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पार्किन पाथवे-मध्यस्थता मिटोफैगी के माध्यम से क्रोसेटिन द्वारा ऑक्सीडेटिव तनाव से एच 9 सी 2 मायोकार्डियल कोशिकाओं का संरक्षण

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65105
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

Summary

इन विट्रो प्रयोगों के आधार पर, इस अध्ययन ने माइटोफैगी को प्रभावित करके कार्डियोमायोसाइट्स के ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति की मरम्मत में क्रोसेटिन के तंत्र का खुलासा किया, जिसमें पिंक 1 / पार्किन सिग्नलिंग मार्ग एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

Abstract

इस अध्ययन का उद्देश्य इन विट्रो प्रयोगों के माध्यम से एच 2 ओ 2-मध्यस्थता एच 9सी2 मायोकार्डियल कोशिकाओं पर क्रोसेटिन के ऑक्सीडेटिव तनाव-सुरक्षात्मक प्रभाव का पता लगाना था, और आगे यह पता लगाना था कि क्या इसका तंत्र माइटोफैगी के प्रभाव से संबंधित है। इस अध्ययन का उद्देश्य कार्डियोमायोसाइट्स में ऑक्सीडेटिव तनाव पर कुसुम एसिड के चिकित्सीय प्रभाव को प्रदर्शित करना और यह पता लगाना है कि क्या इसका तंत्र माइटोफैगी के प्रभाव से संबंधित है। यहां, एक एच 2 ओ2-आधारितऑक्सीडेटिव तनाव मॉडल का निर्माण किया गया था और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच), क्रिएटिन काइनेज (सीके), मालोंडिएल्डिहाइड (एमडीए), सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी), कैटलेस (कैट), और ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज (जीएसएच पीएक्स) के स्तर का पता लगाकर कार्डियोमायोसाइट्स के ऑक्सीडेटिव तनाव की चोट की डिग्री का आकलन किया गया था। माइटोकॉन्ड्रियल क्षति और एपोप्टोसिस का आकलन करने के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) -फ्लोरोसेंट डाई डीसीएफएच-डीए, जेसी -1 डाई और ट्यूनल डाई का पता लगाने के लिए नियोजित किया गया था। ऑटोफैजिक फ्लक्स को एड-एमचेरी-जीएफपी-एलसी 3 बी एडेनोवायरस को स्थानांतरित करके मापा गया था। माइटोफैगी से संबंधित प्रोटीन का पता तब पश्चिमी सोख्ता और इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से लगाया गया था। हालांकि, क्रोसेटिन (0.1-10 μM) सेल व्यवहार्यता में काफी सुधार कर सकता है और एच 2 ओ2के कारण एपोप्टोसिस और ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति को कम कर सकताहै। अत्यधिक ऑटोफैजिक सक्रियण वाली कोशिकाओं में, क्रोसेटिन ऑटोफैगी प्रवाह और माइटोफैगी से संबंधित प्रोटीन पिंक 1 और पार्किन की अभिव्यक्ति को भी कम कर सकता है, और पार्किन के माइटोकॉन्ड्रिया में स्थानांतरण को उलट सकता है। क्रोसेटिन एच 2 ओ 2-मध्यस्थता ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति और एच 9 सी2कोशिकाओं के एपोप्टोसिस को कम कर सकता है, और इसका तंत्र माइटोफैगी से निकटता से संबंधित था।

Introduction

तीव्र मायोकार्डियल रोधगलन (एएमआई) एक जानलेवा मायोकार्डियल नेक्रोसिस है जो गंभीर और लगातार इस्किमिया और कोरोनरी धमनियों में हाइपोक्सिया के कारण होता है। पर्क्यूटेनियस कोरोनरी इंटरवेंशन (पीसीआई) एएमआई के लिए पहली पंक्ति की चिकित्सीय रणनीतियों में से एक है, और आमतौर पर कार्डियोमायोसाइट्स को इस्केमिक क्षति 3,4 से बचाता है। डिस्टल मायोकार्डियम में रक्त और ऑक्सीजन की आपूर्ति की कमी होगी यदि एएमआई के बाद तुरंत और प्रभावी ढंग से इलाज नहीं किया जाता है, जिससे इस्केमिक नेक्रोसिस और आगे कार्डियोवैस्कुलर जटिलताएं 5,6 हो जाती हैं। कार्डियोमायोसाइट्स रिकवरी को बढ़ावा देना और पीसीआई सर्जिकल अवसर से चूकने के बाद अपरिवर्तनीय मायोकार्डियल क्षति को कम करना एक शोध हॉटस्पॉट रहा है। एएमआई के बाद, कार्डियोमायोसाइट्स इस्किमिया और हाइपोक्सिया की स्थिति में होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन का निषेध, एनएडी + से एनएडीपीएच में कमी और एकल इलेक्ट्रॉन कमीमें वृद्धि होती है। नतीजतन, ऑक्सीजन की अपूर्ण कमी प्रतिक्रिया प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) की अधिकता उत्पन्न करती है और अंततः कार्डियोमायोसाइट्सको ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति की ओर ले जाती है। आरओएस का अत्यधिक संचय लिपिड पेरोक्सीडेशन को ट्रिगर करता है, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली की संरचना और कार्य को और बाधित करता है। परिणाम माइटोकॉन्ड्रियल पारगम्यता संक्रमण छिद्रों का निरंतर उद्घाटन और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में कमी है, जो एपोप्टोसिस और नेक्रोसिस को प्रेरित करता है।

एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम (एसीई) इनहिबिटर, एंजियोटेंसिन-रिसेप्टर ब्लॉकर्स (एआरबी), एएमआई में β-एड्रेनोसेप्टर्स, एल्डोस्टेरोन विरोधी और अन्य मानक दवाओं के अवरोधक मायोकार्डियल रोधगलन के बाद हृदय समारोह को बढ़ाने में मदद कर सकते हैं और घातक घटनाओं की घटना को रोक सकते हैं, जैसे कि अतालता और बाएं वेंट्रिकुलर रीमॉडेलिंग9। हालांकि, पोस्टरोधगलन अस्तित्व और रोग का निदान इन्फ्रैक्ट आकार से बहुत प्रभावित होता है, और कार्डियोमायोसाइट्स एपोप्टोसिस10,11 को कम करने के लिए संतोषजनक परिणाम प्राप्त नहीं किए गए हैं। इस प्रकार, मायोकार्डियल रोधगलन के बाद कार्डियोमायोसाइट्स वसूली को बढ़ावा देने के लिए दवाओं का विकास एक जरूरी मुद्दा बन गया है।

पारंपरिक चिकित्सा कई वर्षों से आधुनिक दवा अनुसंधान के लिए प्रेरणा का स्रोत रही है12,13,14,15। पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) का एएमआई के उपचार में एक लंबा इतिहास है, और हाल के वर्षों में यादृच्छिक नियंत्रण परीक्षणों की एक श्रृंखला ने पुष्टि की है कि टीसीएम वास्तवमें रोगियों के पूर्वानुमान में सुधार कर सकता है। टीसीएम सिद्धांत के अनुसार, एएमआई रक्त ठहराव18,19 के कारण होता है, इसलिए रक्त परिसंचरण को बढ़ावा देने के लिए दवाओं का उपयोग आमतौर पर तीव्र चरण20 में एएमआई के उपचार के लिए किया जाता है। उनमें से, केसर को रक्त सक्रियण और ठहराव पर एक शक्तिशाली प्रभाव माना जाता है, और अक्सर एएमआई के तीव्र उपचार में उपयोग किया जाता है। क्रोसेटिन, केसर का एक प्रमुख घटक, कार्डियोमायोसाइट्स21 की रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।

इस अध्ययन में, एच 9 सी 2 मायोकार्डियल कोशिकाओं को एच 2ओ2 द्वारा मायोकार्डियल इस्किमिया / रीपरफ्यूजन का अनुकरण करने के लिए प्रेरित किया गया था, जो एएमआई की कार्डियोमायोसाइट चोट का कारण बनता है, और क्रोसेटिन का उपयोग ऑक्सीडेटिव तनाव-प्रेरित मायोकार्डियल चोट के खिलाफ इसके सुरक्षात्मक प्रभाव की जांच के लिए एक हस्तक्षेप के रूप में किया गया था। कार्डियोमायोसाइट्स की रक्षा करने वाले क्रोसेटिन के तंत्र को माइटोफैगी के माध्यम से आगे खोजा गया था। इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह लेख माइटोफैगी के अध्ययन के लिए तकनीकी दृष्टिकोण के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है और पूरी प्रयोगात्मक प्रक्रिया का विस्तार से वर्णन करता है।

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Protocol

प्रयोग बीजिंग यूनिवर्सिटी ऑफ चाइनीज मेडिसिन, चीन में फिजियोलॉजी की प्रयोगशाला में किए गए थे। सभी अध्ययन विधियों को बीजिंग विश्वविद्यालय के प्रासंगिक दिशानिर्देशों और नियमों के अनुसार किया गया था।

1. सेल संस्कृति

  1. डीएमईएम पूर्ण माध्यम तैयार करने के लिए डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) मूल माध्यम (4.5 ग्राम / एल डी-ग्लूकोज, 4.जी / एल एल-ग्लूटामाइन, और 110 मिलीग्राम / एल सोडियम पाइरूवेट के साथ) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें।
  2. तरल नाइट्रोजन-जमे हुए एच 9 सी 2 मायोकार्डियल कोशिकाओं ( सामग्री की तालिका देखें) को गर्म पानी में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक त्वरित और समान हलचल के साथ पिघलाएं जब तक कि बर्फ पिघल न जाए।
  3. कोशिकाओं को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और डीएमईएम पूर्ण माध्यम की मात्रा का चार गुना जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 358 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें और एक पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
  4. प्राप्त सेल सस्पेंशन को कल्चर माध्यम से पतला करें, धीरे से झटका दें, और कल्चर फ्लास्क में कोशिकाओं को टीका लगाएं। 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में संस्कृति।

