Summary
Diese Studie beschreibt ein Mausmodell, um die synergistische Wirkung von Nikotin auf das Fortschreiten der Lungenfibrose bei experimentellen Silikose-Mäusen zu untersuchen. Das Dual-Expositions-Mausmodell simuliert das pathologische Fortschreiten in der Lunge nach gleichzeitiger Exposition gegenüber Nikotin und Kieselsäure. Die beschriebenen Methoden sind einfach und hochgradig reproduzierbar.
Abstract
Rauchen und die Exposition gegenüber Kieselsäure sind bei Berufstätigen weit verbreitet, und Kieselsäure schädigt die Lunge von Rauchern eher als von Nichtrauchern. Die Rolle von Nikotin, dem primären süchtig machenden Inhaltsstoff von Zigaretten, bei der Entwicklung von Silikose ist unklar. Das in dieser Studie verwendete Mausmodell war einfach und leicht zu kontrollieren und simulierte effektiv die Auswirkungen der chronischen Nikotinaufnahme und der wiederholten Exposition gegenüber Kieselsäure auf die Lungenfibrose durch epithelial-mesenchymalen Übergang beim Menschen. Darüber hinaus kann dieses Modell bei der direkten Untersuchung der Auswirkungen von Nikotin auf Silikose helfen und gleichzeitig die Auswirkungen anderer Komponenten im Zigarettenrauch vermeiden.
Nach der Anpassung an die Umwelt wurden den Mäusen über 40 Tage morgens und abends im Abstand von 12 h 0,25 mg/kg Nikotinlösung subkutan in die lose Haut über dem Hals injiziert. Zusätzlich wurde kristallines Siliciumdioxidpulver (1-5 μm) in normaler Kochsalzlösung suspendiert, auf eine Suspension von 20 mg/ml verdünnt und unter Verwendung eines Ultraschallwasserbades gleichmäßig dispergiert. Die mit Isofluran betäubten Mäuse atmeten 50 μl dieser Quarzstaubsuspension durch die Nase ein und wurden durch eine Brustmassage geweckt. Die Kieselsäure-Exposition wurde täglich an den Tagen 5-19 verabreicht.
Das doppelt exponierte Mausmodell wurde Nikotin und dann Kieselsäure ausgesetzt, was mit der Expositionsgeschichte von Arbeitern übereinstimmt, die beiden schädlichen Faktoren ausgesetzt waren. Darüber hinaus förderte Nikotin die Lungenfibrose durch epithelial-mesenchymale Transformation (EMT) bei Mäusen. Dieses Tiermodell kann verwendet werden, um die Auswirkungen mehrerer Faktoren auf die Entwicklung von Silikose zu untersuchen.
Introduction
Die Exposition von Arbeitnehmern gegenüber Kieselsäure ist in einigen beruflichen Umgebungen unvermeidlich, und sobald sie Kieselsäure ausgesetzt sind, schreitet die Verschlechterung auch nach der Entfernung aus der Umwelt voran. Darüber hinaus rauchen die meisten dieser Arbeiter, und herkömmliche Zigaretten enthalten Tausende von Chemikalien, wobei die wichtigste süchtig machende Komponente Nikotin1 ist. E-Zigaretten werden in jüngeren Altersgruppen immer beliebter2; Diese E-Zigaretten fungieren als Nikotinabgabesystem und erhöhen den Nikotinzugang, wodurch die Lungenanfälligkeit und Lungenentzündung erhöhtwerden 3. Zigarettenrauch beschleunigt auch die Lungenfibrose bei Bleomycin-exponierten Mäusen4 und erhöht die pulmonale Toxizität und Fibrose bei Kieselsäure-exponierten Mäusen 5,6. Ob Nikotin jedoch den durch Kieselsäure verursachten Entzündungs- und Lungenfibroseprozess beeinflussen kann, muss noch untersucht werden.
Das Silikose-Mausmodell, das durch die einmalige Inhalation einer hohen Dosis Kieselsäure in die Luftröhre entsteht, ist für Mäuse traumatisch. Obwohl diese Methode schnell ein Silikose-Modell liefert, entspricht sie nicht der Realität einer Umgebung, in der Arbeiter wiederholt Kieselsäure ausgesetzt sind. Daher etablierten wir ein Kieselsäure-exponiertes Mausmodell, indem wir wiederholt eine niedrige Dosis Kieselsäure-Suspensionen über einen Nasentropf verabreichten; Diese Dosis kann bei Mäusen Entzündungen und Fibrose verursachen.
Um die Wirkung anderer Zigarettenbestandteile zu umgehen, wurde diesem Mausmodell subkutan Nikotin in die lose Haut des Halses injiziert, um die Wirkung der süchtig machenden Komponente Nikotin auf die Silikose zu bestimmen. Durch die Verabreichung von subkutanen Injektionen kann eine genaue Dosierung erreicht werden, wodurch es möglich ist, Nikotinexpositionsmodelle zu erstellen und Dosis-Toxizitäts-Reaktionen sowie Sucht zu beobachten. An männlichen Mäusen wurde ein Nikotinabhängigkeitsmodell mit einer Nikotininjektionsdosis von 0,2-0,4 mg/kg entwickelt 7,8. In diesem Modell wurden zwei subkutane Injektionen im Abstand von 12 Stunden verabreicht, um den Bedarf der süchtigen Mäuse bei der Drogensuche zu decken. Dieses Nikotinabhängigkeitsmodell der Maus ist nützlich, um die Rauchgewohnheiten des Menschen und die Exposition gegenüber Kieselsäure zu simulieren.
