in DMEM.
2. Isolatie van hASCs uit het vetweefselmonster
- Verwerk het vetweefselmonster binnen 6 uur na het verkrijgen ervan. Voordat u overgaat tot de gevestigde mechanische xenogeneïsche isolatiemethode, wast u het weefsel 2x met PBS gedurende 10 minuten totdat bindweefsel en bloed vrijkomen.
- Bewaar het verkregen vetweefselmonster van abdominoplastische chirurgie in PBS bij 4 ° C tot de verwerking en in elk geval niet langer dan 24 uur, om de levensvatbaarheid van hASC niet te beschadigen.
- Knip het vetweefsel met een steriele schaar in kleinere stukjes van ongeveer 1 cm2 .
- Met een scalpel micro-ontleed elk stuk in kleine fragmenten met een diameter <5 mm en dispreid er vijf in een petrischaal van 10 cm (figuur 2A).
- Om elk fragment te bevestigen, gebruikt u het scalpel om incisies op het plastic oppervlak te maken en sleept u elk fragment totdat het stevig aan de petrischaal is vastgeplakt. Gebruik een pincet om het fragment te helpen hanteren (figuur 2B).
- Voeg voorzichtig 10 ml volledig kweekmedium toe om alle fragmenten te bedekken zonder ze los te maken.
- Incubeer de petrischaaltjes bij 37 °C en 5% CO2. De hASCs migreren uit het weefsel en worden geselecteerd vanwege hun plastische hechting zonder enzymatische spijsvertering.
- Tot de celsamenvloeiing controleert u de hASC-expansie onder een optische microscoop met 4x vergroting eenmaal per dag. Naarmate de hASCs uit het weefsel beginnen te komen, verschijnen ze als kleine clusters rond de weefselstukken met een typische fibroblastachtige morfologie. De hASCs worden geselecteerd vanwege hun vermogen om zich aan het plastic oppervlak te hechten. Verwijder elke 72 uur zoveel mogelijk medium en vervang het door vers compleet medium om celresten te verwijderen.
- Laat de fragmenten van weefsel op hun plaats tot de eerste passage van cellen, die meestal na 7 dagen is.
3. hASC-cultuur na de isolatiefase
- Wanneer de hASC-cultuur 70% -80% confluentie bereikt, zijn de hASCs klaar om te worden losgemaakt en verder uitgebreid om te worden gebruikt voor andere experimenten of langdurige opslag.
- Verwijder met een steriel pincet alle stukjes weefsel uit de petrischaal en gooi ze weg. Verwijder en gooi het uitgeputte medium weg, waarbij u voorzichtig bent de hASC's niet aan te raken om ze niet los te maken.
- Was de cellen voorzichtig eenmaal met 10 ml PBS. Voeg 1 ml 1x diervrij trypsine toe en laat de petrischaal 5 minuten in de couveuse bij 37 °C staan.
- Controleer onder een optische microscoop bij 4x vergroting of alle cellen zijn losgekomen; laat anders de petrischaal nog eens 2 minuten in de couveuse staan en tik uiteindelijk voorzichtig op het plastic oppervlak om celloslating te ondersteunen.
- Stop de trypsine-actie door 2 ml volledig medium toe te voegen en verzamel alle cellen in een buis van 15 ml.
- Om eventuele resterende trypsine te verwijderen, centrifugeert u de buis gedurende 5 minuten op 300 x g . Gooi het supernatant weg, suspensie van de cellen met 5 ml volledig medium en breng de celsuspensie over in een nieuwe T25-kolf. Houd de hASCs in cultuur en breid ze uit totdat ze nodig zijn.
4. Immunofenotypeonderzoek door flowcytometrie
- Wanneer de hASC-cultuur 70%-80% confluentie bereikt, maakt u de hASCs los zoals eerder beschreven in rubriek 3.
- Na het verzamelen van de cellen, suspensie ze in 1 ml volledig medium, en tel een aliquot met de cel teller onder een optische microscoop bij 10x vergroting.
