Herstellung pulsatiler polymerer Mikropartikel, die das Tollwutantigen verkapseln

Summary

Diese Methode beschreibt die Verkapselung des Tollwutantigens in biologisch abbaubare polymere Mikropartikel mit strukturellen und materiellen Eigenschaften, die eine pulsierende Freisetzung nach einer vorgegebenen Verzögerung ermöglichen. Die ELISA-Bewertung des aus dem Partikelkern gewonnenen Antigens (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) bestätigt das Vorhandensein eines intakten Glykoproteins des trimeren Tollwutvirus durch Partikelherstellung.

Abstract

Die aktuellen Leitlinien für die Tollwut-Postexpositionsprophylaxe verlangen mehrfache Injektionen über mehrere Wochen. Dies kann für diejenigen, die in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen (LMICs) leben, in denen die meisten tödlichen Tollwutexpositionen auftreten, unverhältnismäßig belastend sein. Es wurden verschiedene Strategien zur Verabreichung von Medikamenten untersucht, um Impfstoffschemata auf eine einzige Injektion zu verdichten, indem Antigene in Polymerpartikel eingekapselt werden. Starke Stressoren während des Verkapselungsprozesses können jedoch zu einer Denaturierung des verkapselten Antigens führen. In diesem Artikel wird eine Methode zur Verkapselung des Tollwutvirus-Antigens (RABV) in polymere Mikropartikel beschrieben, die eine einstellbare pulsatile Freisetzung aufweisen. Diese Methode, die als Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED) bezeichnet wird, erzeugt Mikropartikel mithilfe von Weichlithografie, um inverse Polydimethylsiloxan-Formen (PDMS) aus einer 3D-gedruckten Multiphotonen-Urform herzustellen. Poly(milch-co-glykolsäure)-Folien (PLGA) werden dann in die PDMS-Formen gepresst, um offene Zylinder zu erzeugen, die mit einem piezoelektrischen Dosierroboter mit konzentriertem RABV gefüllt werden. Diese Mikrostrukturen werden dann durch Erhitzen der Oberseite der Partikel versiegelt, so dass das Material fließen und eine kontinuierliche, nicht poröse Polymerbarriere bilden kann. Nach der Herstellung wird ein ELISA-Assay (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) verwendet, der speziell für den Nachweis von intaktem Glykoprotein des trimeren Tollwutvirus spezifisch ist, um die hohe Rückgewinnung des immunogenen Antigens aus den Mikropartikeln zu bestätigen.

Introduction

Die Impfung ist ein äußerst wirksames Instrument im Gesundheitswesen, das zwischen 2000 und 2019 mehr als 37 Millionen Todesfälle verhindert hat¹. Trotz dieser Wirksamkeit stellen durch Impfung vermeidbare Krankheiten nach wie vor ein erhebliches Risiko für die globale Gesundheit dar, insbesondere in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen, in denen hohe Raten von Nicht- und Unterimpfungen jährlich zu 1,5 Millionen durch Impfung vermeidbaren Todesfällen beitragen². Tollwut ist keine Ausnahme von diesen Ungleichheiten. Obwohl die Tollwut die tödlichste bekannte Krankheit der Menschheit ist und fast immer tödlich verläuft, ist sie vollständig behandelbar und wird in vielen Ländern mit hohem Einkommen als ausgerottet eingestuft. Stattdessen wird die Last der Tollwut unverhältnismäßig stark von Menschen getragen, die in Teilen Asiens und Afrikas leben, wo die Krankheit verheerende Folgen für Mensch und Vieh hat ^3,4.

Die Impfung ist entscheidend für die Bewältigung der globalen Auswirkungen der Tollwut⁵. Die Kosten der Impfung verhindern eine flächendeckende Durchführung der Präexpositionsprophylaxe (PrEP), da die Inzidenz der Krankheit insgesamt gering ist. Darüber hinaus ist der Nutzen der Postexpositionsprophylaxe (PEP) in LMICs durch den sozioökonomischen Druck auf Patienten, die eine Gesundheitsversorgung in Anspruch nehmen, begrenzt. Logistische Faktoren, wie z. B. die Entfernung zu den Zugangspunkten zur Gesundheitsversorgung, Lohneinbußen bei der Behandlung, die Behandlungskosten, Termine, die die täglichen Aktivitäten beeinträchtigen, und Vergesslichkeit führen zu PEP-Adhärenzraten von nur 60 %^6,7. Diese hohe Fluktuationsrate bietet die Möglichkeit, Ansätze zu verfeinern, um Lücken in der Tollwutimpfung zu schließen und die Krankheit zu bekämpfen.