Einfaktor-Tiermodelle haben Einschränkungen in Krankheitsstudien, während die hier beschriebene Methode ein Zwei-Faktoren-Mausmodell der Nikotin- und Kieselsäure-Koexposition beinhaltet. Vor der Kieselsäure-Exposition wurden die Mäuse Nikotin vorexponiert, um die Nikotinexposition bei Rauchern zu replizieren. Anschließend fand von Tag 5 bis Tag 19 eine Kieselsäure-Exposition statt, um die Kieselsäure-Exposition in einer Arbeitsumgebung für Personen mit einer Vorgeschichte des Rauchens zu imitieren.
Es ist bekannt, dass Alveolarmakrophagen eine wichtige Rolle bei der Regulation von Lungenentzündungen und -fibrose spielen. Makrophagen können Kieselsäure beim Einatmen von Kieselsäure nicht abbauen, was zu einer Makrophagenpolarisation oder Apoptose9 und der Freisetzung von Zytokinen wie Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und transformierendem Wachstumsfaktor beta (TGF-β) führt. M1-Makrophagen, die durch das Vorhandensein des Oberflächenmarkers CD86 identifiziert werden, sind die primären Auslöser der Entzündungsreaktion bei Silikose, während M2-Makrophagen, die durch CD206 markiert sind, für die fibrotische Phase der Erkrankung verantwortlich sind10. In doppelt exponierten Mäusen induzierte Nikotin die Polarisation von Makrophagen in Richtung des M2-Phänotyps in Kieselsäure-geschädigten Lungen und förderte so die Lungenfibrose. Darüber hinaus ist TGF-β1 der Schlüssel zur Induktion von Fibrose und EMT11; Die erhöhte Expression von TGF-β1 beschleunigte das Fortschreiten der Lungenfibrose durch EMT. Dieses Modell analysierte erfolgreich die Auswirkungen von Nikotin auf Silikose und unterstrich die Bedeutung der Nikotinentwöhnung.
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Protocol
Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (der 8. Ausgabe des NRC) durchgeführt und von der Tierethikkommission der Anhui University of Science and Technology genehmigt.
1. Zubereitung von Tieren
- 32 männliche C57/BL6-Mäuse im Alter von 8 Wochen in einem Labor mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse freien Zugang zu Futter und Wasser haben.
- Nach 2 Wochen der Eingewöhnung an die Umgebung, wenn die 10 Wochen alten Mäuse 23-26 g wiegen, verwenden Sie von einem Computer generierte Zufallszahlen, um die Tiere ohne Partitionierung nach dem Zufallsprinzip zu gruppieren, was zu vier Gruppen von Mäusen führt: die Kontrollgruppe (Con), die Nikotingruppe (Nic), die Silica-Gruppe (SiO 2) und das Nikotin in Kombination mit der Silica-Gruppe (Nic+ SiO2).
2. Nikotin-Zubereitung
HINWEIS: Die Nikotindichte beträgt 1,01 g/ml.
- Lösen Sie das Nikotin in wasserfreiem Ethanol auf und verdünnen Sie es 20x, um eine Nikotinstammlösung von 50 mg/ml herzustellen.
- Verdünnen Sie die Nikotinstammlösung 1.000x mit steriler normaler Kochsalzlösung, um eine Arbeitslösung mit einer Konzentration von 0,05 mg/ml herzustellen.
HINWEIS: Bewahren Sie Nikotin vor Licht geschützt auf. Die Stammlösung kann bei 4 °C bis zu 1 Woche gelagert werden.
3. Herstellung von Kieselsäure
- Sterile kristalline Kieselsäure in Kochsalzlösung suspendieren, um eine 20 mg/ml-Kieselsäure-Suspension herzustellen, und 25 Minuten lang in einem Ultraschall-Schüttelwasserbad oszillieren.
- Schütteln Sie die Silica-Suspension mit einem Vortex-Oszillator 3 Minuten lang, bevor die Mäuse den Nasentropf erhalten. Mischen Sie die Kieselsäuresuspension, indem Sie 2x-3x mit einer 200-μl-Pipette auf und ab pipettieren, und nehmen Sie dann 50 μl für den Nasentropf auf.
HINWEIS: Die Siliciumdioxid-Suspension sollte so schnell wie möglich gemischt und über einen Nasentropf verabreicht werden.
4. Mäusefang und Nikotinexposition
- Wiegen Sie die Mäuse und notieren Sie die Gewichte täglich vor der Exposition.