2. सेल व्यवहार्यता का निर्धारण

  1. 0.05 mM, 0.1 mM, 0.5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, और 200 mM की सांद्रता के लिए डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (सामग्री की तालिका देखें) में क्रोसेटिन ( सामग्री की तालिका देखें) को भंग करें।
  2. ट्रिप्सिन द्वारा एच 9 सी 2 मायोकार्डियल कोशिकाओं को अलग करें, फिर डीएमईएम पूर्ण माध्यम के साथ मिश्रण को बेअसर करें।
  3. कोशिकाओं को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 179 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और कोशिकाओं को डीएमईएम पूर्ण माध्यम में धीरे-धीरे उड़ाकर मिलाएं।
  4. रक्त कोशिका गिनती प्लेट22 (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें डीएमईएम पूर्ण माध्यम × साथ 510 4 कोशिकाओं / एमएल तक पतला करें।
  5. कोशिकाओं को नौ बराबर भागों में विभाजित करें। नियंत्रण समूह में डीएमएसओ (डीएमईएम पूर्ण माध्यम के साथ 1: 1,000 अनुपात में पतला) जोड़ें और 1: 1,000 के अनुपात में शेष समूहों में क्रोसेटिन की विभिन्न सांद्रता जोड़ें।
  6. कोशिकाओं को 96-वेल प्लेटों में 100 μL प्रति कुएं पर बीज दें। 24 घंटे के लिए इनक्यूबेशन के बाद सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धो लें।
  7. डीएमईएम बेसल माध्यम के 100 μL जोड़ने के बाद, 4 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और एमटीएस के 20 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  8. कोशिकाओं को एक और 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, 490 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को मापें, और सेल व्यवहार्यता की गणना करें।
    नोट: सेल व्यवहार्यता = (ओडी उपचारित - ओडी रिक्त) / (ओडी नियंत्रण - ओडी रिक्त) × 100।

3. लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (एलडीएच), क्रिएटिन काइनेज (सीके), मालोंडिएल्डिहाइड (एमडीए), सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज (एसओडी), ग्लूटाथियोन पेरोक्सीडेज (जीएसएच पीएक्स), और कैटलेस (कैट) का निर्धारण

  1. H9c2 कोशिकाओं को 6-वेल प्लेट में 1 × 105 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज दें। हस्तक्षेप के बाद सतह पर तैरनेवाला एकत्र करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एलडीएच और एसओडी स्तरों का पता लगाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करें और इसे एक बार फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) से धो लें। कल्चर डिश में सेल लाइसेट जोड़ें और इसे 20 मिनट के लिए बर्फ पर बैठने दें। कल्चर डिश से तरल को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें।
  3. निर्माता के निर्देशों23 के अनुसार सीके, एमडीए, जीएसएच-पीएक्स और कैट स्तरों का पता लगाएं (सामग्री और पूरक फ़ाइल 1 की तालिका देखें)।
  4. सीके, एमडीए, जीएसएच-पीएक्स और कैट24 की एकाग्रता को सही करने के लिए बिसिनकोनिक एसिड (बीसीए) विधि द्वारा लाइसिस की कुल प्रोटीन एकाग्रता का पता लगाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।

4. आरओएस का निर्धारण

  1. H9c2 कोशिकाओं को 48-वेल प्लेट में 5 × 103 कोशिकाओं के घनत्व पर बीज दें। सीरम-मुक्त माध्यम के साथ 1: 1,000 अनुपात पर डीसीएफएच-डीए ( सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें। सेल सुपरनैटेंट को त्याग दें और सेल को सीरम-मुक्त माध्यम से दो बार धोएं।
  2. प्रत्येक कुएं में पतला डीसीएफएच-डीए के 150 μL जोड़ें और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। कोशिकाओं को सीरम-मुक्त माध्यम से तीन बार धोएं और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत छवियों को कैप्चर करें (सामग्री की तालिका देखें)।

5. माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का पता लगाना

  1. जेसी -1 माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित परख किट25 का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता का पता लगाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। संस्कृति माध्यम को त्याग दें और उन्हें सीरम-मुक्त माध्यम से एक बार धो लें।
  2. प्रत्येक ट्यूब में जेसी -1 काम करने वाला घोल जोड़ें और उन्हें अच्छी तरह मिलाएं। 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और जेसी -1 स्टेनिंग बफर के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं। प्रत्येक कुएं में पूर्ण माध्यम जोड़ें और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत तस्वीरें कैप्चर करें।

6. ट्यूनल धुंधला परख

  1. एपोप्टोसिस दर26 निर्धारित करने के लिए एक ट्यूनल एपोप्टोसिस परख किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें। सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और सीरम-मुक्त माध्यम से एक बार गोली को धो लें।
  2. सेल निर्धारण समाधान जोड़ें और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करने के बाद उन्हें एक बार पीबीएस से धो लें।
  3. प्रत्येक कुएं में 0.3% ट्राइटन -100 जोड़ें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं। ट्यूनल डिटेक्शन वर्किंग सॉल्यूशन जोड़ें और 60 मिनट के लिए अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (DAPI; सामग्री की तालिका देखें) युक्त एक एंटी-फ्लोरेसेंस शमन सीलिंग टैबलेट जोड़ें और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत तस्वीरें कैप्चर करें।

7. एमचेरी जीएफपी-एलसी 3 बी एडेनोवायरस के अभिकर्मक द्वारा ऑटोफैजिक प्रवाह की निगरानी