Impfsysteme mit einer einzigen Injektion (SI), die die Freisetzung von Antigenen kontrollieren, wurden als Möglichkeiten untersucht, eine vollständige Immunisierung in einer Injektion zu erreichen. Der Wegfall der Notwendigkeit mehrerer Besuche bei einem Gesundheitsdienstleister verringert die Belastungen, die Einzelpersonen davon abhalten, eine angemessene Versorgung in Anspruch zu nehmen. Um eine SI-Impfung zu erreichen, wird ein Antigen in der Regel in eine biologisch abbaubare Polymermatrix eingekapselt, die häufig die Form von injizierbaren Mikropartikeln annimmt. Nach der Injektion wird das Polymer abgebaut und setzt das sequestrierte Antigen frei. Bisher wurden zwei primäre Freisetzungsstrategien verfolgt, um eine SI-Impfung zu erreichen. Bei einem Ansatz wird das Antigen kontinuierlich über einen längeren Zeitraum freigesetzt. Obwohl dieser Ansatz die Immunogenität einer einzelnen Injektion verbessern soll, ist unklar, ob dieser Ansatz ausreicht, um beim Menschen eine schützende Immunantwort gegen das Tollwutvirus (RABV) hervorzurufen⁸. Im anderen Fall wird das Antigen nach einer vorgegebenen Verzögerung freigesetzt, um ein herkömmliches und bewährtes Prime-Boost-Impfstoffschema nachzuahmen. Sprühtrocknungs- und Emulsions-/Lösungsmittelverdampfungs-basierte Mikropartikelherstellungsmethoden zeigen die erste Strategie und wurden erfolgreich eingesetzt, um sowohl Modellimpfstoffe⁹ als auch hochstabile Antigene wie Tetanustoxoid¹⁰ erfolgreich zu verkapseln. Diese Verkapselungsmethoden beinhalten jedoch Stressoren, einschließlich Hitze, Lösungsmittelwechselwirkung und physikalische Kräfte, die Antigene denaturieren können¹¹.

Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED) ist eine kürzlich entwickelte Herstellungsmethode, mit der Biologika in biologisch abbaubare Mikropartikel eingekapselt werden können. Micromolding wird verwendet, um Partikel zu erzeugen, die mit einer flüssigen Nutzlast gefüllt und erhitzt werden, damit das Polymer reflowen und das zentrale Frachtdepot vollständig in einer zusammenhängenden Schicht des biologisch abbaubaren Polymers einkapseln kann. Diese Mikrostruktur führt zu einer pulsierenden Freisetzung der Nutzlast nach einer Zeit, die von der Abbaurate der Polymerhülle¹² abhängt. Dieses Manuskript demonstriert die Verkapselung von inaktiviertem RABV in Mikropartikeln, die aus Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA) bestehen, einem biologisch abbaubaren Polymer, das in vielen von der FDA zugelassenen Formulierungen verwendet wird¹³, unter Verwendung der PULSED-Herstellungsmethode zur Verkapselung eines stabilen RABV-Antigens, das durch einen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bewertet wird. Durch die Kombination von PLGA-Partikeln mit unterschiedlichem Molekulargewicht und/oder unterschiedlichen Endgruppen hat dieser Ansatz das Potenzial, den aktuellen Verlauf der Tollwutimpfung nach einer einzigen Injektion nachzuahmen.

Protocol

1. Generierung von Partikel-Urformen

HINWEIS: Der 3D-Druckprozess kann mit jedem 3D-Drucker mit ausreichender räumlicher Auflösung durchgeführt werden. Das aktuelle Protokoll beschreibt jedoch das Verfahren für einen Multi-Photonen-3D-Drucker.

