Summary

Verwendung von Nikotin in einem Kieselsäure-exponierten Mausmodell zur Förderung des Übergangs von Lungenepithel zu mesenchym

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

Diese Studie beschreibt ein Mausmodell, um die synergistische Wirkung von Nikotin auf das Fortschreiten der Lungenfibrose bei experimentellen Silikose-Mäusen zu untersuchen. Das Dual-Expositions-Mausmodell simuliert das pathologische Fortschreiten in der Lunge nach gleichzeitiger Exposition gegenüber Nikotin und Kieselsäure. Die beschriebenen Methoden sind einfach und hochgradig reproduzierbar.

Abstract

Rauchen und die Exposition gegenüber Kieselsäure sind bei Berufstätigen weit verbreitet, und Kieselsäure schädigt die Lunge von Rauchern eher als von Nichtrauchern. Die Rolle von Nikotin, dem primären süchtig machenden Inhaltsstoff von Zigaretten, bei der Entwicklung von Silikose ist unklar. Das in dieser Studie verwendete Mausmodell war einfach und leicht zu kontrollieren und simulierte effektiv die Auswirkungen der chronischen Nikotinaufnahme und der wiederholten Exposition gegenüber Kieselsäure auf die Lungenfibrose durch epithelial-mesenchymalen Übergang beim Menschen. Darüber hinaus kann dieses Modell bei der direkten Untersuchung der Auswirkungen von Nikotin auf Silikose helfen und gleichzeitig die Auswirkungen anderer Komponenten im Zigarettenrauch vermeiden.

Nach der Anpassung an die Umwelt wurden den Mäusen über 40 Tage morgens und abends im Abstand von 12 h 0,25 mg/kg Nikotinlösung subkutan in die lose Haut über dem Hals injiziert. Zusätzlich wurde kristallines Siliciumdioxidpulver (1-5 μm) in normaler Kochsalzlösung suspendiert, auf eine Suspension von 20 mg/ml verdünnt und unter Verwendung eines Ultraschallwasserbades gleichmäßig dispergiert. Die mit Isofluran betäubten Mäuse atmeten 50 μl dieser Quarzstaubsuspension durch die Nase ein und wurden durch eine Brustmassage geweckt. Die Kieselsäure-Exposition wurde täglich an den Tagen 5-19 verabreicht.

Das doppelt exponierte Mausmodell wurde Nikotin und dann Kieselsäure ausgesetzt, was mit der Expositionsgeschichte von Arbeitern übereinstimmt, die beiden schädlichen Faktoren ausgesetzt waren. Darüber hinaus förderte Nikotin die Lungenfibrose durch epithelial-mesenchymale Transformation (EMT) bei Mäusen. Dieses Tiermodell kann verwendet werden, um die Auswirkungen mehrerer Faktoren auf die Entwicklung von Silikose zu untersuchen.

Introduction

Die Exposition von Arbeitnehmern gegenüber Kieselsäure ist in einigen beruflichen Umgebungen unvermeidlich, und sobald sie Kieselsäure ausgesetzt sind, schreitet die Verschlechterung auch nach der Entfernung aus der Umwelt voran. Darüber hinaus rauchen die meisten dieser Arbeiter, und herkömmliche Zigaretten enthalten Tausende von Chemikalien, wobei die wichtigste süchtig machende Komponente Nikotin1 ist. E-Zigaretten werden in jüngeren Altersgruppen immer beliebter2; Diese E-Zigaretten fungieren als Nikotinabgabesystem und erhöhen den Nikotinzugang, wodurch die Lungenanfälligkeit und Lungenentzündung erhöhtwerden 3. Zigarettenrauch beschleunigt auch die Lungenfibrose bei Bleomycin-exponierten Mäusen4 und erhöht die pulmonale Toxizität und Fibrose bei Kieselsäure-exponierten Mäusen 5,6. Ob Nikotin jedoch den durch Kieselsäure verursachten Entzündungs- und Lungenfibroseprozess beeinflussen kann, muss noch untersucht werden.

