Summary
Denne undersøgelse beskriver en musemodel til undersøgelse af nikotins synergistiske effekt på udviklingen af lungefibrose i eksperimentelle silikosemus. Dual-exposure musemodellen simulerer den patologiske progression i lungen efter samtidig eksponering for nikotin og silica. De beskrevne metoder er enkle og meget reproducerbare.
Abstract
Rygning og eksponering for silica er almindelige blandt erhvervsarbejdere, og silica er mere tilbøjelige til at skade lungerne hos rygere end ikke-rygere. Nikotinens rolle, den primære vanedannende ingrediens i cigaretter, i silikoseudviklingen er uklar. Musemodellen, der blev anvendt i denne undersøgelse, var enkel og let kontrolleret, og den simulerede effektivt virkningerne af kronisk nikotinindtagelse og gentagen eksponering for silica på lungefibrose gennem epitel-mesenkymal overgang hos mennesker. Derudover kan denne model hjælpe med den direkte undersøgelse af nikotins virkninger på silikose, samtidig med at man undgår virkningerne af andre komponenter i cigaretrøg.
Efter miljøtilpasning blev mus injiceret subkutant med 0,25 mg/kg nikotinopløsning i den løse hud over halsen hver morgen og aften med 12 timers intervaller over 40 dage. Derudover blev krystallinsk silicapulver (1-5 μm) suspenderet i normalt saltvand, fortyndet til en suspension på 20 mg / ml og dispergeret jævnt ved hjælp af et ultralydsvandbad. De isofluranbedøvede mus inhalerede 50 μL af denne silicastøvsuspension gennem næsen og blev vækket via brystmassage. Silikaeksponering blev administreret dagligt på dag 5-19.
Den dobbelteksponerede musemodel blev udsat for nikotin og derefter silica, hvilket matcher eksponeringshistorikken for arbejdstagere, der udsættes for begge skadelige faktorer. Derudover fremmede nikotin lungefibrose gennem epitel-mesenkymal transformation (EMT) hos mus. Denne dyremodel kan bruges til at studere virkningerne af flere faktorer på udviklingen af silikose.
Introduction
Silikaeksponering hos arbejdstagere er uundgåelig i nogle erhvervsmæssige indstillinger, og når de først er udsat for silica, skrider forringelsen frem, selv efter fjernelse fra miljøet. Derudover ryger de fleste af disse arbejdere, og traditionelle cigaretter indeholder tusindvis af kemikalier, hvor den vigtigste vanedannende komponent er nikotin1. E-cigaretter bliver stadig mere populære i yngre aldersgrupper2; Disse e-cigaretter fungerer som et nikotinafgivelsessystem og øger nikotinadgangen, hvilket øger lungemodtagelighed og lungebetændelse3. Cigaretrøg fremskynder også lungefibrose hos bleomycineksponerede mus4 og øger lungetoksicitet og fibrose hos silicaeksponerede mus 5,6. Men om nikotin kan påvirke den inflammatoriske og lungefibrose proces forårsaget af silica er stadig at undersøge.
Silikosemusemodellen, der er etableret ved engangsindånding af en høj dosis silica i luftrøret, er traumatisk for mus. Selvom denne metode hurtigt giver en silikosemodel, stemmer den ikke overens med virkeligheden i et miljø, hvor arbejdere gentagne gange udsættes for silica. Derfor etablerede vi en silicaeksponeret musemodel ved gentagne gange at give en lav dosis silicasuspensioner via et næsedrop; Denne dosis kan forårsage betændelse og fibrose hos mus.
For at omgå virkningerne af andre cigaretkomponenter blev denne musemodel subkutant injiceret med nikotin i nakkens løse hud for at bestemme virkningen af den vanedannende komponent, nikotin, på silikose. Ved at administrere subkutane injektioner kan der opnås nøjagtig dosering, hvilket gør det muligt at oprette nikotineksponeringsmodeller og observere dosistoksicitetsresponser såvel som afhængighed. Der er udviklet en nikotinafhængighedsmodel i hanmus med en nikotininjektionsdosis på 0,2-0,4 mg/kg 7,8. I denne model blev to subkutane injektioner administreret med intervaller på 12 timer for at imødekomme de afhængige mus' stofsøgende behov. Denne muse nikotinafhængighedsmodel er nyttig til simulering af menneskelige rygevaner og eksponering for silica.