1. Entwerfen Sie Mikropartikelstrukturen mit einem CAD-Programm (Computer Aided Design).
   HINWEIS: Die Konstruktionsspezifikationen lauten wie folgt: 308 Partikel (Durchmesser = 400 μm, Höhe = 500 μm und Wandstärke = 100 μm) sind in einem 22 x 14 großen Array mit einem Abstand von 600 μm angeordnet. Das Design enthält auch einen vierzackigen Stern und einen fünfzackigen Stern als Passermarken unmittelbar außerhalb des Arrays (ergänzende Abbildung 1).
2. Exportieren Sie das endgültige Design als STL-Datei (Supplementary Coding File 1) und laden Sie die Datei in eine Software hoch, die in der Lage ist, die Druckparameter wie unten gezeigt zu definieren. Speichern Sie es dann als Datei, die mit dem 3D-Drucker kompatibel ist (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Schnittabstand = 5 μm, Schraffurabstand = 1 μm, Schalenkontur = 50 μm, Anzahl der Basisschichten = 5 μm, Gerüst = hohl, Scanmodus = Galvo, Z-Achse = Mikroskop-Z-Antrieb, Scangeschwindigkeit = 100.000, Leistung = 100.
3. Behandeln Sie ein Silizium-Drucksubstrat (siehe Materialtabelle) mit einem Plasmareinigungsverfahren (Gas: O₂; Leistung: 200 Watt; Temperatur: 25 °C; Durchfluss: 20; Zeit: 5 min) vor und tauchen Sie das Substrat dann sofort in eine Lösung aus 30 ml Ethanol und 60 μl 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat in einer Glas-Petrischale. Mit Alufolie abdecken und über Nacht inkubieren lassen.
   HINWEIS: Dieser Schritt erhöht die Druckhaftung auf dem Substrat, was bei der PDMS-Trennung (Schritt 2.6) wichtig ist.
4. Laden Sie die Druckdatei auf den Multiphotonen-3D-Drucker hoch, tragen Sie das Druckharz auf das behandelte Substrat auf, laden Sie die 10-fach-Linse (siehe Materialtabelle) und drucken Sie die Mikrostrukturen.
5. Wenn Sie fertig sind, tauchen Sie den Druck 45 Minuten lang in Propylenglykolmethyletheracetat (siehe Materialtabelle), um unbelichteten Fotolack zu entfernen, und tauchen Sie den Druck dann 5 Minuten lang in Isopropylalkohol ein. Härten Sie die Urform nach, indem Sie sie 120 Minuten lang UV-Licht bei 254 nm aussetzen.
   HINWEIS: Falls verfügbar, kann UV-Licht im Bereich von 405 bis 365 nm für ~20 min verwendet werden, um die gedruckten Strukturen nachzuhärten.

2. Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS)-Schimmelpilzen

1. Behandeln Sie die Oberfläche der 3D-gedruckten Urform, indem Sie sie in eine Vakuumkammer legen, die einen Glasobjektträger enthält, dem 40 μl Trichlor(1H,1H,2H,2H,-perfluoroctyl) (siehe Materialtabelle) Silan zugesetzt werden. Ziehen Sie das Vakuum (relativer Druck: -20 Zoll. Hg) für 1 h.
   HINWEIS: Dieser Schritt sorgt für eine einfache Trennung beim Entformen (Schritt 2.6).
2. Während die Oberfläche der Urform behandelt wird, mischen Sie die Prepolymerbasis von Polydimethylsiloxan (PDMS) gründlich mit dem PDMS-Präpolymerhärter in einem Masseverhältnis von 9:1 (für jede Urform werden mindestens 10 g Material benötigt). Nach dem gründlichen Mischen wird das nicht ausgehärtete PDMS in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 300 x g 3 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.
3. Sobald die Oberflächenbehandlung abgeschlossen ist, legen Sie die Urform in eine Aluminiumfolienschale und gießen Sie das nicht ausgehärtete PDMS auf die Form, um sicherzustellen, dass die Merkmale vollständig untergetaucht sind. Stellen Sie die Aluminiumfolienschale in eine Vakuumkammer und ziehen Sie das Vakuum (relativer Druck: -20 Zoll. Hg) für 1 h, um Luftblasen zu entfernen.
4. Nehmen Sie die Aluminiumfolienschale aus der Vakuumkammer. Platzieren Sie 800-μm-Abstandshalter an den Enden der Urform und legen Sie einen sauberen Glasschieber auf die Urform, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luftblasen entstehen. Verwenden Sie Binderklammern, um die Form und den Schieber zusammenzuklemmen und die Schließkraft über den Abstandshaltern zu lokalisieren (ergänzende Abbildung 2).
5. Legen Sie die Struktur für mindestens 4 h in einen auf 120 °C eingestellten Ofen, um das Prepolymer in PDMS-Formen auszuhärten.
6. Nehmen Sie die Struktur aus dem Ofen, lösen Sie vorsichtig die Binderklammern und trennen Sie die Urform vorsichtig mit einer Rasierklinge von der ausgehärteten PDMS-Form.
   HINWEIS: Die 3D-gedruckte Urform kann wiederverwendet werden, um weitere PDMS-Formen zu generieren.