- An den Tagen 1-40 wird den Mäusen in den Gruppen Nic und Nic+ SiO2 zweimal täglich (im Abstand von 12 h) Nikotin subkutan injiziert. Verwenden Sie eine Nikotindosis von 0,25 mg/kg; Stellen Sie beispielsweise sicher, dass eine Maus mit einem Gewicht von 25 g 6,25 μg Nikotin erhält. Für diese Maus wäre das Injektionsvolumen wie folgt: 6,25/0,05 = 125 μl. Gleichzeitig injizieren Sie den Mäusen in der Con-Gruppe ein gleiches Volumen Kochsalzlösung.
- Bereiten Sie die erforderlichen 1-ml-Spritzen für jede Gruppe vor und saugen Sie damit das Injektionsvolumen von Nikotin oder Kochsalzlösung ab. Bevor Sie das Nikotin aufnehmen, ziehen Sie zuerst 0,1-0,2 ml Luft in die Spritze und dann 125 μl Nikotin. Klopfen Sie vorsichtig auf die Spritze, um die Nadel und das vordere Ende der Spritze mit dem Nikotin zu füllen. Legen Sie die nikotinhaltige Spritze in eine lichtgeschützte Schale.
HINWEIS: Zum Zeitpunkt der Injektion befinden sich 0,1-0,2 ml Luft hinter dem Nikotin, wodurch garantiert wird, dass die gesamte Flüssigkeit erfolgreich an die Maus verabreicht wird. - Fassen Sie den Schwanz der Maus mit der rechten Hand, und wenn sich das Tier entspannt, drücken Sie mit dem linken Daumen und Zeigefinger die Haut im Nacken vom Schwanz über den Kopf bis zum Rand des Ohres mit mäßigem Druck. Lassen Sie danach die rechte Hand los und kneifen Sie mit dem linken kleinen Daumen und Ringfinger in den Schwanz und die Hintergliedmaßen, woraufhin die Maus von der linken Hand vollständig bewegungsunfähig gemacht wird.
HINWEIS: Fassen Sie die Maus mit angemessener Kraft. Unzureichende Kraft macht es Mäusen leicht, zu beißen, während übermäßige Kraft zum Ersticken der Mäuse führen kann. - Mit der rechten Hand injizieren Sie mit der rechten Hand die Haut im Nacken in der Nähe des Ohrrandes der Mäuse in Kopf-zu-Schwanz-Richtung mit der Spritze und injizieren Sie Nikotin mit einer gleichmäßigen Geschwindigkeit. Achten Sie auf eine halbkreisförmige Hautwölbung, die auf eine erfolgreiche Injektion hinweist.
HINWEIS: Wenn die Nadel in die Haut gestochen ist, entsteht ein Gefühl des Widerstandes. Der Widerstand verschwindet nach dem Einführen der Nadel. An dieser Stelle muss die Nadel leicht zurückgezogen werden, um langsam und gleichmäßig zu injizieren.
5. Kieselsäure-Exposition in vivo
- An den Tagen 5-19 wird die Siliciumdioxid-Suspension in die Nasenhöhle der Mäuse der SiO2- und Nic+SiO2-Gruppen eingeträufelt. Jede Maus wird schnell mit 2 % Isofluran in einem Anästhesiegerät in einer Dosis von 3,6 ml/h anästhesiert. Legen Sie die Maus nach der Anästhesie auf die Handfläche einer Hand und legen Sie die Nasenhöhle der Maus frei. Instillieren Sie 50 μl Kieselsäuresuspension innerhalb von 4-8 s in die Nasenhöhle.
- Damit die Silica-Suspension so schnell wie möglich in die Lunge gelangen kann, drücken Sie nach dem Einträufeln 3-5x pro Sekunde mit dem Zeigefinger sanft auf das Herz der Maus, um die Atemfrequenz zu fördern.
- Nachdem die Atmung der Maus allmählich gleichmäßig geworden ist, setzen Sie die Maus in einen Käfig, um sie 3 Minuten lang zu beobachten.
- Wiederholen Sie für alle Mäuse, die die Silica-Suspension erhalten, die Schritte 1-3. In der Kontrollgruppe werden an den Tagen 5-19 50 μl sterile Kochsalzlösung in die Nasenhöhle eingeträufelt.
6. Gewinnung von frischem und fixiertem Lungengewebe
- An Tag 41 werden 50 mg/kg Natrium-Pentobarbital verwendet, um die Mäuse intraperitoneal in einer Dosis von 0,1 ml/20 g entsprechend ihrem Körpergewicht zu betäuben. Befestigen Sie die Gliedmaßen auf einer Schaumstofftestplatte und besprühen Sie das Fell mit 75%igem Alkohol.
- Führen Sie eine Herzperfusion durch, um frisches Lungengewebe zu erhalten, schneiden Sie die Mittellinie des Bauches durch, um die Brusthöhle freizulegen, und machen Sie eine kleine Öffnung an der Spitze des rechten Herzens. Injizieren Sie dann 20 ml vorgekühlte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) langsam und gleichmäßig von der Spitze des linken Herzens, wodurch das Blut aus der Öffnung an der Spitze des rechten Herzens abfließt. Nehmen Sie den gesamten Lungenlappen heraus, legen Sie ihn in ein vorgekühltes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und stellen Sie ihn zur Lagerung bis zur Proteinextraktion auf -80 °C.