  1. प्रत्येक कुएं में माध्यम के आधे हिस्से को ताजा माध्यम से बदलें। कल्चर माध्यम में एड-एमचेरी जीएफपी-एलसी 3 बी एडेनोवायरस (2 के संक्रमण की बहुलता [एमओआई]) जोड़ें और संक्रमण दक्षता में सुधार के लिए 5 μg / mL पॉलीब्रेन ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
  2. 24 घंटे के बाद ताजा माध्यम को बदलें और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति का निरीक्षण करें।
  3. सफल वायरस संक्रमण की पुष्टि करने के बाद खंड 1 के समान स्थितियों के साथ कोशिकाओं को कल्चर करें और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप27 के तहत छवियों को कैप्चर करें।
    नोट: 20% से अधिक कोशिकाओं ने हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) प्रतिदीप्ति दिखाई, जो एक सफल संक्रमण का संकेत देता है।

8. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण

  1. पूरे प्रोटीन निष्कर्षण के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करें और उन्हें 30 मिनट के लिए बर्फ पर (आरआईपीए, प्रोटीज अवरोधक और फॉस्फेट अवरोधक = 100: 1: 1; सामग्री की तालिका देखें) लाइज करें।
  2. प्रोटीन परिमाणीकरण के बाद प्रोटीन नमूने में 5x प्रोटीन लोडिंग बफर जोड़ें और 10 मिनट के लिए नमूने उबालें।
  3. इलेक्ट्रोफोरेस उन नमूनों को जिनमें सोडियम डोडेसिल-सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) जैल28 के साथ समान मात्रा में प्रोटीन होता है। फिर, नमूनों को पॉलीविनाइलिडेन डाइफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली पर स्थानांतरित करें।
  4. 5% स्किम मिल्क पाउडर के साथ 1 घंटे के लिए पीवीडीएफ झिल्ली को अवरुद्ध करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी (पिंक 1, पार्किन; सामग्री की तालिका देखें) और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें।
  5. एन्हांस्ड केमिल्यूमिनेसेंस (ईसीएल) समाधान और केमिलुमिनेसेंस डिटेक्शन सिस्टम का उपयोग करके लक्ष्य बैंड का पता लगाएं। डेंसिटोमेट्री28 के माध्यम से बैंड की मात्रा निर्धारित करने के लिए छवि जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

9. इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा पार्किन के माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसलोकेशन का पता लगाना

  1. डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा माइटोकॉन्ड्रिया के साथ पार्किन के सह-स्थानीयकरण का निरीक्षण करें। प्रत्येक समूह से सेल सुपरनैटेंट को त्याग दें और उन्हें पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  2. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें और पीबीएस में 0.1% ट्राइटन -100 जोड़ें।
  3. प्रोटीन और एंटीबॉडी के बीच गैर-विशिष्ट बंधन को रोकने और प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि को कम करने के लिए 1 घंटे के लिए पशु-मुक्त ब्लॉक समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ ब्लॉक करें।
  4. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक प्राथमिक एंटीबॉडी (पार्किन और टॉम 20; सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेट करें।
  5. एक फ्लोरोसेंट द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और 1 घंटे के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
  6. डीएपीआई युक्त एंटी-फ्लोरेसेंस शमन गोलियां जोड़ें और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत छवियों को कैप्चर करें।

10. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. ग्राफ़िंग और विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. एक-तरफ़ा ANOVA का उपयोग करके समूहों के बीच निरंतर चर की तुलना करें। पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।

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Representative Results

सेल व्यवहार्यता पर क्रोसेटिन के प्रभाव
0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, और 100 μM पर क्रोसेटिन का कोशिकाओं पर एक महत्वपूर्ण प्रोलिफेरेटिव प्रभाव था, जबकि 200 μM से ऊपर सांद्रता पर क्रोसेटिन ने H9c2 कोशिकाओं के प्रसार को काफी हद तक रोक दिया (चित्रा 1A)। 400 μM H 2 O2के साथ 4 घंटे के उपचार के बाद, सेल व्यवहार्यता काफी कम हो गई थी, और क्रोसेटिन इस परिवर्तन को एक निश्चित सीमा तक उलट सकता था (चित्रा 1 बी)। चूंकि एच 2 ओ 2-प्रेरित एच 9 सी2सेल व्यवहार्यता पर 10 μM और 100 μM क्रोसेटिन के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था, इसलिए 10 μM क्रोसेटिन को उच्च सांद्रता के रूप में चुना गया था, और 1 μM और 0.1 μM क्रमशः मध्यम और निम्न खुराक समूहों के रूप में उपयोग किया गया था।

एच 9 सी 2 कोशिकाओं में एलडीएच, सीके, एमडीए, एसओडी, जीएसएच-पीएक्स और कैट पर क्रोसेटिन के प्रभाव
400 μM H 2 O2के साथ 4 घंटे के उपचार के बाद, LDH, CK, और MDA के स्तर में काफी वृद्धि हुई, जबकि SOD, GSH-Px और CAT के स्तर में कमी आई। 24 घंटे के लिए 10 μM क्रोसेटिन की प्रथागत उपचार उपरोक्त परिवर्तनों को उलट सकता है और एक स्पष्ट खुराक-निर्भर प्रभाव दिखाता है। एक सकारात्मक नियंत्रण दवा के रूप में, कोएंजाइम क्यू 10 केवल सीके, एमडीए और एसओडी (चित्रा 2) के स्तर को बदल सकता है।

एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स में आरओएस पर क्रोसेटिन का प्रभाव
एक रिक्त नियंत्रण के रूप में, एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स ने लगभग कोई आरओएस व्यक्त नहीं किया। उसी समय, 4 घंटे के उपचार के लिए 400 μM H 2 O2आरओएस स्तर को विशेष रूप से बढ़ा सकता है, जिसे कुछ हद तक 10 μM क्रोसेटिन द्वारा उलट दिया जा सकता है (चित्रा 3)। प्रतिदीप्ति परिणामों से पता चला कि सामान्य समूह में हरी प्रतिदीप्ति बहुत कमजोर थी। इसकी तुलना में, 4 घंटे के उपचार के लिए 400 μM H 2 O2हरे प्रतिदीप्ति संकेत को बढ़ा सकता है, और इस वृद्धि को 10 μM क्रोसेटिन (चित्रा 3) द्वारा कम किया जा सकता है।

एच 2 ओ2-प्रेरितमाइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और एपोप्टोसिस पर क्रोसेटिन के प्रभाव
जेसी -1 धुंधला ने रिक्त नियंत्रण समूह में अधिक लाल प्रतिदीप्ति और कम हरे रंग की प्रतिदीप्ति दिखाई। 400 μM H 2 O2के उपचार के 4 घंटे के बाद, अधिक हरी प्रतिदीप्ति और कम लाल प्रतिदीप्ति देखी गई, और 10 μM क्रोसेटिन कुछ हद तक इस परिवर्तन को उलट सकता है (चित्रा 4 ए)। ट्यूनल धुंधला परिणामों से पता चला है कि रिक्त नियंत्रण समूह में एपोप्टोसिस से संबंधित सिग्नलिंग का पता नहीं लगाया गया था, जबकि एपोप्टोसिस से संबंधित सिग्नलिंग को 4 घंटे के उपचार के लिए 400 μM H 2 O2के बाद काफी बढ़ाया गया था, जिसे कुछ हद तक 10 μM क्रोसेटिन द्वारा उलट दिया जा सकता है (चित्रा 4B)।

एच 2 ओ2-प्रेरितअत्यधिक ऑटोफैगी पर क्रोसेटिन के प्रभाव
रिक्त नियंत्रण समूह में एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स ने कोई स्पष्ट ऑटोफैगी प्रवाह नहीं दिखाया। फ्लोरेसेंस ने एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स में 4 घंटे के लिए 400 μM H 2 O2के साथ इलाज किए गए पीले धब्बे की उपस्थिति दिखाई, जो ऑटोफैगी के स्पष्ट अति-सक्रियण का संकेत देता है। हालांकि, 10 μM क्रोसेटिन प्रथागत के बाद इस परिवर्तन को उलट दिया गया था। नियंत्रण समूह में, एड-एमचेरी जीएफपी-एलसी 3 बी वायरस को केवल प्रतिदीप्ति द्वारा एक कमजोर फैलाने वाली पीली पृष्ठभूमि के रूप में देखा जा सकता है। हालांकि, 4 घंटे के उपचार के लिए 400 μM H 2 O2 के बादपीले धब्बे देखे गए, और इस परिवर्तन को 10 μM क्रोसेटिन प्रथागत (चित्रा 5) के बाद उलट दिया गया।

माइटोफैगी से संबंधित प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर क्रोसेटिन का पता लगाना
वेस्टर्न ब्लॉट के परिणामों से पता चला है कि नियंत्रण समूह में, पिंक 1 और पार्किन के अभिव्यक्ति स्तर कम थे। 4 एच एच 2 ओ 2-उत्तेजितएच9 सी2 कार्डियोमायोसाइट्स में, पिंक 1 और पार्किन के अभिव्यक्ति स्तर में वृद्धि हुई, जबकि 10 μM क्रोसेटिन प्रथागत पिंक 1 और पार्किन की वृद्धि को कम कर सकता है (चित्रा 6)।

पार्किन माइटोकॉन्ड्रिया के स्थानांतरण पर क्रोसेटिन के प्रभाव का पता लगाना
इम्यूनोफ्लोरेसेंस परिणामों से पता चला कि रिक्त नियंत्रण समूह में पार्किन का प्रतिनिधित्व करने वाला लाल प्रतिदीप्ति संकेत बहुत कमजोर था; हालांकि, 4 घंटे के उपचार के लिए 400 μM H 2 O2के बाद, लाल प्रतिदीप्ति संकेत बढ़ाया गया था, और टॉम 20 का प्रतिनिधित्व करने वाले हरे प्रतिदीप्ति के साथ सह-स्थानीयकरण में वृद्धि हुई थी। 10 μM क्रोसेटिन की प्रथागत उपचार के बाद, लाल प्रतिदीप्ति संकेत कमजोर हो गया था, और हरे प्रतिदीप्ति संकेत के साथ सह-स्थानीयकरण कम हो गया था (चित्रा 7)।