Enkeltfaktordyremodeller har begrænsninger i sygdomsstudier, mens metoden beskrevet her involverer en tofaktormusemodel af nikotin og silica co-eksponering. Før silicaeksponeringen blev musene udsat for nikotin for at replikere nikotineksponering hos mennesker, der ryger. Derefter fandt silicaeksponering sted fra dag 5 til dag 19 for at efterligne silicaeksponering i et arbejdsmiljø for personer med en historie med rygning.
Alveolære makrofager er kendt for at spille en væsentlig rolle i reguleringen af lungebetændelse og fibrose. Makrofager kan ikke nedbryde silica ved indånding af silica, hvilket fører til makrofagpolarisering eller apoptose9 og frigivelse af cytokiner såsom tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) og transformerende vækstfaktor beta (TGF-β). M1-makrofager, der identificeres ved tilstedeværelsen af overflademarkøren CD86, er de primære anstiftere af det inflammatoriske respons i silikose, mens M2-makrofager, der er markeret med CD206, er ansvarlige for den fibrotiske fase af tilstanden10. I dobbelteksponerede mus inducerede nikotin polariseringen af makrofager mod M2-fænotypen i silicaskadede lunger og fremmede således lungefibrose. Desuden er TGF-β1 nøglen til induktion af fibrose og EMT11; den øgede ekspression af TGF-β1 fremskyndede progressionen af lungefibrose gennem EMT. Denne model analyserede med succes nikotins virkninger på silikose og fremhævede yderligere vigtigheden af nikotinophør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i henhold til retningslinjerne udstedt af National Institutes of Health's Guide for Care and Use of Laboratory Animals (den 8. udgave af NRC) og blev godkendt af Anhui University of Science and Technology Animal Ethics Committee.
1. Tilberedning af dyr
- Hus 32 C57/BL6-hanmus i alderen 8 uger i et laboratorium med en 12 timers lys/mørk cyklus. Sørg for, at musene har fri adgang til mad og vand.
- Efter 2 ugers akklimatisering til miljøet, når de 10 uger gamle mus vejer 23-26 g, skal du bruge tilfældige tal genereret af en computer til tilfældigt at gruppere dyrene uden opdeling, hvilket resulterer i fire grupper af mus: kontrolgruppen (Con), nikotingruppen (Nic), silicagruppen (SiO 2) og nikotinen kombineret med silicagruppen (Nic + SiO2).
2. Nikotinpræparation
BEMÆRK: Nikotindensiteten er 1,01 g / ml.
- Nikotinen opløses i vandfri ethanol, og der fortyndes 20x for at fremstille en nikotinstamopløsning på 50 mg/ml.
- Nikotinstamopløsningen fortyndes 1.000x med steril normal saltvand for at lave en arbejdsløsning i en koncentration på 0,05 mg/ml.
BEMÆRK: Opbevar nikotin væk fra lys. Stamopløsningen kan opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
3. Silika-præparat
- Suspender steril krystallinsk silica i saltvand for at forberede en 20 mg / ml silicasuspension, og sving den i et ultralydsrystende vandbad i 25 minutter.
- Ryst silicasuspensionen med en hvirveloscillator i 3 minutter, før musene modtager næsedryppet. Silikasuspensionen blandes ved pipettering 2x-3x op og ned med en 200 μL pipette, og tag derefter 50 μL op til næsedryppet.
BEMÆRK: Siliciumdioxidsuspensionen skal blandes og administreres via næsedrop så hurtigt som muligt.
4. Musefangst og nikotineksponering
- Vej musene, og registrer vægtene dagligt før eksponering.
- På dag 1-40 injiceres nikotin subkutant to gange dagligt (med 12 timers mellemrum) i musene i Nic- og Nic+ SiO2-grupperne . Brug en nikotindosis på 0,25 mg/kg; Sørg for eksempel for, at en mus, der vejer 25 g, modtager 6,25 μg nikotin. For denne mus ville injektionsvolumenet være som følger: 6,25/0,05 = 125 μL. Samtidig injiceres musene i Con-gruppen med et lige så stort volumen saltvand.