3. Herstellung von PLGA-Folien

1. Wiegen Sie 450 mg PLGA (siehe Materialtabelle) ab und legen Sie es auf eine 76 mm x 76 mm große antihaftbeschichtete Polymerfolie in einer 250 μm dicken Ringunterlegscheibe mit einem Innendurchmesser von 50,8 mm. Legen Sie eine zweite antihaftbeschichtete Polymerfolie über den PLGA und drücken Sie den Stapel mit einer 101,6-mm-C-Klemme zwischen zwei Aluminiumblöcken zusammen, bis er fingerfest ist.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde ausschließlich 502H PLGA verwendet. Andere PLGA-Typen sind jedoch mit diesem Verfahren kompatibel.
2. Legen Sie die c-gespannte Baugruppe für 30 Minuten unter Vakuum mit einem Relativdruck von -30 Zoll in einen Vakuumofen, der auf 120 °C eingestellt ist. Entfernen Sie dann die Baugruppe und ziehen Sie die Klemme fest an, bevor Sie sie für weitere 30 Minuten wieder in den Vakuumofen stellen.
   Anmerkungen: Der Hauptzweck der Verwendung eines Vakuums besteht darin, eine PLGA-Degradation zu vermeiden, die bei hohen Temperaturen beschleunigt wird.
3. Nehmen Sie die Baugruppe aus dem Ofen und lassen Sie sie 4 Stunden in einem Exsikkator abkühlen.
4. Lösen Sie nach dem Abkühlen die Klemme, entfernen Sie die PLGA-Folie von den antihaftbeschichteten Polymerfolien und legen Sie die Folie in eine beschriftete Petrischale. Bewahren Sie die Petrischale zur späteren Verwendung in einem Exsikkator auf.

4. Erzeugung von PLGA-Partikeln

1. Behandeln Sie die Oberfläche der PDMS-Form wie zuvor in Schritt 2.1 beschrieben.
2. Schneiden Sie mit einer Pinzette und/oder einem Skalpell einen Teil der 250 μm PLGA-Folie, etwa die Größe des Arrays, aus und legen Sie ihn auf die behandelte PDMS-Form.
3. Legen Sie einen sauberen Glasobjektträger auf die PLGA-Folie und die PDMS-Form und klemmen Sie die Komponenten zusammen, indem Sie eine Federklemme direkt über das Array und die PLGA-Folie legen.
4. Legen Sie die eingespannte Formbaugruppe in den auf 120 °C eingestellten Vakuumofen und ziehen Sie das Vakuum mit einem Relativdruck von -30 Zoll. Hg für 1 h.
   HINWEIS: Die Zeit, die benötigt wird, um die Partikel zu bilden, hängt vom PLGA ab und kann zwischen 1 und 12 Stunden variieren.
5. Nehmen Sie die eingespannte Formbaugruppe aus dem Ofen und lassen Sie sie ca. 15 Minuten bei Raumtemperatur passiv abkühlen oder bis sie sich kühl anfühlt.
6. Üben Sie mit einer Rasierklinge vorsichtig Druck zwischen der PDMS-Form und dem PLGA-Partikelarray aus, um die beiden zu trennen. Bewahren Sie die PLGA-Partikel für die spätere Verwendung in einem Exsikkator auf.