- Centrifugeer de hASCs op 300 x g gedurende 5 minuten en suspensie ze op 1 x 106 cellen / ml FACS-buffer. Breng 100 μL van de suspensie met 1 x 105 cellen over in één FACS-buis. Gebruik één FACS-buis voor elk onderzocht antigeen, plus nog een voor elke isotypische controle.
- Kleuring van de cellen met 100 μL van de volgende antilichamen verdund in FACS-buffer: anti-CD73 (1:1.000, IgG1, FITC-gelabeld), anti-CD105 (1:200, IgG1, PE-gelabeld); anti-CD34 (1:66, IgG1, FITC-gelabeld); anti-CD45 (1:66, IgG1, FITC-gelabeld); en isotypische controles voor elke fluorofoor, IgG1 FITC-gelabeld (1:1.000) en IgG1 PE-gelabeld (1:50).
- Incubeer de monsters gedurende 1 uur in het donker met roeren bij 4 °C. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten op 300 x g , gooi het supernatant weg en suspensie de cellen in 500 μL FACS-buffer.
- Beoordeel het celimmunofenotype met een flowcytometrie-instrument, waarbij 50.000 gebeurtenissen worden geregistreerd voor elke buis in de poort die is geselecteerd om celresten uit te sluiten. Bereken het percentage tot expressie brengende cellen als het verschil met de specifieke isotypische controle.
5. Proliferatietest van hASC
- Wanneer de hASC-cultuur 70%-80% confluentie bereikt, maakt u de hASCs los zoals beschreven in rubriek 3.
- Na het verzamelen van de cellen, suspensie ze in 1 ml volledig medium, en tel een aliquot met de cel teller onder een optische microscoop bij 10x vergroting.
- Zaai 5 x 102 hASCs in 200 μL compleet medium in 96-well transparante platen. Zaai de cellen in technische replicaties, met één put voor elk tijdspunt.
- Begin 3 dagen na het zaaien met het detecteren van de celproliferatie met behulp van een proliferatietestkit volgens de instructies van de fabrikant. Kortom, vervang het kweekmedium door 100 μL vers medium toegevoegd aan 20 μL testreagens per putje. Incubeer de hASCs gedurende 2,5 uur bij 37 °C, 5% CO2 voor reagensontwikkeling en detecteer vervolgens de absorptie bij 490 nm met een spectrofotometer.
- Druk de hASC-proliferatie uit als de procentuele absorptie na het verwijderen van de blanco-absorptie.
6. Cryopreservatie en opslag van de hASCs
- Maak de cellen los zoals beschreven in rubriek 3 en tel een aliquot met de celteller onder een optische microscoop bij 10x vergroting.
- Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg. Suspensie van de cellen met vriesmengsel met een dichtheid van 1 x 106 hASCs / ml en breng 1 ml van de celoplossing over in één cryovial.
- Plaats de cryovialen bij −80 °C in een vriescontainer die de temperatuur met 1 °C/min verlaagt en verplaats de cryovialen vervolgens naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door de hierboven beschreven isolatiemethode toe te passen, werden hASCs met succes verkregen uit abdominale vetweefselmonsters zonder het gebruik van collagenase. Bovendien werden de hASCs uitgebreid in volledig xenogene-vrije omstandigheden in aanwezigheid van hPL en zonder andere componenten van dierlijke oorsprong. De volgende resultaten ondersteunen het protocol en worden verkregen uit hASCs die parallel met hPL en met FBS als controlevoorwaarde zijn gekweekt.
Na het eerste clusteroptreden vertoonden de hASC's de klassieke spilachtige vorm en waren ze kleiner en langwerpiger in vergelijking met de controlecellen in aanwezigheid van FBS (figuur 3). Het celimmunofenotype geëvalueerd door flowcytometrie bleek vergelijkbaar te zijn tussen de hASCs gekweekt met de twee supplementen. In het bijzonder was meer dan 80%-90% van de hASCs positief voor CD73 17 en CD105 17, en minder dan 5% drukte CD34 17 en CD45 17 uit (figuur 4). Ten slotte onthulde de proliferatietest een significante toename van de celgroei wanneer hPL aan het medium werd toegevoegd in vergelijking met de FBS-controle (figuur 5).