- Forbered de nødvendige 1 ml sprøjter til hver gruppe, og brug dem til at opsuge injektionsvolumenet af nikotin eller saltvand. Før nikotinen tages op, skal du først trække 0,1-0,2 ml luft ind i sprøjten og derefter trække 125 μL nikotin op. Bank let på sprøjten for at fylde kanylen og forenden af sprøjten med nikotinen. Anbring den nikotinholdige sprøjte i en bakke, der er beskyttet mod lys.
BEMÆRK: På injektionstidspunktet er der 0,1-0,2 ml luft bag nikotinen, hvilket garanterer, at al væsken administreres med succes til musen. - Tag fat i musens hale med højre hånd, og når dyret slapper af, skal du bruge venstre tommelfinger og pegefinger til at trykke huden på bagsiden af nakken fra halen til hovedet op til kanten af øret og anvende moderat tryk. Derefter frigøres højre hånd, og brug venstre lille tommelfinger og ringfinger til at klemme halen og bagbenene, hvorefter musen bliver fuldstændig immobiliseret af venstre hånd.
BEMÆRK: Tag fat i musen med passende kraft. Utilstrækkelig styrke gør det let for mus at bide, mens overdreven styrke kan resultere i kvælning af musene. - Brug højre hånd til at injicere, punktere huden på bagsiden af nakken nær musenes ørekant i hoved-til-hale retning med sprøjten og injicere med nikotin med en ensartet hastighed. Se efter en halvcirkelformet hudbule, der indikerer en vellykket injektion.
BEMÆRK: Når nålen er punkteret i huden, vil der være en følelse af modstand; Modstanden forsvinder, når nålen er blevet indsat. På dette tidspunkt skal nålen trækkes lidt tilbage for at injicere langsomt og jævnt.
5. Silikaeksponering in vivo
- På dag 5-19 indføres siliciumdioxidsuspensionen i næsehulen hos musene i SiO 2 og Nic + SiO2 grupperne. Hver mus bedøves hurtigt med 2% isofluran i en anæstesimaskine i en dosis på 3,6 ml/time. Efter anæstesi skal du placere musen på håndfladen og udsætte musens næsehulrum. Indsæt 50 μL silicasuspension i næsehulen inden for 4-8 s.
- For at lade silicasuspensionen komme ind i lungerne så hurtigt som muligt, efter indånding, skal du trykke musens hjerte forsigtigt med pegefingeren i 3-5 s, 3x-5x per sekund, for at fremme respirationsfrekvensen.
- Når musens åndedræt gradvist bliver ensartet, skal du placere musen i et bur for at observere i 3 minutter.
- For alle mus, der modtager silicasuspensionen, gentages trin 1-3. I kontrolgruppen indlægges 50 μL sterilt saltvand i næsehulen på dag 5-19.
6. Erhvervelse af frisk og fast lungevæv
- På dag 41 skal du bruge 50 mg / kg natriumpentobarbital til at bedøve musene intraperitonealt i en dosis på 0,1 ml / 20 g i henhold til deres kropsvægt. Fastgør lemmerne på en skumtestplade, og sprøjt pelsen med 75% alkohol.
- Udfør hjerteperfusion for at opnå frisk lungevæv, skær midterlinjen af maven for at udsætte brysthulen og lav en lille åbning i toppen af højre hjerte. Derefter injiceres 20 ml forkølet fosfatbufret saltvand (PBS) langsomt og jævnt fra toppen af venstre hjerte, hvilket får blodet til at strømme ud fra åbningen skabt ved toppen af højre hjerte. Tag hele lungelappen ud, læg den i et forkølet 1,5 ml centrifugerør og overfør til -80 °C til opbevaring i afventning af proteinekstraktion.
- Perfus andre mus med 20 ml forkølet PBS efterfulgt af 10 ml 4% paraformaldehyd på samme sted for at fiksere hele lunger; bevare hver lunge i 30 ml 4% PFA.