5. Antigenkonzentration und -reinigung

1. Tauen Sie ein Aliquot des handelsüblichen RABV-Antigens (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur auf.
2. Montieren Sie den Filtrationsaufbau, indem Sie zwei Zentrifugal-Spin-Filter mit einem Molekulargewichts-Grenzwert von 100 kDa (MWCO; siehe Materialtabelle) in zwei Sammelröhrchen einsetzen.
3. Befeuchten Sie die beiden Zentrifugal-Schleuderfilter durch Zugabe von 500 μl Reinstwasser.
4. Schleudern Sie die Filter bei 2.400 x g für 1 Minute in einer Tischzentrifuge bei Raumtemperatur.
5. Entfernen Sie das Wasser sowohl aus dem oberen als auch aus dem unteren Fach des Filtrationsaufbaus mit einer 200-μl-Pipette.
   HINWEIS: Lassen Sie den vorgefeuchteten Schleuderfilter nicht austrocknen.
6. Geben Sie 400 μl destilliertes Wasser in das obere Fach jedes Spinfilters, fügen Sie dann 100 μl des aufgetauten RABV-Antigens hinzu und mischen Sie es mit der Pipette.
   Anmerkungen: In dieser Studie wurde das Antigen etwa um das Fünffache konzentriert und die Konzentration der Hilfsstoffe <100 kDa um das ~50-fache reduziert.
7. Legen Sie die beiden Zentrifugal-Schleuderfilter in eine Tischzentrifuge und achten Sie darauf, dass die Filter zur Mitte der Zentrifuge zeigen. Markieren Sie, welche Seite des Filters zur Mitte der Zentrifuge zeigt.
   Anmerkungen: Bei falscher Ausrichtung werden die Lösungen nicht richtig gefiltert/konzentriert.
8. Zentrifugieren Sie die Filter bei 14.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
9. Holen Sie die Filter aus der Zentrifuge. Die Sammelröhrchen enthalten das Filtrat, während die Filter die konzentrierte Probe enthalten (ergänzende Abbildung 3A).
10. Entfernen Sie das Filtrat in den Auffangröhrchen mit einer Pipette und entsorgen Sie es.
11. Geben Sie 450 μl gefiltertes destilliertes Wasser in jeden Filter und mischen Sie die konzentrierte Probe und das Wasser, indem Sie sechsmal auf und ab pipettieren.
12. Zentrifugieren Sie die beiden Schleuderfilter ein zweites Mal bei 14.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Stellen Sie sicher, dass die Filter in der gleichen Ausrichtung wie in Schritt 5.7 zur Mitte der Zentrifuge zeigen.
13. Entnehmen Sie die Filtereinheiten aus der Zentrifuge und entnehmen Sie wie zuvor das Filtrat aus jedem Röhrchen mit einer Pipette.
14. Entfernen Sie die Schleuderfilter aus den Auffangröhrchen und verschließen Sie die Filtergehäuse mit der Oberseite der Auffangröhrchen (ergänzende Abbildung 3B).
15. Legen Sie die Unterseite der Schleuderfiltergehäuse direkt auf einen Wirbel und wirbeln Sie 30 s lang bei 3.000 U/min, während Sie die Filtergehäuse aufrecht und in einem Winkel von 45° halten (ergänzende Abbildung 3C).
    HINWEIS: Dieser Schritt dient dazu, jedes RABV-Antigen zu resuspendieren, das während des Zentrifugationsprozesses ein Pellet gebildet hat.
16. Entfernen Sie vorsichtig die Kappe der Auffangröhrchen von den Schleuderfiltergehäusen. Setzen Sie die Filtergehäuse wieder in die mitgelieferten Auffangröhrchen ein und führen Sie eine schnelle Drehung (2-3 s) durch, um das Volumen aufzufangen, das möglicherweise in der Kappe eingeschlossen ist.
    Anmerkungen: Diese schnelle Drehung muss in einer Tischmikrozentrifuge durchgeführt werden. Die Filter sollten tangential zur Zentrifuge angeordnet sein, entgegen der vorherigen Konfiguration, um sicherzustellen, dass keine Lösung durch die Filter verloren geht.
17. Jede Spinfiltereinheit wird in ein neues, mit dem Spinfilter-Kit geliefertes Sammelrohr (siehe Materialtabelle) eingesetzt und 2 Minuten lang bei 1.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die konzentrierten Proben zu sammeln.
18. Konsolidieren Sie die konzentrierten Proben aus den beiden Sammelröhrchen zu einem Sammelröhrchen. Messen und notieren Sie das resultierende Volumen.
    HINWEIS: Die resultierende Probe hat das 5-fache der ursprünglichen Antigenkonzentration wie der Stamm, hat eine geringe Hilfsstoffkonzentration (<100 kDa), die etwa 50-fach niedriger ist als die des Stammes, und erscheint leicht milchigweiß. Das Gesamtvolumen sollte ca. 44-48 μl betragen.
19. Lagern Sie das 5x konzentrierte, zweimal gewaschene Antigen bei 4 °C bis zum Zeitpunkt der Abgabe, jedoch nicht länger als 16 h. Bevor Sie Partikel mit dieser Lösung füllen, zentrifugieren Sie das Röhrchen 1 Minute lang bei 1.000 x g , um alle Blasen zu entfernen. Die Lösung kann mit destilliertem Wasser verdünnt werden, um die nominale Zielkonzentration für die Dosierung zu erreichen.

6. Partikelfüllung

1. Vakuumfilter 500 ml deionisiertes Wasser durch einen 0,22 μm Vakuumfilter, dann entgasen Sie die Lösung durch Anlegen eines Vakuums (Relativdruck: -20 Zoll. Hg) unter Beschallung für 20 min.
2. Befestigen Sie während dieser Zeit die Piezo-Dispense-Kapillaren (PDCs; siehe Materialtabelle) am piezoelektrischen Dispenser.
3. Grundieren Sie das Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) und legen Sie den Objektträger mit den PLGA-Partikeln in den Dosierbereich.
4. Richten Sie die Option "Zielreferenzpunkte suchen", "Ausführen" und dann das "Zielsubstrat " gemäß ergänzender Abbildung 4 ein.
5. Laden Sie 25 μl des konzentrierten Antigens in die Ausgangsplatte und laden Sie es in die Maschine. Aspirieren Sie mit den PDCs 10 μl konzentriertes Antigen in die Dosierspitze, waschen Sie die Außenseite der Spitze und kalibrieren Sie dann die Dosierausrichtung (ergänzende Abbildung 5).
6. Geben Sie "Target Setup parameters" ein und klicken Sie auf Ausführen (ergänzende Abbildung 6).
7. Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die gefüllten Partikel und überprüfen Sie, ob sie unter einem Stereoskop gefüllt sind.
8. Fahren Sie direkt mit dem nächsten Schritt im Protokoll fort.