Figuur 1: Grafische samenvatting van het protocol. Xenogeneïsche methode voor de isolatie en in vitro expansie van menselijke vetstamcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vetweefsel snijden en zaaien proces om hASCs te verkrijgen in in vitro cultuur. (A) Microdissectie van het vetweefsel in fragmenten met een diameter <5 mm en dispersie van de fragmenten in een petrischaal van 10 cm. (B) Bevestiging aan de petrischaal na het maken van incisies op het plastic oppervlak met een scalpel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Morfologie van de hASCs. De hASCs gekweekt in de xenogeneïsche vrije toestand vertoonden een spindelachtige vorm en langwerpige morfologie. De hASC's gekweekt in de aanwezigheid van FBS als controle waren groter en hadden een bullseye vorm. De schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunofenotype van de hASCs. Het immunofenotype van de hASCs was vergelijkbaar in aanwezigheid van hPL en FBS. In het bijzonder kunnen de hASC's in beide omstandigheden als positief worden beschouwd voor CD73 en CD105 en negatief voor CD34 en CD45. De foutbalken geven de standaardfout aan (n = 3). Afkortingen: hPL = menselijk bloedplaatjeslysaat; FBS = foetaal runderserum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: hASC proliferatie. De hASCs breidden zich uit in xenogeneïsche vrije omstandigheden en verspreidden zich aanzienlijk meer dan die in de aanwezigheid van FBS. ** p < 0,01 (significantie geëvalueerd met een Student t-test, n = 3). De x-as vertegenwoordigt de tijd in termen van het aantal dagen na het zaaien. Afkortingen: hPL = menselijk bloedplaatjeslysaat; FBS = foetaal runderserum; hASCs = menselijke van vetweefsel afgeleide stamcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Van vetweefsel afgeleide stamcellen hebben de afgelopen tien jaar de belangstelling van translationeel onderzoek getrokken vanwege hun overvloed, snelle en betaalbare isolatiemethoden, hoge in vitro / in vivo proliferatiesnelheid en stam / differentiatie-eigenschappen18,19,20. Als gevolg hiervan worden hASCs beschouwd als een uitstekende kandidaat voor celgebaseerde strategieën in regeneratieve geneeskunde21. Na isolatie uit vetweefsel vereisen hASCs uitbreiding in vitro en moeten ze in sommige gevallen worden onderworpen aan een differentiatiestap voordat ze worden gebruikt voor een specifieke therapeutische toepassing. Het hele proces, inclusief de isolatie, de in vitro expansie en uiteindelijke differentiatie, moet worden uitgevoerd in overeenstemming met GMP-richtlijnen om eventuele risico's vanuit een vertaalperspectiefte verminderen 22,23.
Met betrekking tot het isolatieproces, terwijl de enzymatische verterings- en centrifugatiestappen snel een groot aantal hASC's in een relatief korte tijd opleveren, hebben eerdere rapporten aangetoond dat deze methoden mogelijke celfenotypische veranderingen veroorzaken in termen van clusterdifferentiatiemarkers in vergelijking met andere mechanische isolatiemethoden, waardoor vragen worden opgeroepen over de bioveiligheid, celeigenschappen en gedragsproblemen bij het toepassen van deze hASCs bij menselijke patiënten3 . Bovendien, om de risico's met betrekking tot xenogene componenten te minimaliseren, hebben recente studies voorgesteld om synthetische enzymen of mechanische methoden te gebruiken om hASCs te isoleren. Zelfs synthetische enzymen kunnen echter mogelijk het celprofiel wijzigen en de productkwaliteit beïnvloeden24. Integendeel, de hier onderzochte explant-gebaseerde methode kan een geldig alternatief zijn voor translationele doeleinden, aangezien de hASCs uit het weefsel migreren en zich op natuurlijke wijze aan de plastic oppervlakken hechten, zonder het gebruik van xenogene reagentia9. Tegelijkertijd moet er rekening mee worden gehouden dat deze methode een lagere celopbrengst aantoonde in vergelijking met de klassieke collagenase-isolatie25.