Figure 1
चित्रा 1: एमटीटी परख द्वारा सेल व्यवहार्यता का पता लगाना। (ए) सेल व्यवहार्यता (एन = 6) पर विभिन्न सांद्रता में क्रोसेटिन का प्रभाव। (बी) एच 2 02 हस्तक्षेप (एन = 6) के बाद सेल व्यवहार्यता परविभिन्न सांद्रता में क्रोसेटिन का प्रभाव। * पी < 0.05 बनाम नियंत्रण समूह, # पी < 0.05 बनाम एच 2 ओ2 उपचारसमूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एलडीएच, सीके, एमडीए, एसओडी, जीएसएच-पीएक्स और कैट स्तरों का पता लगाना। (ए) सेल सुपरनैटेंट में एलडीएच स्तर (एन = 6)। (बी) सेल लाइसेट में सीके स्तर (एन = 6)। (सी) सेल लाइसेट में एमडीए स्तर (एन = 6)। (डी) सेल सुपरनैटेंट में एसओडी स्तर (एन = 6)। (ई) सेल लाइसेट में जीएसएच-पीएक्स स्तर (एन = 6)। (एफ) सेल लाइसेट में कैट स्तर (एन = 6)। * पी < 0.05 बनाम रिक्त नियंत्रण समूह, # पी < 0.05 बनाम एच 2 ओ2 उपचार समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डीसीएफएच-डीए द्वारा निर्धारित आरओएस। (ए) डीसीएफएच-डीए का उपयोग एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स में आरओएस स्तर को मापने के लिए किया गया था। आरओएस: हरा। (बी) आरओएस का परिमाणीकरण डेटा। (ए) उपचार के बिना एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स। (b) H9c2 कार्डियोमायोसाइट्स 4 घंटे के लिए 400 μM H 2 O 2 के साथ उत्तेजित होते हैं। (c) H9c2 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 10 μM क्रोसेटिन के साथ पूर्वउपचारित किया जाता है और फिर 4 घंटे के लिए 400 μM H 2 O2के साथ उत्तेजित किया जाता है। स्केल बार = 24 μm. *p < 0.05 बनाम रिक्त नियंत्रण समूह, #p < 0.05 बनाम H 2 O2उपचार समूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और एपोप्टोसिस का पता लगाना। (ए) माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता जेसी -1 धुंधला द्वारा निर्धारित की गई थी। जेसी -1 समुच्चय: लाल; जेसी -1 मोनोमर्स: हरा। (बी) एच 9 सी 2 कोशिकाओं में ट्यूनल धुंधला होने से एपोप्टोसिस का पता लगाया गया था। ट्यूनल: हरा; DAPI: नीला. (ए) उपचार के बिना एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स। (b) H9c2 कार्डियोमायोसाइट्स 4 घंटे के लिए 400 μM H 2 O 2 के साथ उत्तेजित होते हैं। (c) H9c2 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 10 μM क्रोसेटिन के साथ पूर्वउपचारित किया जाता है और फिर 4 घंटे के लिए 400 μM H 2 O2के साथ उत्तेजित किया जाता है। स्केल सलाखों = 72 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एमचेरी-जीएफपी-एलसी 3 बी एडेनोवायरस द्वारा पता लगाया गया ऑटोफैजिक फ्लक्स। एमचेरी: लाल; जीएफपी: हरा। (ए) उपचार के बिना एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स। (b) H9c2 कार्डियोमायोसाइट्स 4 घंटे के लिए 400 μM H 2 O 2 के साथ उत्तेजित होते हैं। (c) H9c2 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 10 μM क्रोसेटिन के साथ पूर्वउपचारित किया जाता है और फिर 4 घंटे के लिए 400 μM H 2 O2के साथ उत्तेजित किया जाता है। स्केल सलाखों = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: पश्चिमी सोख्ता द्वारा माइटोफैगी से संबंधित प्रोटीन की सामग्री का पता लगाया गया था। (ए) प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा जो पिंक 1 और पार्किन अभिव्यक्ति को दर्शाता है। β-एक्टिन को आंतरिक संदर्भ के रूप में अपनाया गया था। (बी) सापेक्ष पिंक 1 अभिव्यक्ति (एन = 3)। (सी) सापेक्ष पार्किन अभिव्यक्ति (एन = 3)। * पी < 0.05 बनाम नियंत्रण समूह, # पी < 0.05 बनाम एच 2 ओ2 उपचारसमूह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: इम्यूनोफ्लोरेसेंस डबल स्टेनिंग द्वारा पार्किन के माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसलोकेशन का पता लगाना। लाल प्रतिदीप्ति-लेबल पार्किन का प्रोटीन और हरे रंग की प्रतिदीप्ति लेबल-टॉम 20 प्रोटीन। पार्किन: लाल; टॉम 20: हरा; DAPI: नीला)। (ए) उपचार के बिना एच 9 सी 2 कार्डियोमायोसाइट्स। (b) H9c2 कार्डियोमायोसाइट्स 4 घंटे के लिए 400 μM H 2 O 2 के साथ उत्तेजित होते हैं। (c) H9c2 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 10 μM क्रोसेटिन के साथ पूर्वउपचारित किया जाता है और फिर 4 घंटे के लिए 400 μM H 2 O2के साथ उत्तेजित किया जाता है। स्केल सलाखों = 24 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: एलडीएच, सीके, एमडीए, एसओडी, जीएसएच-पीएक्स और कैट परख के कार्य निर्देश। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