7. Partikelversiegelung und -ernte

1. Legen Sie einen Edelstahlblock (siehe Materialtabelle) auf eine Kochplatte. Legen Sie zwei Objektträger parallel auf den Edelstahlblock. Stellen Sie sicher, dass der Edelstahlblock waagerecht ist, schalten Sie dann die Kochstelle ein und stellen Sie die Temperatur so ein, dass die Oberflächentemperatur des Edelstahls 200 °C beträgt. Überprüfen Sie vor dem Versiegeln die Temperatur der Kochstelle.
2. Hängen Sie die gefüllten PLGA-Partikel über der Kochplatte, indem Sie sie auf die beiden Glasobjektträger legen, und starten Sie dann sofort einen Timer für 18 s.
   HINWEIS: Die Zeit und die Wärme, die Partikel zum Versiegeln benötigen, hängen von den chemischen Eigenschaften des PLGA ab, das zur Herstellung der Partikel verwendet wird. Ein kundenspezifischer 3D-gedruckter Objektträgerhalter kann verwendet werden, um die Objektträger in sicherem Abstand von der Kochplatte zu handhaben. Die STL-Datei wird als ergänzende Codierungsdatei 2 bereitgestellt.
3. Entfernen Sie nach dem Versiegeln das Partikelarray von der Kochplatte und hängen Sie es über den Labortisch, indem Sie das Partikelarray auf zwei separate Glasobjektträger legen. Lassen Sie die Partikel 1 Minute abkühlen.
4. Nach dem Abkühlen können die Partikel mit einem Skalpell geerntet werden, während man durch ein Stereoskop schaut. Halten Sie das Skalpell mit der Klinge in einem 45°-Winkel zum Objektträger und üben Sie Druck auf die Basis des Partikels aus, um es vom Objektträger zu trennen.
5. Nach der Ernte werden die Partikel mit dem Skalpell in 0,5 ml proteinarme Binderöhrchen überführt (siehe Materialtabelle). Füllen Sie dann die Röhrchen mit 250 μl einer 1x Phosphatpufferlösung (PBS), die 30 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 1 mg/ml Glukose enthält.
   HINWEIS: Die in PBS hergestellte 30 mg/ml BSA- und 1 mg/ml-Glukoselösung erhält die Stabilität des RABV-Antigens.
6. Zerkleinern Sie die Partikel unter einem Stereoskop mit einer Pinzette mit feiner Spitze. Stellen Sie sicher, dass das RABV-Antigen im Kern des Partikels verfügbar ist, um in der umgebenden Lösung gelöst zu werden. Lagern Sie die Proben in einem Kühlschrank bei 4 °C, bis die Antigenpotenz mit einem ELISA bewertet werden kann. Die Proben müssen innerhalb von 7 Tagen nach der Aufbereitung auf einem ELSIA behandelt werden.

8. Bewertung des Antigens mittels ELISA

ACHTUNG: Lassen Sie die Mikrotiterplatten zu keinem Zeitpunkt austrocknen. Stapeln Sie die Teller immer und decken Sie die obere Platte immer mit einer Plastikdichtung, einem leeren Teller oder einem Deckel ab, um ein Austrocknen zu vermeiden.