- Andere Mäuse mit 20 ml vorgekühltem PBS gefolgt von 10 ml 4%igem Paraformaldehyd an der gleichen Stelle perfundieren, um die gesamte Lunge zu fixieren; Bewahren Sie jede Lunge in 30 ml 4% PFA auf.
- Nach 72 h wird das fixierte Lungengewebe in Paraffin eingebettet.
- Das Lungengewebe wird in einem Ultraschall-Wasserbad bei 40 °C für 30 min in das vorbereitete Fixiermittel getaucht, gefolgt von einem Dehydratisierungsprozess in 75 % Ethanol, 95 % Ethanol und wasserfreiem Ethanol für jeweils 50 min.
- 2x mit Xylol für je 50 min waschen.
- Legen Sie das Gewebe für 2-3 h bei 55-60 °C in geschmolzenes Paraffinwachs, damit das Xylol im Lungengewebe allmählich durch Paraffinwachs ersetzt wird.
- Fixieren Sie das Lungengewebe im Einbettrahmen mit Paraffin und warten Sie, bis der Wachsblock ausgehärtet ist. Nachdem der Wachsblock ausgehärtet ist, wird die Lunge mit der Paraffintrennmaschine bei 4-5 μm geschnitten.
- Die Lungenabschnitte werden in Reinstwasser bei 45 °C gelegt. Sobald das Paraffin geschmolzen ist, legen Sie den Lungenschnitt auf einen anhaftenden Objektträger.
7. Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung
- Die Objektträger bei 60 °C 2 h backen und die Objektträger zum Entwachsen 2 x 30 min in Xylol legen. Anschließend legen Sie die Objektträger für jeweils 5 Minuten in wasserfreies Ethanol, 95 % Ethanol, 85 % Ethanol und 75 % Ethanol. Zum Schluss 3 x 5 min mit Reinstwasser waschen.
- 50 μl Hämatoxylin-Färbelösung mit einer Pipettenpistole auf das Lungengewebe tropfen und 5 Minuten lang färben; Anschließend die Scheiben 5 Min. lang unter fließendem Wasser waschen.
- Geben Sie 50 μl 2%ige Salzsäure in Ethanol auf den Abschnitt und spülen Sie ihn 30 s lang mit destilliertem Wasser ab. Geben Sie dann 50 μl Eosin-Färbelösung auf das Lungengewebe, um es 1 Minute lang zu färben.
- Entwässern, transparentisieren und versiegeln Sie die Paraffinabschnitte.
- 100-150 ml 75%iges Ethanol, 85%iges Ethanol, 95%iges Ethanol, wasserfreies Ethanol und Xylol in einen kombinierten Kunststofffärbetank geben. Legen Sie die Objektträger für jeweils 5 Minuten in 75 %, 85 %, 95 % und wasserfreies Ethanol, um sie zu dehydrieren.
- Legen Sie dann die Objektträger für 5 Minuten in Xylol, um sie zu transparentisieren.
- Zum Schluss träufeln Sie 20 μl neutralen Kaugummi auf den Lungenabschnitt und legen Sie ein Deckglas über den Objektträger, um ihn zu versiegeln.
HINWEIS: Die oben genannten Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt.
8. Masson-Färbung
- Entwachsen, hydratisieren und waschen Sie die Paraffinabschnitte wie in Schritt 7.1 beschrieben.
- Die Schnitte werden 7 Minuten lang mit 50 μl konfigurierter Weigert-Hämatoxylin-Färbelösung gefärbt, gefolgt von 50 μl saurer Ethanol-Fraktionierungslösung für 10 s, und mit fließendem Wasser gewaschen, um die Zellkerne blau zu färben.
- Färben Sie die Abschnitte 4 Minuten lang mit 50 μl Masson Trichrom-Lösung und waschen Sie sie mit Wasser.
- Spülen Sie die Abschnitte 1 Minute lang mit destilliertem Wasser ab und färben Sie sie dann 7 Minuten lang mit Lichun Red Acid Magenta.
- Waschen Sie die Abschnitte mit einer schwach sauren Arbeitslösung (30%ige Salzsäure) für 1-2 Minuten, Phosphomolybdänsäurelösung für 1-2 Minuten und einer schwach sauren Arbeitslösung für 1-2 Minuten.
- Färben Sie die Abschnitte 2 Minuten lang in Anilinblau-Färbelösung und waschen Sie sie dann 1 Minute lang mit einer schwach sauren Arbeitslösung.
- Die Abschnitte werden 1 s lang mit 95%igem Ethanol gefolgt von wasserfreiem Ethanol entwässert, 1 s lang mit Xylol transparentisiert und schließlich mit neutralem Harz versiegelt, wie in Schritt 7.4 beschrieben.
9. Immunhistochemie
- Die Scheiben bei 60 °C 6 h backen. Entwachsen, hydratisieren und waschen Sie die Paraffinabschnitte wie in Schritt 7.1 beschrieben.
- Antigen-Retrieal: Legen Sie die Scheiben in eine hitzebeständige Kunststoff-Schneidebox, die genügend Citrat-Antigen-Rückgewinnungslösung enthält, um die Scheiben einzutauchen, und kochen Sie sie 20-30 Minuten lang.