- Efter 72 timer indlejres det faste lungevæv i paraffin.
- Dyp lungevævet i det forberedte fikseringsmiddel i et ultralydsvandbad ved 40 ° C i 30 minutter efterfulgt af en dehydreringsproces i 75% ethanol, 95% ethanol og vandfri ethanol i 50 minutter hver.
- Vask 2x med xylen i 50 min hver.
- Vævet anbringes i smeltet paraffinvoks ved 55-60 °C i 2-3 timer, således at xylen i lungevævet gradvist erstattes af paraffinvoks.
- Fastgør lungevævet i indlejringsrammen med paraffin, og vent på, at voksblokken hærder. Når voksblokken er hærdet, skal du bruge paraffinsektioneringsmaskinen til at skære lungen ved 4-5 μm.
- Placer lungesektionerne i ultrarent vand ved 45 °C. Når paraffinen er smeltet, skal du indlæse lungesektionen på et vedhæftende mikroskopglas.
7. Hæmatoxylin og eosin (HE) farvning
- Bag objektglassene ved 60 °C i 2 timer, og læg objektglassene i xylen for at afvokse i 2 x 30 min. Derefter placeres diasene i vandfri ethanol, 95% ethanol, 85% ethanol og 75% ethanol i 5 minutter hver. Til sidst vaskes de i 3 x 5 min med ultrarent vand.
- Drop 50 μL hæmatoxylinfarvningsopløsning på lungevævet med en pipettepistol og pletter i 5 minutter; Vask derefter skiverne med rindende vand i 5 min.
- Tilsæt 50 μL 2% saltsyre i ethanol på sektionen, og skyl med destilleret vand i 30 sekunder. Derefter tilsættes 50 μL eosinfarvningsopløsning på lungevævet for at plette i 1 min.
- Dehydrere, gennemsigtige og forsegle paraffinsektionerne.
- Tilsæt 100-150 ml 75% ethanol, 85% ethanol, 95% ethanol, vandfri ethanol og xylen i en kombineret plastfarvetank. Placer diasene i 75%, 85%, 95% og vandfri ethanol i 5 minutter hver for at dehydrere.
- Placer derefter diasene i xylen i 5 minutter for at gennemsigtige.
- Til sidst skal du slippe 20 μL neutralt tyggegummi på lungesektionen og placere et dæksel over diaset for at forsegle det.
BEMÆRK: Ovenstående trin udføres ved stuetemperatur.
8. Masson-farvning
- Afvoks, fugt og vask paraffinsektionerne som beskrevet i trin 7.1.
- Plet sektionerne med 50 μL konfigureret Weigerts hæmatoxylinfarvningsopløsning i 7 minutter efterfulgt af 50 μL sur ethanolfraktioneringsopløsning i 10 s, og vask med rindende vand for at gøre kernerne blå.
- Plet sektionerne med 50 μL Masson trichrome opløsning i 4 min, og vask med vand.
- Skyl sektionerne med destilleret vand i 1 min, og pletter derefter med Lichun rød syre magenta i 7 min.
- Vask sektionerne med en svag syrearbejdsopløsning (30% saltsyre) i 1-2 min, phosphomolybdicsyreopløsning i 1-2 min og svag syrearbejdsopløsning i 1-2 min.
- Plet sektionerne i anilinblå farvningsopløsning i 2 min, og vask derefter med en svag syrearbejdsopløsning i 1 min.
- Dehydrering af sektionerne med 95% ethanol efterfulgt af vandfri ethanol i 1 s, gennemsigtighed med xylen i 1 s og forsegling til sidst med neutral harpiks som beskrevet i trin 7.4.
9. Immunhistokemi
- Skærene bages ved 60 °C i 6 timer. Afvoks, fugt og vask paraffinsektionerne som beskrevet i trin 7.1.
- Antigenudtagning: læg skiverne i en varmebestandig plastudskæringskasse, der indeholder tilstrækkelig citratantigenhentningsopløsning til at nedsænke skiverne og kog i 20-30 minutter.
- Afkøles til stuetemperatur, fjern sektionerne og skyl med deioniseret vand. Derefter blødlægges i blød i 2 x 5 minutter i PBS indeholdende 0,5% Tween-20 (PBST).