Das Silikose-Mausmodell, das durch die einmalige Inhalation einer hohen Dosis Kieselsäure in die Luftröhre entsteht, ist für Mäuse traumatisch. Obwohl diese Methode schnell ein Silikose-Modell liefert, entspricht sie nicht der Realität einer Umgebung, in der Arbeiter wiederholt Kieselsäure ausgesetzt sind. Daher etablierten wir ein Kieselsäure-exponiertes Mausmodell, indem wir wiederholt eine niedrige Dosis Kieselsäure-Suspensionen über einen Nasentropf verabreichten; Diese Dosis kann bei Mäusen Entzündungen und Fibrose verursachen.

Um die Wirkung anderer Zigarettenbestandteile zu umgehen, wurde diesem Mausmodell subkutan Nikotin in die lose Haut des Halses injiziert, um die Wirkung der süchtig machenden Komponente Nikotin auf die Silikose zu bestimmen. Durch die Verabreichung von subkutanen Injektionen kann eine genaue Dosierung erreicht werden, wodurch es möglich ist, Nikotinexpositionsmodelle zu erstellen und Dosis-Toxizitäts-Reaktionen sowie Sucht zu beobachten. An männlichen Mäusen wurde ein Nikotinabhängigkeitsmodell mit einer Nikotininjektionsdosis von 0,2-0,4 mg/kg entwickelt 7,8. In diesem Modell wurden zwei subkutane Injektionen im Abstand von 12 Stunden verabreicht, um den Bedarf der süchtigen Mäuse bei der Drogensuche zu decken. Dieses Nikotinabhängigkeitsmodell der Maus ist nützlich, um die Rauchgewohnheiten des Menschen und die Exposition gegenüber Kieselsäure zu simulieren.

Einfaktor-Tiermodelle haben Einschränkungen in Krankheitsstudien, während die hier beschriebene Methode ein Zwei-Faktoren-Mausmodell der Nikotin- und Kieselsäure-Koexposition beinhaltet. Vor der Kieselsäure-Exposition wurden die Mäuse Nikotin vorexponiert, um die Nikotinexposition bei Rauchern zu replizieren. Anschließend fand von Tag 5 bis Tag 19 eine Kieselsäure-Exposition statt, um die Kieselsäure-Exposition in einer Arbeitsumgebung für Personen mit einer Vorgeschichte des Rauchens zu imitieren.

Es ist bekannt, dass Alveolarmakrophagen eine wichtige Rolle bei der Regulation von Lungenentzündungen und -fibrose spielen. Makrophagen können Kieselsäure beim Einatmen von Kieselsäure nicht abbauen, was zu einer Makrophagenpolarisation oder Apoptose9 und der Freisetzung von Zytokinen wie Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und transformierendem Wachstumsfaktor beta (TGF-β) führt. M1-Makrophagen, die durch das Vorhandensein des Oberflächenmarkers CD86 identifiziert werden, sind die primären Auslöser der Entzündungsreaktion bei Silikose, während M2-Makrophagen, die durch CD206 markiert sind, für die fibrotische Phase der Erkrankung verantwortlich sind10. In doppelt exponierten Mäusen induzierte Nikotin die Polarisation von Makrophagen in Richtung des M2-Phänotyps in Kieselsäure-geschädigten Lungen und förderte so die Lungenfibrose. Darüber hinaus ist TGF-β1 der Schlüssel zur Induktion von Fibrose und EMT11; Die erhöhte Expression von TGF-β1 beschleunigte das Fortschreiten der Lungenfibrose durch EMT. Dieses Modell analysierte erfolgreich die Auswirkungen von Nikotin auf Silikose und unterstrich die Bedeutung der Nikotinentwöhnung.