- Auf Raumtemperatur abkühlen lassen, die Abschnitte entfernen und mit deionisiertem Wasser abspülen. Anschließend 2 x 5 Minuten in PBS mit 0,5 % Tween-20 (PBST) einweichen.
- Zeichne mit einem hydrophoben Stift eine Schlaufe in der Nähe des Lungenabschnitts auf dem Objektträger, um einen hydrophoben Kreis zu bilden.
- 50 μl 3%ige Wasserstoffperoxidlösung (3 %H2O2) tropfenweise zu den Scheiben geben und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren, um die endogene Peroxidase zu inaktivieren.
- Die Scheiben 3 x 5 Min. in PBST einweichen.
- 50 μl 5 % bovines Serumprotein (BSA)-PBST tropfenweise zu den Scheiben geben und 1 h bei Raumtemperatur blocken.
- Die Blockierungslösung wird verworfen, 50 μl der verdünnten Primärantikörper CD206 (Verdünnung: 1:1.500), TGF-β1 (Verdünnung: 1:200) und Vimentin (Verdünnung: 1:2.000) tropfenweise in die Scheiben gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert.
HINWEIS: In dieser Arbeit wurden alle Antikörper in 5% BSA verdünnt. - Am nächsten Tag die Scheiben wieder auf Raumtemperatur bringen (40 min). Waschen Sie die Scheiben wie in Schritt 9.6 beschrieben.
- Verdünnen Sie den sekundären Antikörper in 5% BSA. 50 μl Meerrettichperoxidase-markierter Sekundärantikörper (Verdünnung: 1:500) tropfenweise zugeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Scheiben wie in Schritt 9.6 beschrieben.
- 50 μl 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Lösung, die dem enzymmarkierten sekundären Antikörper entspricht, auf das Lungengewebe tropfen und 5-10 Minuten lang in einer schwarzen immunhistochemischen Nassbox inkubieren. Unter dem Mikroskop beobachten, bis sich die Farbe zu einem kräftigen Braun entwickelt. Spülen Sie die Scheiben mit destilliertem Wasser ab, um die Reaktion zu beenden.
HINWEIS: Braune Färbungen gelten als positive Färbung. - Mit 50 μl Hämatoxylin-Färbung 30 s lang färben und unter fließendem Wasser abwaschen. Als nächstes weichen Sie die Scheiben in 75 %, 85 %, 95 % und wasserfreiem Ethanol für jeweils 3 min und dann 2 x 10 min in Xylol ein. Versiegeln Sie die Objektträger wie in Schritt 7.4 beschrieben.
10. Western-Blot-Analyse
- Nehmen Sie das Lungengewebe aus dem Gefrierschrank und wiegen Sie es. Als nächstes fügen Sie 150 μl RIPA-Lysepuffer mit PMSF pro 20 mg Lungengewebe hinzu. Die Lunge der Maus wird mit einem Handhomogenisator 3-5 Minuten lang auf Eis lysiert, 2 h bei 4 °C vorsichtig geschüttelt, um eine ausreichende Lyse des Lungengewebes zu ermöglichen, 15 min bei 4 °C und 14.800 × g zentrifugiert und der Überstand aufgefangen.
HINWEIS: Fügen Sie 100 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) einige Minuten vor der Verwendung des RIPA-Lysepuffers hinzu. Die Endkonzentration von PMSF beträgt 1 mM (z. B. 10 μl PMSF + 990 μl RIPA). - Verwenden Sie ein BCA-Proteinkonzentrationskit, um die Proteinkonzentration der Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen. Nach der Bestimmung wird die gleiche Charge von Proteinlysat unter Verwendung der kleinsten Konzentration von Proteinlysat als Basis mit RIPA auf die kleinste Konzentration verdünnt, um die gleiche Masse und das gleiche Volumen zu erreichen.
HINWEIS: Die Gesamtmenge der Lungengewebebelastung beträgt 30 μg. - 40 μl 5-facher Ladepuffer zu 160 μl Proteinlysat geben und 10 Minuten lang bei 100 °C erhitzen.
- Montieren Sie das vorbereitete 10%ige Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gel (SDS-PAGE) in das Western-Blotting-Elektrophorese-System, fügen Sie den SDS-PAGE-Elektrophoresepuffer hinzu, ziehen Sie den Elektrophoresekamm vorsichtig heraus und fügen Sie langsam und gleichmäßig 20 μl Proteinprobe pro Vertiefung hinzu. Schalten Sie die Stromversorgung ein und starten Sie die Elektrophorese bei 80 V für 30 Minuten. Nachdem die Proteine die untere Gelschicht erreicht haben, schalten Sie auf 100 V um und setzen Sie die Elektrophorese für 60-70 Minuten fort.
HINWEIS: Für die Elektrophorese wird ein frischer Elektrophoresepuffer benötigt. - Übertragen Sie die Proteine per Nasstransfer auf eine PVDF-Membran. Aktivieren Sie die PVDF-Membran vorab mit Methanol (5-30 s). Nehmen Sie die Elektrophorese-Gelplatte heraus, hebeln Sie sie vorsichtig auf, legen Sie das Separatorgel in den Nasstransferpuffer, stellen Sie das elektrische Transfersandwich her und montieren Sie das Nasstransfersystem. Füllen Sie den Elektrophoresetank mit Transferpuffer und übertragen Sie ihn 90 Minuten lang bei 400 mA.