- Tegn en løkke nær lungesektionen på diaset med en hydrofob pen for at danne en hydrofob cirkel.
- Der tilsættes dråbevis 50 μL 3% hydrogenperoxidopløsning (3%H2O2) til skiverne, og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur beskyttet mod lys til inaktivering af endogen peroxidase.
- Læg skiverne i blød i PBST i 3 x 5 min.
- Tilsæt 50 μL 5% bovin serumprotein (BSA)-PBST dråbevis til skiverne, og bloker i 1 time ved stuetemperatur.
- Den blokerende opløsning kasseres, 50 μL af de fortyndede primære antistoffer CD206 (fortynding: 1:1.500), TGF-β1 (fortynding: 1:200) og vimentin (fortynding: 1:2.000) hældes dråbevis i skiverne, og der inkuberes natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: I dette arbejde blev alle antistoffer fortyndet i 5% BSA. - Den næste dag returneres skiverne til stuetemperatur (40 min). Vask skiverne som beskrevet i trin 9.6.
- Fortynd det sekundære antistof i 5% BSA. Tilsæt 50 μL peberrodsperoxidasemærket sekundært antistof (fortynding: 1:500) dråbevis, og inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Vask skiverne som beskrevet i trin 9.6.
- Der nedkastes 50 μL 3,3'-diaminobenzidin (DAB)-opløsning svarende til det enzymmærkede sekundære antistof på lungevævet, og der inkuberes i 5-10 minutter i en sort immunhistokemisk vådboks. Overhold under mikroskopet, indtil farven udvikler sig til en stærk brun. Skyl skiverne med destilleret vand for at afslutte reaktionen.
BEMÆRK: Brunfarvning betragtes som positiv farvning. - Plet med 50 μL hæmatoxylinplet i 30 s, og vask med rindende vand. Derefter blødlægges skiverne i 75%, 85%, 95% og vandfri ethanol i 3 minutter hver og derefter i xylen i 2 x 10 minutter. Luk diasene som beskrevet i trin 7.4.
10. Western blot-analyse
- Tag lungevævet ud af fryseren, og vej det. Derefter tilsættes 150 μL RIPA lysisbuffer indeholdende PMSF pr. 20 mg lungevæv. Lyser muselungerne på is i 3-5 minutter ved hjælp af en håndholdt homogenisator, ryst forsigtigt i 2 timer ved 4 °C for at muliggøre tilstrækkelig lysering af lungevævet, centrifuger ved 4 °C og 14.800 × g i 15 minutter, og opsaml supernatanten.
BEMÆRK: Tilsæt 100 mM phenylmethanesulfonylfluorid (PMSF) et par minutter før brug af RIPA lysisbufferen. Den endelige koncentration af PMSF er 1 mM (f.eks. 10 μL PMSF + 990 μL RIPA). - Brug et BCA-proteinkoncentrationssæt til at bestemme proteinkoncentrationen af prøven ved at følge producentens anvisninger. Efter bestemmelse fortyndes den samme batch proteinlysat med RIPA til den mindste koncentration af proteinlysat under anvendelse af den mindste koncentration som base for at opnå samme masse og volumen.
BEMÆRK: Den samlede mængde lungevævsbelastning er 30 μg. - Tilsæt 40 μL 5x belastningsbuffer til 160 μL proteinlysat, og opvarm det ved 100 °C i 10 minutter.
- Saml den tilberedte 10% natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gel i det vestlige blottingelektroforesesystem, tilsæt SDS-PAGE-elektroforesebufferen, træk forsigtigt elektroforesekammen ud, og tilsæt 20 μL proteinprøve pr. Brønd langsomt og ensartet. Tænd for strømmen, og start elektroforesen ved 80 V i 30 min. Når proteinerne har nået det nedre gellag, skiftes til 100 V, og elektroforesen fortsættes i 60-70 min.