Met betrekking tot het supplementmedium, gebaseerd op recente literatuur, die het erover eens is dat hPL hASC-expansie in hogere mate ondersteunt dan FBS zonder de fysiologische eigenschappen van hASC te veranderen 26,27,28,29, hebben we het traditionele FBS-toegevoegde medium vervangen door hPL 16. Door de celkweek met hPL te ondersteunen, overwonnen we de verminderde celopbrengsten en het langzamere herstel in verband met mechanische isolatie. Deze minder gemanipuleerde hASC's verspreidden zich in vitro met een snelheid die de expansie mogelijk maakte die nodig was om klinisch relevante volumes op een efficiënte en veilige manier te bereiken30,31. Bovendien veranderde de kweek met hPL de stamachtige kenmerken en het immunofenotype dat typisch is voor hASCs niet, wat betekent dat de therapeutische interesse van deze cellen behouden bleef.
Voor zover wij weten, terwijl een verscheidenheid aan explantatie-isolatieprotocollen zijn beschreven voor ASC's, is onze methode de eerste die xenogeneïsche vrije mechanische isolatie van ASC's combineert met hPL-aangevulde mediumcultuur om een waardevolle celpopulatie te verkrijgen voor translationele toepassingen.
Daarnaast heeft de methode die in dit werk wordt beschreven enkele kritische aspecten die verder moeten worden uitgewerkt. Ten eerste mogen de diameters van de gehakte vetweefselfragmenten niet groter zijn dan 5 mm om hun hechting aan het kunststofoppervlak te vergemakkelijken en de migratie van de hASCs uit het weefsel mogelijk te maken. Ten tweede moet de aanwezigheid van vetweefselfragmenten in cultuur samen met de hASC's die al aan de plaat zijn bevestigd, in evenwicht worden gebracht, rekening houdend met het besmettingsrisico en de behoefte aan een voldoende aantal gemigreerde cellen. Ten derde moeten onderzoekers zich bewust zijn van een mogelijke verminderde groeisnelheid in de eerste 24 uur na het zaaien van de explant; na deze periode stimuleert de hPL-suppletie celherstel en proliferatie in vergelijking met de klassieke FBS30.
Op dit moment zijn er geen verdere stappen of wijzigingen aangebracht ten opzichte van het hierboven beschreven oorspronkelijke protocol.
Kortom, de hier beschreven volledige xenogene vrije methode biedt een eenvoudige manier om hASCs te isoleren uit vetweefsel, inclusief zowel lipoaspiraten als abdominaal vetweefsel, in afwezigheid van dierlijke producten, chemische enzymen of centrifugatiestappen. Bovendien compenseert het met hPL aangevulde medium de resulterende initiële cellagere opbrengst en verbetert het de celproliferatie terwijl de therapeutische eigenschappen van hASCs ongewijzigd blijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen erkenningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
References
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426 (2021).
- Condé-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017 (2016).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Chang, H., et al. Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation. Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).
- Spees, J. L., et al. Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy. Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).
- Fadel, L., et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep. Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).
- Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
- Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419 (2019).
- Lalu, M. M., et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One. 7 (10), 47559 (2012).
- Escobar, C. H., Chaparro, O. Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).
- Vaidya, V., et al. Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum. Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).
- Kyllönen, L., et al. Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17 (2013).
- Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion. Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review. Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351 (2020).
- Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176 (2021).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Cowper, M., et al. Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells. Cells. 8 (7), 724 (2019).
- Kim, N., et al. Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice. Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).
- Palombella, S., et al. Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model. Nanomaterials. 7 (8), 212 (2017).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research. Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).
- Perez-Ilzarbe, M., et al. Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy. Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells. Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).
- Becherucci, V., et al. Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124 (2018).
- Blande, I. S., et al. Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate. Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).
- Castegnaro, S., et al. Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).
- Palombella, S., et al. Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142 (2022).
- Palombella, S., et al. Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432 (2020).
- Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use. International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007 (2015).