HINWEIS: Der Transferpuffer wird im Voraus gekühlt, um die Auswirkungen hoher Temperaturen während des Nasstransfers zu vermeiden. - Waschen Sie die PVDF-Membran mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,5 % Tween-20 (TBST) für 3 x 5 Minuten. Blockieren Sie die PVDF-Membran mit 5 % Magermilch, die in TBST verdünnt ist, und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang auf einem Schüttler bei Raumtemperatur. dann 2 Min. lang mit TBST waschen. Nach dem Waschen wird die Membran über Nacht bei 4 °C mit den Primärantikörpern Vimentin (1:5.000) und GAPDH (1:10.000) in 5 % BSA verdünnt inkubiert.
- Legen Sie die Membran 30 Minuten lang auf Raumtemperatur und waschen Sie sie 5 x 5 Minuten lang mit TBST. Nach dem Waschen wird die Membran mit dem Sekundärantikörper (1:10.000), der in 5%iger Magermilch verdünnt ist, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
- Platzieren Sie die Membran mit der Proteinseite nach oben, tropfen Sie die vorbereitete ECL-Arbeitslösung, inkubieren Sie 1-2 Minuten lang und beobachten Sie die Ergebnisse mit einem Gel-Imager. Verwenden Sie die von der Software gemessenen Graustufenwerte im Gel-Imager, um die Proteinexpressionsniveaus zu bewerten.
HINWEIS: Hier diente GAPDH als interne Referenz.
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Representative Results
Ein Mausmodell zur Untersuchung von Nikotin in Kombination mit Kieselsäureexposition wurde etabliert, um die potenzielle Rolle von Nikotin beim Fortschreiten der Silikose bei Mäusen zu untersuchen. Abbildung 1 zeigt das experimentelle Verfahren für die Verwendung eines Dual-Expositions-Mausmodells, bei dem eine Nikotininjektion mit der nasalen Instillation einer Silica-Suspension kombiniert wurde. Die pathologischen Veränderungen der Mäuse in jeder Gruppe wurden mittels HE-Färbung beobachtet. Die Mäuse, die Nikotin in Kombination mit Kieselsäure ausgesetzt waren, hatten signifikant schwerere Lungenschäden als diejenigen, die nur Nikotin oder Kieselsäure ausgesetzt waren. Lymphozyten vermehrten sich in der Nähe der Lymphgefäße in der Lunge der Nikotin-exponierten Mäuse und bildeten entzündliche Zellcluster. Die Masson-Färbung ergab einen signifikanten Anstieg der Kollagenfaserablagerungen in den Lungen, die Nikotin in Kombination mit Kieselsäure ausgesetzt waren, im Vergleich zu den Lungen in den anderen Gruppen, und dies wurde durch die Quantifizierung der Masson-Färbung unterstützt (Abbildung 2). Die Alveolarstruktur wurde in den Kieselsäure-exponierten Mäusen zerstört und die Anzahl der Makrophagen nahm zu. Nach der Exposition gegenüber Nikotin in Kombination mit Kieselsäure kam es jedoch zu einer signifikanten Infiltration von Entzündungszellen und es traten Fibroblastenknötchen auf. Darüber hinaus sind akkumulierte Makrophagen, insbesondere M2-Makrophagen, in der doppelt exponierten Gruppe vorhanden. M2-Makrophagen sind essentiell für das fortgeschrittene fibrotische Stadium der Silikose.
Darüber hinaus wurde ein signifikanter Anstieg des pro-fibrotischen Faktors TGF-β1 durch immunhistochemische (IHC) Färbung in der Lunge von doppelt exponierten Mäusen beobachtet, insbesondere in Entzündungszellen in der Nähe von Lymphgefäßen (Abbildung 3). TGF-β1, das von Makrophagen sezerniert wird, fördert die EMT von Epithelzellen und die Lungenfibrose12. Im Vergleich zu Mäusen, die nur Kieselsäure ausgesetzt waren, waren die Vimentin-Spiegel in der Lunge von Mäusen mit doppelter Exposition signifikant erhöht. Sowohl die IHC-Färbung als auch die Proteinquantifizierung deuteten auf eine schwere EMT bei doppelt exponierten Mäusen hin (Abbildung 4). Die kombinierten Beweise deuten darauf hin, dass eine chronische Kieselsäure-Exposition die EMT nach der Hochregulierung von TGF-β1 fördert, was zu einem Anstieg der Fibroblasten und einer fortschreitenden Fibrose führt. Gleichzeitig beschleunigt die Zugabe von Nikotin den Prozess der Lungenfibrose, indem sie die EMT verschlimmert, so dass die Lungenfibrose früher auftreten kann. Dieses Modell wurde entwickelt, um die Auswirkungen von Nikotin auf Lungenfibrose zu untersuchen, die eine Folge der chronischen Kieselsäureexposition beim Menschen ist.