BEMÆRK: Elektroforese har brug for frisk elektroforesebuffer. - Overfør proteinerne til en PVDF-membran ved vådoverførsel. Aktivér PVDF-membranen med methanol på forhånd (5-30 s). Tag elektroforesegelpladen ud, lirk den forsigtigt op, placer separatorgelen i den våde overførselsbuffer, lav den elektriske overførselssandwich, og saml det våde overførselssystem. Fyld elektroforesetanken med overførselsbuffer, og overfør ved 400 mA i 90 minutter.
BEMÆRK: Overførselsbufferen afkøles på forhånd for at undgå virkningerne af høje temperaturer under vådoverførslen. - PVDF-membranen vaskes med Tris-bufret saltvand med 0,5% Tween-20 (TBST) i 3 x 5 min. Bloker PVDF-membranen med 5% skummetmælk fortyndet i TBST, og inkuber på en ryster ved stuetemperatur i 60 minutter; vask derefter med TBST i 2 min. Efter vask inkuberes membranen natten over ved 4 °C med det primære antistof vimentin (1:5.000) og GAPDH (1:10.000) fortyndet i 5% BSA.
- Placer membranen ved stuetemperatur i 30 min, og vask med TBST i 5 x 5 min. Efter vask inkuberes membranen med det sekundære antistof (1:10.000) fortyndet i 5% skummetmælk i 60 minutter ved stuetemperatur.
- Placer membranen med proteinsiden opad, slip den forberedte ECL-arbejdsløsning, inkuber i 1-2 min, og observer resultaterne med et gelkamera. Brug gråtoneværdierne målt af softwaren i gelbilledet til at evaluere proteinekspressionsniveauerne.
BEMÆRK: Her fungerede GAPDH som en intern reference.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En musemodel til undersøgelse af nikotin kombineret med silicaeksponering blev etableret for at undersøge nikotins potentielle rolle i udviklingen af silikose hos mus. Figur 1 viser den eksperimentelle procedure for anvendelse af en musemodel med dobbelt eksponering, som parrede en nikotininjektion med nasal instillation af en silicasuspension. De patologiske ændringer hos musene i hver gruppe blev observeret ved hjælp af HE-farvning. Musene udsat for nikotin kombineret med silica havde signifikant mere alvorlige lungeskader end dem, der blev udsat for nikotin eller silica alene. Lymfocytter steg nær lymfekarrene i lungerne hos de nikotineksponerede mus og dannede inflammatoriske celleklynger. Massonfarvning afslørede en signifikant stigning i kollagenfiberaflejring i lungerne udsat for nikotin kombineret med silica sammenlignet med lungerne i de andre grupper, og dette blev understøttet af Masson-farvningskvantifikationen (figur 2). Den alveolære struktur blev ødelagt i de silicaeksponerede mus, og antallet af makrofager steg. Efter eksponering for nikotin kombineret med silica var der imidlertid signifikant inflammatorisk celleinfiltration, og fibroblastknuder dukkede op. Derudover akkumulerede makrofager, især M2-makrofager, til stede i den dobbelteksponerede gruppe. M2 makrofager er afgørende for det avancerede fibrotiske stadium af silikose.
Derudover blev en signifikant stigning i den profibrotiske faktor TGF-β1 observeret ved immunohistokemisk (IHC) farvning i lungerne hos dobbelteksponerede mus, især i inflammatoriske celler nær lymfekar (figur 3). TGF-β1 udskilt af makrofager fremmer EMT af epitelceller og lungefibrose12. Sammenlignet med mus udsat for silica alene, var vimentinniveauerne signifikant forhøjede i lungerne hos mus med dobbelt eksponering. Både IHC-farvning og proteinkvantificering indikerede alvorlig EMT hos dobbelteksponerede mus (figur 4). De kombinerede beviser tyder på, at kronisk silicaeksponering fremmer EMT efter opregulering af TGF-β1, hvilket fører til en stigning i fibroblaster og progressiv fibrose. Samtidig accelererer tilsætningen af nikotin processen med lungefibrose ved at forværre EMT, hvilket gør det muligt for lungefibrose at forekomme tidligere. Denne model er designet til at undersøge nikotins indvirkning på lungefibrose, som er en konsekvens af kronisk silicaeksponering hos mennesker.