उन्नत प्रौद्योगिकी के माध्यम से प्राकृतिक दवाओं के जटिल यौगिकों से प्रभावी अवयवों की खोज टीसीएम अनुसंधानका एक हॉटस्पॉट रहा है, और सत्यापन के बाद भविष्य की दवा के विकास के लिए प्रयोगशाला साक्ष्य प्रदान कर सकता है। कुसुम "रक्त परिसंचरण को बढ़ावा देने और रक्त ठहराव को कम करने" के उपचार में एक प्रतिनिधि दवा है और व्यापक रूप से मायोकार्डियल रोधगलन30,31 के उपचार में उपयोग की जाती है। माना जाता है कि केसर का कुसुम के समान प्रभाव होता है, और रक्त परिसंचरण को बढ़ावा देने और रक्त ठहराव को दूर करने में इसका प्रभाव कुसुम31,32 से काफी बेहतर है। क्रोसेटिन केसर33 के मुख्य सक्रिय घटकों में से एक है, इसलिए इसका उपयोग इस प्रयोग के अध्ययन में किया गया था।

एच2 ओ2 कार्डियोमायोसाइट्स के ऑक्सीडेटिव तनाव की चोट का कारण बन सकता है और कार्डियोमायोसाइट्स के मायोकार्डियल रोधगलन स्थिति का अनुकरण कर सकता है, जिसे विट्रो34 में मायोकार्डियल रोधगलन के मॉडल के रूप में स्थापित किया गया है। इस अध्ययन में, क्रोसेटिन की कम सांद्रता कार्डियोमायोसाइट्स की सेल व्यवहार्यता को बढ़ावा दे सकती है, जो माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा चयापचय के सक्रियण से निकटता से संबंधित हो सकती है। क्रोसेटिन एच 2 ओ2द्वारा प्रेरित कार्डियोमायोसाइट्स की कम व्यवहार्यता को बहाल कर सकता है और इसमें खुराक-निर्भर प्रभाव होता है, यह सुझाव देते हुए कि क्रोसेटिन कार्डियोमायोसाइट्स के ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति में सुधार कर सकता है। इस बीच, क्रोसेटिन एच 2 ओ2के कारण मायोकार्डियल क्षति और ऑक्सीडेटिव तनाव सूचकांक को प्रभावी ढंग से उलट सकता है, आगे इसके मायोकार्डियल सुरक्षात्मक प्रभाव की पुष्टि करता है।

माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में गिरावट एपोप्टोसिस35 के शुरुआती चरणों में हॉलमार्क घटनाओं में से एक है। जेसी -1 रंजक माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर एक संभावित-निर्भर तरीके से एकत्रित होते हैं। सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में, जेसी -1 लाल रंग में एक फ्लोरोसेंट बहुलक बनाता है। जब माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता ढह जाती है, तो जेसी -1 मोनोमर्स36 के रूप में हरे रंग की प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है। ट्यूनल एपोप्टोसिस37 के अंतिम चरणों में परमाणु डीएनए स्ट्रैंड ब्रेक का पता लगाता है। एपोप्टोटिक कोशिकाएं डीएनए एंडोन्यूक्लिज़ एंजाइमों को सक्रिय करती हैं जो न्यूक्लियोसोम के बीच जीनोमिक डीएनए को काटती हैं, और उजागर 3'-ओएच को ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोब फ्लोरेसिन (एफआईटीसी) -लेबल डीयूटीपी के साथ पता लगाया जा सकता है जो टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटिडिल ट्रांसफेरेज़37 द्वारा उत्प्रेरित होता है। इस अध्ययन के परिणाम बताते हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता कम हो गई और कार्डियोमायोसाइट्स के एपोप्टोसिस एच 2 ओ2मॉडलिंग के बाद दिखाई दिए; क्रोसेटिन द्वारा परिवर्तनों को एक निश्चित सीमा तक उलट दिया जा सकता है, यह सुझाव देते हुए कि क्रोसेटिन ऑक्सीडेटिव तनाव के कारण कार्डियोमायोसाइट्स के एपोप्टोसिस को प्रभावी ढंग से रोक सकता है।

PINK1 / Parkin एक शास्त्रीय मार्ग है जो माइटोफैगी38 की मध्यस्थता करता है। पिंक 1 माइटोकॉन्ड्रियल क्षति के बाद बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली पर जमा होता है और पार्किन को एक्स्ट्रामाइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली प्रोटीन को यूबिकिटेट करने के लिए भर्ती किया जाता है, जो ऑटोफैगी से संबंधित रिसेप्टर प्रोटीन को ऑटोफैगोसोम बनाने के लिए बांधता है, जो माइटोफैगी39,40,4 1 की घटना को चिह्नित करता है। परिणाम बताते हैं कि एच 2 ओ2मॉडलिंग के बाद कार्डियोमायोसाइट्स में पिंक 1 और पार्किन के प्रोटीन का स्तर बढ़ गया था, जो अत्यधिक ऑटोफैगी का सुझाव देता है। क्रोसेटिन के हस्तक्षेप के बाद, एच 2 ओ2के साथ इलाज किए गए कार्डियोमायोसाइट्स में पिंक 1 और पार्किन के प्रोटीन स्तर को एक निश्चित सीमा तक उलट दिया गया था, यह सुझाव देते हुए कि यह अत्यधिक माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफैगी को रोककर चिकित्सीय भूमिका निभा सकता है। इस अध्ययन में, क्रोसेटिन ने एच 2ओ 2-प्रेरित ऑक्सीडेटिव क्षति और एच 9 सी2 कार्डियोमायोसाइट्स के एपोप्टोसिस को कम कर दिया, और यह अनुमान लगाया जाता है कि यह प्रभाव अत्यधिक माइटोफैगी को रोकने के लिए पिंक 1 / पार्किन मार्ग को प्रभावित करके प्राप्त किया जा सकता है।