Abbildung 1: Entwurf eines experimentellen Modells der kombinierten Exposition gegenüber Nikotin und Kieselsäure bei Mäusen. Kontinuierliche Injektion von Nikotin für 1-40 Tage und kontinuierliche nasale Instillation von Kieselsäure für 5-19 Tage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Nikotin fördert die Bildung von fibroblastischen Massen in der Lunge von Mäusen, die mit Kieselsäure exponiert wurden. (A) Die HE-Färbung wurde verwendet, um pathologische Veränderungen in der Lunge sichtbar zu machen. Die doppelt exponierten Mäuse wiesen eine schwere infiltrierende Entzündung und Fibrose auf. Die grünen Pfeile zeigen entzündliche Zellmassen an. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) Die Masson-Färbung wurde verwendet, um Kollagenfasern in der Lunge zu zeigen. Maßstabsbalken = 50 μm. (C) Quantifizierung von Kollagenfasern in der Lunge. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Erhöhte CD206-positive Zellen und TGF-β1 in der Lunge von Nikotin- und Kieselsäure-Doppel-exponierten Mäusen. (A) Die IHC-Färbung von CD206 wurde verwendet, um die Verteilung und Expression von Makrophagen in den dual-exponierten Mäusen zu beobachten. CD206-positive Makrophagen stiegen in der Lunge von Mäusen nach kombinierter Nikotin- und Kieselsäure-Exposition an. Die kurzen Pfeile stellen CD206-positive Zellen dar. Maßstabsbalken = 50 μm. (B) TGF-β1, ein Promotor der Fibrose, war bei doppelt exponierten Mäusen erhöht. Die langen Pfeile stellen TGF-β1-positive Zellen dar. Maßstabsbalken = 50 μm. (C,D) AOD von CD206 und TGF-β1. AOD = IOD (integrierte optische Dichte)/Fläche. Die AOD spiegelt die Konzentration von CD206 und TGF-β1 pro Flächeneinheit wider. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abkürzungen: TGF-β1 = transformierender Wachstumsfaktor-beta; IHC = Immunhistochemie; AOD = durchschnittliche optische Dichte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Förderung der Lungenfibrose durch Nikotin bei Kieselsäure-exponierten Mäusen durch die Verschlimmerung der EMT. (A) Die Expression von Vimentin in jeder Gruppe wurde durch IHC-Färbung beobachtet. Vimentin wurde in den Lungen der Mäuse, die Nikotin und Kieselsäure ausgesetzt waren, stark exprimiert. Skalenbalken = 50 μm.(B) Western-Blot der Vimentin-Expression in jeder Expositions-Gruppe, mit einem Anstieg von Vimentin im Lungengewebe von doppelt exponierten Mäusen. (C) Der AOD-Wert von Vimentin war in der doppelt exponierten Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen signifikant erhöhter. (D) Das relative Proteinexpressionsniveau von Vimentin im Vergleich zu GAPDH. Die Vimentin-Expression in der Doppel-Expositions-Gruppe war signifikant höher als in der Nikotin- oder Kieselsäure-Expositions-Gruppe. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abkürzungen: EMT = epithelial-mesenchymaler Übergang; AOD = durchschnittliche optische Dichte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Ein Tiermodell mit doppelter Exposition ist notwendig, um die Rolle und die möglichen Mechanismen der gleichzeitigen Exposition gegenüber Nikotin und kristallinem Siliziumdioxid zu untersuchen. Dieses Modell wurde in dieser Arbeit durch die subkutane Injektion von Nikotin und den nasalen Tropf von Kieselsäure erreicht. Um eine erfolgreiche Nikotininjektion zu gewährleisten, muss sich der Bediener mit dem Greifen der Mäuse vertraut machen, da das Greifen der Haut im Nacken für sie schmerzhaft sein kann. Daher ist es wichtig, dass sich die Mäuse allmählich an das Greifen gewöhnen können. Darüber hinaus ist ein kritischer Schritt bei der Exposition gegenüber Kieselsäure bei Mäusen der Nasentropf. Um den Erfolg des Eingriffs und die Überlebensrate der Mäuse zu erhöhen, ist es wichtig, den Nasentropf vorher zu üben.
Bei der Injektion sollte die Spritze über den Kopf der Maus geglitten werden, um einen starken Kampf zu vermeiden, wenn die Maus die Spritze sieht. Der Schwanz der Maus sollte mit der rechten Hand fest gefasst werden, während mit der linken Hand die Haut vorsichtig und vorsichtig bis zum Ohrrand im Nacken hochgeschoben und dort eingeklemmt werden sollte. Nach dem Loslassen des Mausschwanzes mit der rechten Hand sollten der Schwanz und die Hintergliedmaßen mit dem linken Daumen und Ringfinger stabilisiert werden, um ein Beißen zu verhindern. Mit einer 1-ml-Spritze in der rechten Hand sollte die Nadel in einem 30°-Winkel in Kopf-zu-Schwanz-Richtung in die lose Haut oberhalb des Halses eingeführt werden. Die Nadel sollte nach Verlust des Widerstandes leicht zurückgezogen und die Injektion langsam und gleichmäßig verabreicht werden. An den Tagen 5-19 wurden die Mäuse in der dual-exponierten Gruppe Nikotin und Kieselsäure ausgesetzt. Es wird empfohlen, das Nikotin um 08:00 Uhr zu injizieren, gefolgt von einem nasalen Tropf von Siliziumdioxid um 14:00 Uhr und einer weiteren Nikotininjektion um 20:00 Uhr. Die beiden Nikotininjektionen müssen im Abstand von 12 Stunden verabreicht werden, um die Auswirkungen des wiederholten Greifens auf die Mäuse zu vermeiden.