Protocol

Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien des National Institutes of Health’s Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (der 8. Ausgabe des NRC) durchgeführt und von der Tierethikkommission der Anhui University of Science and Technology genehmigt. 1. Zubereitung von Tieren 32 männliche C57/BL6-Mäuse im Alter von 8 Wochen in einem Labor mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse freien Zugang zu Futter und Wasser habe…

Representative Results

Ein Mausmodell zur Untersuchung von Nikotin in Kombination mit Kieselsäureexposition wurde etabliert, um die potenzielle Rolle von Nikotin beim Fortschreiten der Silikose bei Mäusen zu untersuchen. Abbildung 1 zeigt das experimentelle Verfahren für die Verwendung eines Dual-Expositions-Mausmodells, bei dem eine Nikotininjektion mit der nasalen Instillation einer Silica-Suspension kombiniert wurde. Die pathologischen Veränderungen der Mäuse in jeder Gruppe wurden mittels HE-Färbung beob…

Discussion

Ein Tiermodell mit doppelter Exposition ist notwendig, um die Rolle und die möglichen Mechanismen der gleichzeitigen Exposition gegenüber Nikotin und kristallinem Siliziumdioxid zu untersuchen. Dieses Modell wurde in dieser Arbeit durch die subkutane Injektion von Nikotin und den nasalen Tropf von Kieselsäure erreicht. Um eine erfolgreiche Nikotininjektion zu gewährleisten, muss sich der Bediener mit dem Greifen der Mäuse vertraut machen, da das Greifen der Haut im Nacken für sie schmerzhaft sein kann. Daher ist es…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde vom University Synergy Innovation Program der Provinz Anhui (GXXT-2021-077) und dem Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120) unterstützt.

Materials

10% formalin neutral fixative Nanchang Yulu Experimental Equipment Co.
alcohol disinfectant Xintai Kanyuan Disinfection Products Co.
BSA, Fraction V Beyotime Biotechnology ST023-200g
CD206 Monoclonal antibody Proteintech 60143-1-IG
Citrate Antigen Retrieval Solution biosharp life science BL619A
dimethyl benzene West Asia Chemical Technology (Shandong) Co
Enhanced BCA Protein Assay Kit Beyotime Biotechnology P0009
GAPDH Polyclonal antibody Proteintech 10494-1-AP
Hematoxylin and Eosin (H&E) Beyotime Biotechnology C0105S
HRP substrate Millipore Corporation P90720
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Proteintech SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Proteintech SA00001-2
ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate Vector Laboratories SK-4103-100
Masson's Trichrome Stain Kit Solarbio G1340
Methanol Macklin
Nicotine Sigma N-3876
phosphate buffered saline (PBS)  Biosharp BL601A
Physiological saline  The First People's Hospital of Huainan City
PMSF Beyotime Biotechnological ST505
Positive fluorescence microscope OlympusCorporation BX53+DP74
Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder Beyotime Biotechnology P0071
PVDF membranes Millipore 3010040001
RIPA Lysis Buffer Beyotime Biotechnology P0013B
SDS-PAGE gel preparation kit Beyotime Biotechnology P0012A
Silicon dioxide Sigma #BCBV6865
TGF-β Bioss bs-0086R
Vimentin Polyclonal antibody Proteintech 10366-1-AP
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number
0.5 mL Tube Biosharp BS-05-M
Oscillatory thermostatic metal bath Abson
Paraffin Embedding Machine Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. PBM-A
Paraffin Slicer Jinhua Kratai Instruments Co.
Pipettes Eppendorf
Polarized light microscope Olympus BX51
Precision Balance Acculab ALC-110.4
RODI IOT intelligent multifunctional water purification system RSJ RODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker Scilogex
Small animal anesthesia machine Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. ZL-04A
Universal Pipette Tips KIRGEN KG1011
Universal Pipette Tips KIRGEN KG1212
Universal Pipette Tips KIRGEN KG1313
Vortex Mixers  VWR
Name of Material/ Equipment
Adobe Illustrator
ImageJ
Photoshop
Prism7.0

Referenzen

  1. Wonnacott, S. Presynaptic nicotinic ACh receptors. Trends in Neurosciences. 20 (2), 92-98 (1997).
  2. Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
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Diesen Artikel zitieren
Chen, H., Li, B., Cao, H., Zhao, Y., Zou, Y., Wang, W., Mu, M., Tao, X. Using Nicotine in a Silica-Exposed Mouse Model to Promote Lung Epithelial-Mesenchymal Transition. J. Vis. Exp. (193), e65127, doi:10.3791/65127 (2023).

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