Figur 1: Design af en eksperimentel model for kombineret eksponering for nikotin og silica hos mus. Kontinuerlig injektion af nikotin i 1-40 dage og kontinuerlig nasal instillation af silica i 5-19 dage. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nikotin fremmer dannelsen af fibroblastiske masser i lungerne hos silicaeksponerede mus. (A) HE-farvning blev brugt til at visualisere patologiske ændringer i lungerne. De dobbelteksponerede mus havde alvorlig inflammatorisk celleinfiltration og fibrose. De grønne pile angiver inflammatoriske cellemasser. Skalastang = 50 μm. (B) Massonfarvning blev brugt til at vise kollagenfibre i lungerne. Skalastang = 50 μm. (C) Kvantificering af kollagenfibre i lungerne. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Forhøjede CD206-positive celler og TGF-β1 i lungerne hos nikotin og silica dobbelteksponerede mus. (A) IHC-farvning af CD206 blev brugt til at observere fordelingen og ekspressionen af makrofager i de dobbelteksponerede mus. CD206-positive makrofager steg i lungerne hos mus efter kombineret nikotin- og silicaeksponering. De korte pile repræsenterer CD206-positive celler. Skalastang = 50 μm. (B) TGF-β1, en promotor af fibrose, blev forhøjet i dobbelteksponerede mus. De lange pile repræsenterer TGF-β1-positive celler. Skalabjælke = 50 μm. (C,D) AOD af CD206 og TGF-β1. AOD = IOD (integreret optisk tæthed)/areal. AOD afspejler koncentrationen af CD206 og TGF-β1 pr. arealenhed. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Forkortelser: TGF-β1 = transformerende vækstfaktor-beta; IHC = immunhistokemi; AOD = gennemsnitlig optisk tæthed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Fremme af lungefibrose med nikotin hos silicaeksponerede mus gennem forværring af EMT. (A) Ekspressionen af vimentin i hver gruppe blev observeret ved IHC-farvning. Vimentin blev stærkt udtrykt i lungerne hos de mus, der blev udsat for nikotin og silica. Skalabjælke = 50 μm.(B) Western blottelse af vimentinekspression i hver eksponeringsgruppe med en stigning i vimentin i lungevævet hos dobbelteksponerede mus. (C) AOD-værdien af vimentin var signifikant højere i den dobbelteksponerede gruppe sammenlignet med de andre grupper. (D) Det relative proteinekspressionsniveau for vimentin sammenlignet med GAPDH. Vimentinekspressionen i dobbelteksponeringsgruppen var signifikant højere end i nikotin- eller silicaeksponeringsgrupperne. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Forkortelser: EMT = epitel-mesenkymal overgang; AOD = gennemsnitlig optisk tæthed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En dyremodel med dobbelt eksponering er nødvendig for at undersøge rollen og de potentielle mekanismer for samtidig eksponering for nikotin og krystallinsk siliciumdioxid. Denne model blev opnået i dette arbejde gennem subkutan injektion af nikotin og næsedråben af silica. For at sikre en vellykket nikotininjektion skal operatøren blive fortrolig med at gribe musene, da det kan være smertefuldt for dem at gribe fat i huden bag på nakken. Derfor er det vigtigt at lade musene gradvist tilpasse sig grebet. Derudover er et kritisk trin i silicaeksponering hos mus næsedryppet. For at øge procedurens succes og musenes overlevelsesrate er det vigtigt at øve næsedryppet på forhånd.
Når injektionen udføres, skal sprøjten skummes over musens hoved for at undgå en stærk kamp, når musen ser sprøjten. Musens hale skal gribes fast med højre hånd, mens venstre hånd skal bruges til at skubbe huden forsigtigt og forsigtigt op til ørekanten bag på nakken og klemme huden der. Efter frigivelse af musens hale med højre hånd skal halen og bagbenene stabiliseres ved hjælp af venstre tommelfinger og ringfinger for at forhindre bidning. Med en 1 ml sprøjte i højre hånd skal nålen stikkes ind i den løse hud over halsen i en vinkel på 30° i retning fra hoved til hale. Kanylen skal trækkes lidt tilbage, efter at modstanden er tabt, og injektionen skal indgives langsomt og jævnt. På dag 5-19 blev mus i den dobbelteksponerede gruppe udsat for nikotin og silica. Det anbefales, at nikotinen injiceres kl. 08:00, efterfulgt af næsedryp af siliciumdioxid kl. 14:00 og en anden injektion af nikotin kl. 20:00. De to nikotininjektioner skal gives med 12 timers mellemrum for at undgå virkningerne af gentagen greb på musene.