इस प्रयोग ने सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव और माइटोफैगी पर हर्बल लियोफिलाइज्ड पाउडर के हस्तक्षेप का प्रदर्शन किया। माइटोकॉन्ड्रियल ऑटोफैगी का निरीक्षण करने के लिए एमचेरी-जीएफपी-एलसी 3 बी एडेनोवायरस का उपयोग करना प्रयोग में एक महत्वपूर्ण कदम था। इस कदम की सफलता की कुंजी कोशिकाओं की संक्रमण दर को बढ़ाना था, और संक्रमण दक्षता को बढ़ाने के लिए प्रोवायरल संक्रमण अभिकर्मक पॉलीब्रेन को पहले से माध्यम में जोड़ा गया था। यह सेल सतह सियालिक एसिड और वायरल कणों के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण को बेअसर करके हासिल किया गया था, इस प्रकार सोखने की सुविधा प्रदान की गई थी। यह भी ध्यान देने योग्य है कि, अपेक्षाकृत सुरक्षित वायरस के रूप में, हालांकि एडेनोवायरस जीनोम संक्रमण के बाद मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत नहीं होता है और सेल में प्रतिकृति नहीं करता है, फिर भी यह संभावित रूप से जैविक रूप से खतरनाक है। इसलिए, नियामक आवश्यकताओं के सख्त अनुपालन के तहत प्रयोगों का संचालन करने की सिफारिश की जाती है।

फ्लोरोसेंट लेबलिंग माइटोफैगी का पता लगाने के लिए एक सामान्य तरीका है, लेकिन इसकी खराब विशिष्टता के कारण, अन्य ऑर्गेनेल को गलत तरीके से लेबल किया जा सकता है और इस प्रकारप्रयोगात्मक परिणामों में हस्तक्षेप किया जा सकता है। जैसा कि प्रौद्योगिकी प्रगति जारी है, हम माइटोफैगी के तंत्र का पता लगाने के लिए अधिक सटीक और विश्वसनीय फ्लोरोसेंट जांच के विकास की उम्मीद कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 7202119) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 82274380) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin Gibco 2323363
1% Penicillin-streptomycin Sigma V900929
5x protein loading buffer Beijing Pulilai Gene Technology B1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirus Beyotime C3011
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0514
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZF-0513
Animal-free blocking solution CST 15019s
Anti-Parkin antibody Santa Cruz sc-32282
Anti-PINK1 antibody ABclonal A11435
Anti-TOM20 antibody ABclonal A19403
Anti-β-actin  antibody ABclonal AC026
BCA protein assay kit KeyGEN Biotech KGP902
Blood cell counting plate Servicebio WG607
CAT assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A007-1-1
Chemiluminescence detection system Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Factory ChemiScope 6100
CK assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A032-1-1
Coenzyme Q10 (CoQ 10) Macklin C6129
Crocetin Chengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd. RFS-Z01802006012
DAPI-containing antifluorescence quenching tablets Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZLI-9557
DCFH-DA Beyotime S0033S
DMSO Solarbio D8371
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 8122091
Enhanced Chemiluminescence (ECL) solution NCM Biotech P10100
Fetal bovine serum (FBS) Corning-Cellgro 35-081-CV
GraphPad Prism 7.0  https://www.graphpad.com/
GSH-Px assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A005-1-2
H9c2 myocardial cells Beijing Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd. CS0062
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-goat IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2305
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)  Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd. ZB-2301
JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit LABLEAD J22202
LDH assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A020-2-2
MDA assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A003-2-2
Methanol Aladdin A2114057
MTS assay Promega G3581
Perhydrol G-clone CS7730
Phosphatase inhibitor CWBIO CW2383
Polybrene Beyotime C0351
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes Millipore ISEQ00010
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer Solarbio R0010
SDS-PAGE gels Shanghai Epizyme Biomedical Technology PG112
SDS-PAGE running buffer powder Servicebio G2018-1L
SDS-PAGE transfer buffer powder Servicebio G2017-1L
SOD assay kits Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute A001-2-2
Tris-buffered saline powder Servicebio G0001-2L
Triton X-100 Sigma SLCC9172
TUNEL apoptosis assay kit Beyotime C1086
Tween-20 Solarbio T8220

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चिकित्सा अंक 195 क्रोसेटिन एच 9 सी 2 मायोकार्डियल कोशिकाएं ऑक्सीडेटिव तनाव पिंक 1 / पार्किन मार्ग माइटोफैगी
पार्किन पाथवे-मध्यस्थता मिटोफैगी के <em>माध्यम</em> से क्रोसेटिन द्वारा ऑक्सीडेटिव तनाव से एच 9 सी 2 मायोकार्डियल कोशिकाओं का संरक्षण
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