Die Durchführung von subkutanen Injektionen und Nasentropf bringt mehrere technische Herausforderungen mit sich. Bei subkutanen Injektionen sollten die Mäuse mit entsprechender Kraft gegriffen werden. Wenn die Haut im Nacken zu fest eingeklemmt wird, werden die Atemwege der Maus blockiert, was schnell zum Ersticken führt. Für eine optimale Festigkeit sollte die Haut im Nacken gekniffen werden, bis die Augäpfel leicht hervorstehen. Zu diesem Zeitpunkt verspürt die Maus den geringsten Schmerz und atmet gleichmäßig. Zusätzlich sollte eine 1-ml-Spritze, die von Luft entleert ist, verwendet werden, um die Nikotininjektion aus dem Röhrchen zu ziehen, gefolgt von weiteren 0,1-0,2 ml Luft. Vor der Injektion sollten die Blasen vorsichtig herausgeschnippt werden. Aufgrund des geringen Volumens der Injektion kann das an der Spitze des Nadelendes verbleibende Nikotin zu einer unzureichenden Dosis führen. Die wichtigsten Teile der Injektion sind das schnelle Einführen der Nadel, das langsame Injizieren des Nikotins und das vorsichtige Entfernen der Nadel. Für den Nasentropf wurde in dieser Studie die Nasenhöhle der Mäuse unter tiefer Anästhesie vollständig freigelegt, gefolgt von der langsamen und gleichmäßigen Instillation einer Siliziumdioxid-Suspension. Es ist auch wichtig, nach dem Kontakt mit Kieselsäure sanft auf die Brusthöhle zu drücken, um Husten oder Ersticken zu vermeiden.
Dieses Modell hat gewisse Einschränkungen. Die in den Experimenten verwendeten 1-5 μm Kieselsäurepartikel wurden nicht aus der Umwelt gesammelt und waren reine Kieselsäurepartikel. Im Gegensatz dazu können Arbeitnehmer in einem tatsächlichen Arbeitsumfeld einer Vielzahl von gefährlichen Stoffen ausgesetzt sein, nicht nur Kieselsäurepartikeln, wie z. B. einem Gemisch aus Kohle und Quarzstaub in einer Keramikfabrik oder einem Kohlebergwerk. Wir verwendeten Kieselsäure zur nasalen Instillation, um niedrige Dosen zu erreichen, und wiederholte Mehrfachexpositionen, um die chronische Exposition der Arbeiter zu simulieren. Obwohl das Nikotin im Doppel-Expositions-Mausmodell nicht aus der Exposition gegenüber Zigarettenrauch stammt, gelangt das injizierte Nikotin direkt in den Blutkreislauf, was eine gezieltere Untersuchung der Rolle von Nikotin im Silikoseprozess und die Vermeidung der Auswirkungen anderer Komponenten des Zigarettenrauchs ermöglicht.
Die wissenschaftliche Forschung zur Silikose hat in der Regel Einfaktor-Mausmodelle verwendet, entweder durch Inhalation oder Bronchialperfusion von Kieselsäure, um die Rolle von Kieselsäure bei der Entwicklung von Krankheiten zu bewerten. Ein alternativer Ansatz ist die nasale Instillation von Siliciumdioxid, die einfach und leicht ist und die Etablierung von wiederholten und chronischen Siliciumdioxid-Expositionsmodellen ermöglicht13. Das gut etablierte Siliziumdioxid-Nasentropfmodell verursacht minimale Schäden bei den Mäusen und könnte mit anderen Faktoren kombiniert werden, um ein multifaktoriell-exponiertes Tiermodell zu erstellen. Darüber hinaus umfassen die Hauptmethoden der Nikotinexposition bei Mäusen Nikotin im Trinkwasser, die subkutane Injektion von Nikotin, die Nikotininfusion über osmotische Minipumpen und die Tabakrauchexposition14. Die subkutane Injektion, die im Dual-Expositions-Modell verwendet wird, ermöglicht es, die Dosierung und den Zeitpunkt des Nikotins genau einzustellen, um sicherzustellen, dass jeder Maus die gleiche Dosis verabreicht wird.
Kurz gesagt, das Tiermodell von Nikotin in Kombination mit Kieselsäure-Exposition repliziert ein realistisches chronisches Expositionsmuster, und dieses Modell kann für weitere Untersuchungen zu den Auswirkungen von Nikotin auf Entzündungen und Fibrose bei der Entwicklung von Silikose verwendet werden. Darüber hinaus dient dieses Modell als Grundlage für die Bildung eines Tiermodells mit doppelter Exposition und mehreren Dosen und Zeitrahmen.
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Disclosures
Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom University Synergy Innovation Program der Provinz Anhui (GXXT-2021-077) und dem Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
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