Udførelse af subkutane injektioner og næsedryp giver flere tekniske udfordringer. Ved subkutane injektioner skal musene gribes med passende kraft. Hvis huden på bagsiden af nakken klemmes for stramt, blokeres musens luftveje, hvilket hurtigt fører til kvælning. For optimal styrke skal huden bag på nakken klemmes, indtil øjenkuglerne stikker lidt ud. På dette tidspunkt føler musen den laveste smerte og trækker vejret glat. Derudover skal en 1 ml sprøjte, der tømmes for luft, bruges til at trække nikotininjektionen ud af røret efterfulgt af yderligere 0,1-0,2 ml luft. Før injektion skal boblerne forsigtigt svirpes ud. På grund af injektionens lille volumen kan nikotinen, der er tilbage ved spidsen af nåleenden, føre til en utilstrækkelig dosis. De vigtigste dele af injektionen er at indsætte nålen hurtigt, injicere nikotinen langsomt og fjerne nålen forsigtigt. For næsedryp blev musenes næsehule i denne undersøgelse fuldt eksponeret under dyb anæstesi efterfulgt af langsom og ensartet instillation af en siliciumdioxidsuspension. Det er også vigtigt at forsigtigt trykke på brysthulen efter silicaeksponering for at undgå hoste eller kvælning.
Denne model har visse begrænsninger. De 1-5 μm silicapartikler, der blev anvendt i forsøgene, blev ikke indsamlet fra miljøet og var rene silicapartikler. I modsætning hertil kan arbejdstagere i faktiske erhvervsmæssige miljøer blive udsat for en række farlige materialer, ikke kun silicapartikler, såsom en blanding af kul og silicastøv i en keramisk fabrik eller en kulmine. Vi brugte nasal instillation silica til at opnå lave doser og gentagne flere eksponeringer for at simulere kronisk eksponering af arbejdstagere. I musemodellen med dobbelt eksponering, selvom nikotinen ikke kommer fra cigaretrøgeksponering, kommer den injicerede nikotin direkte ind i blodbanen, hvilket giver mulighed for en mere fokuseret udforskning af nikotins rolle i silikoseprocessen og undgåelse af virkningerne af andre komponenter i cigaretrøg.
Videnskabelig forskning i silikose har typisk brugt enkeltfaktormusemodeller, enten gennem indånding eller bronchial perfusion af silica, for at vurdere silicas rolle i udviklingen af sygdom. En alternativ tilgang er nasal instillation af siliciumdioxid, som er enkel og let og giver mulighed for etablering af gentagne og kroniske silicaeksponeringsmodeller13. Den veletablerede siliciumdioxid næsedrypmodel forårsager minimal skade på musene og kan kombineres med andre faktorer for at skabe en multifaktoriel eksponeret dyremodel. Derudover omfatter de vigtigste metoder til nikotineksponering hos mus nikotin i drikkevand, subkutan injektion af nikotin, nikotininfusion via osmotiske minipumper og eksponering for tobaksrøg14. Den subkutane injektion, der anvendes i dobbelteksponeringsmodellen, gør det muligt at fastsætte doseringen og timingen af nikotin præcist, hvilket sikrer, at hver mus administreres den samme dosis.
Kort sagt replikerer dyremodellen af nikotin i kombination med silicaeksponering et realistisk kronisk eksponeringsmønster, og denne model kan bruges til yderligere undersøgelser af nikotins indvirkning på inflammation og fibrose i udviklingen af silikose. Derudover tjener denne model som grundlag for at danne en dyremodel med dobbelt eksponering med flere doser og tidsrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af University Synergy Innovation Program i Anhui-provinsen (GXXT-2021-077) og Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S.
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