1. Bereiten Sie die Puffer wie in Ergänzungsdatei 1 beschrieben vor.
2. Bereiten Sie 5 ml Beschichtungslösung (Carbonat-Bicarbonat-Puffer, pH 9,6) in einer Konzentration von 2,5 μg/ml vor, indem Sie 25 μl des Beschichtungsantikörpers zu 4975 μl Beschichtungspuffer bei einem pH-Wert von 9,4-9,6 hinzufügen.
   HINWEIS: 5 ml werden benötigt, um 96 Wells mit je 50 μl zu beschichten (mit zusätzlichem Volumen für Pipettierverluste). Erhöhen Sie das Gesamtvolumen um 5 ml für jede zusätzlich benötigte ELISA-Platte.
3. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 μl der Beschichtungslösung in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte zu dosieren. Die Lösung muss unmittelbar nach der Herstellung zum Beschichten verwendet werden.
4. Klopfen Sie vorsichtig an den Tellerrändern einer behandschuhten Handfläche entlang, um sicherzustellen, dass der Boden jeder Vertiefung gleichmäßig mit Flüssigkeit bedeckt ist.
5. Verschließen Sie die Platte mit Klebefolie und legen Sie sie 1 h lang auf 37 °C, dann über Nacht auf 4 °C umstellen.
6. Holen Sie die Platten aus dem Kühlhaus und waschen Sie sie dreimal mit 200 μl Waschpuffer in jeder Vertiefung.
7. Entfernen Sie den Waschpuffer und geben Sie 300 μl Blockierpuffer in jede Vertiefung.
   VORSICHT: Wenn mehrere Platten mit denselben Proben auf verschiedenen Platten wiederholt werden, ist es wichtig, Platte für Platte vorzugehen (d. h. Platte 1 mit dem Material zu füllen, bevor Sie mit Platte 2 und dann mit Platte 3 fortfahren und so weiter). Tragen Sie nicht Material X auf alle Platten und dann Material Y usw. auf, da dies das Risiko des Austrocknens von Brunnen erhöhen würde. Nach dem letzten Waschschritt sollte der Waschpuffer in den Vertiefungen der Platte verbleiben und erst unmittelbar vor der Zugabe von Proben zur Platte verworfen werden. Ein 96-Well-Plattendeckel aus Kunststoff muss verwendet werden, um alle Vertiefungen der ELISA-Platte abzudecken, in die nicht sofort dosiert wird, und der Deckel muss nacheinander bewegt werden, um zusätzliche Vertiefungen freizulegen, die mit Material gefüllt werden sollen.
8. Verschließen Sie die Platten mit einer selbstklebenden Kunststofffolie (siehe Materialtabelle) und legen Sie sie für 60 ± 5 min bei 37 ± 2 °C in einen Inkubator.
9. Bereiten Sie die Standardkurve vor und testen Sie die Proben, die während dieser Inkubation ausgewertet werden sollen.
   HINWEIS: Das zu bewertende Antigen muss in Verdünnungspuffer mit einer empfohlenen Verdünnung von 0,125 IU/ml mit einem überschüssigen Volumen von mindestens 40 μl vorverdünnt werden, um den Pipettierverlust zu berücksichtigen. Alle Proben werden in zweifacher Ausführung (zwei technische Replikate) auf jeder ELISA-Platte ausgewertet. Für die Standardkurve sollte in den Spalten 2 und 3 jeder ELISA-Platte eine zweifache Verdünnungsreihe für insgesamt acht Punkte enthalten sein. Für alle anderen Proben kann eine Verdünnungsreihe mit einer angemessenen Anzahl von Punkten basierend auf der vorhergesagten Menge des zu bewertenden Antigens durchgeführt werden. Obwohl sie für einen höheren Durchsatz weniger streng ist, kann eine einzelne Probenverdünnung als Alternative zu der oben beschriebenen Beschichtung verwendet werden. Die zu erwartende Konzentration einer einzelnen Verdünnung muss jedoch innerhalb des Standardkurvenbereichs liegen.
10. Führen Sie in 96-Well-Proteinplatten mit geringer Bindung oder in Proteinröhrchen mit geringer Bindung (siehe Materialtabelle) eine zweifache Verdünnungsreihe jeder Probe entlang der Säulen der Platte durch.
11. Laden Sie den Beginn der Verdünnungsreihe in Zeile A für jede jeweilige Probe mit dem doppelten des erforderlichen Endvolumens (pro Platte sind 100 μl Probe pro Well erforderlich, daher sollten alle Wells in A2-A11 mindestens 240 μl einer Probe enthalten, mit einem zusätzlichen Volumen von 40 μl, um den Pipettierverlust zu berücksichtigen).
12. Laden Sie 120 μl Verdünnungspuffer in alle anderen Vertiefungen auf der Proteinplatte mit geringer Bindung, mit Ausnahme der Spalten 1 und 12 (d. h. B2 bis H11).
13. Führen Sie mit einer Mehrkanalpipette mit 10 Spitzen eine serielle Verdünnung durch, indem Sie 120 μl Probe von A2-A11 auf B2-B11 übertragen und mehrmals auf und ab pipettieren, um zu mischen, ohne Spritzer und Blasen zu verursachen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Platte entlang der Säulen bis zu den Vertiefungen H2-H11 hinunterbewegen. Verwerfen Sie das verbleibende Volumen von 120 μl, das aus der letzten Reihe von Vertiefungen abgesaugt wurde.
    HINWEIS: Die Proben sind jetzt bereit für die Analyse. Wenn die Blockierungsphase zu diesem Zeitpunkt noch nicht abgeschlossen ist, stellen Sie sicher, dass die Proben auf Eis gelegt werden.
14. Waschen Sie die Platten am Ende des Inkubationsschritts dreimal mit 200 μl Waschpuffer.
15. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl Verdünnungspuffer in die Spalten 1 und 12 als "Rohlinge".
16. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte mit niedrig gebundenem Protein mit Probenverdünnungen auf die gewaschene ELISA-Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle ausgeführten ELISA-Platten.
17. Verschließen Sie die Platten mit einer selbstklebenden Kunststofffolie und legen Sie sie für 60 ± 5 min bei 37 ± 2 °C in einen Inkubator.
18. Bereiten Sie die Nachweisantikörperlösung (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 0,2 μg/ml vor, indem Sie 4,4 μl der Antikörperlösung zu 10.995,6 μl des Verdünnungsmittelpuffers hinzufügen und durch Auf- und Abpipettieren gut mischen.
    HINWEIS: Für 96 Wells zu je 100 μl werden insgesamt 11 ml benötigt (mit zusätzlichem Volumen für Pipettierverluste). Erhöhen Sie das Gesamtvolumen um 11 ml für jede weitere ELISA-Platte, die ausgewertet wird. Die Lösung muss sofort nach der Zubereitung verwendet werden.
19. Waschen Sie die Platten am Ende des Inkubationsschritts fünfmal mit 200 μl Waschpuffer.
20. Aspirieren Sie den verbleibenden Waschpuffer und geben Sie 100 μl der Detektionsantikörperlösung mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung auf der Mikrotiterplatte.
21. Verschließen Sie die Platten mit einer selbstklebenden Kunststofffolie und legen Sie sie für 60 ± 5 min bei 37 ± 2 °C in einen Inkubator.
22. Bereiten Sie das Konjugat gegen Ende des Inkubationsschritts des Nachweisantikörpers vor, indem Sie 4,4 μl Streptavidin-Peroxidase-Konjugatlösung (siehe Materialtabelle) zu 10.995,6 μl Waschpuffer hinzufügen.
    HINWEIS: Für 96 Wells zu je 100 μl werden insgesamt 11 ml benötigt (mit zusätzlichem Volumen für das Mehrkanalpipettieren). Erhöhen Sie das Gesamtvolumen um 11 ml für jede weitere ELISA-Platte, die ausgewertet wird.
23. Waschen Sie die Platten fünfmal mit 200 μl Waschpuffer.
24. Aspirieren Sie den verbleibenden Waschpuffer und geben Sie 100 μl der konjugierten Lösung in jede Vertiefung.
25. Verschließen Sie die Platten mit einer selbstklebenden Kunststofffolie und legen Sie sie für 60 ± 5 min bei 37 ± 2 °C in einen 37 °C heißen Inkubator.
26. Bereiten Sie den Untergrund während des letzten Waschschritts gemäß den Anweisungen des Herstellers vor (siehe Materialtabelle). Lösen Sie für jede Platte eine Tablette o-Phenylendiamindihydrochlorid (OPD; siehe Materialtabelle) in 9 ml deionisiertem Wasser im Dunkeln auf und füllen Sie dann 1 ml 10x stabilen Peroxidpuffer auf. Passen Sie die Anzahl der Tabletten und das Gesamtvolumen der Lösung (10 ml) entsprechend der Anzahl der zu untersuchenden Platten an.
27. Waschen Sie die Platten fünfmal mit 200 μl Waschpuffer.
28. Geben Sie 100 μl des Substrats mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung.
29. Versiegeln Sie die Platten mit einer selbstklebenden Kunststofffolie und lassen Sie sie 10-20 Minuten lichtgeschützt mit Alufolie auf der Bank.
    HINWEIS: Überwachen Sie die Farbentwicklung visuell, um eine Sättigung zu vermeiden.
30. Geben Sie 50 μl Stopplösung sofort in jede Vertiefung und die Leseplatte, um eine Absorption bei 492 nm und eine Referenzabsorption von 620 nm zu erzielen.
31. Analysieren Sie die Daten anhand des korrigierten Absorptionswerts (Messwert bei 492 nm minus Messwert bei 620 nm) und subtrahieren Sie den Durchschnitt des Blindwerts von allen Proben. Verwenden Sie eine sigmoidale 4PL-Interpolationsmethode, um Absorptionswerte in IU/ml umzuwandeln. Zum Schluss multiplizieren Sie mit den 250 μl (Gesamtprobenvolumen), um sie in IE umzurechnen.
    HINWEIS: Diese Analyse kann mit einer Datenanalysesoftware durchgeführt werden.

Results

Die Partikelversiegelung und -befüllung sind zwei der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll. Die Partikel wurden mit Fluorescein-Natriumsalz gefüllt, um eine ideale Füllung und einige häufige Fehler zu demonstrieren. Fluorescein-Natriumsalz wurde anstelle des RABV-Antigens verwendet, um die Visualisierung zu erleichtern. Während der Befüllung ist es wichtig, die Lösung in den Boden der Partikelkerne zu geben und dann genügend Zeit zu lassen, damit das Lösungsmittel/Wasser verdunsten kann. Nach Abschluss des Vorgangs verbleibt ein Depot des gelösten Stoffes am Boden des Partikelkerns (Abbildung 1A). Nach dem Befüllen ist es wichtig, die Partikel richtig zu versiegeln. Abbildung 1B zeigt mehrere Ergebnisse (erfolgreich und erfolglos) des Versiegelungsprozesses. Nach 12 s Versiegelungszeit verbleibt ein deutlicher Weg vom Partikelzentrum zur Außenseite des Partikels, was ein Partikel zeigt, das nicht vollständig versiegelt ist. Umgekehrt schmilzt das PLGA fast vollständig, wenn es 36 s lang versiegelt wird, was zu einer Mikrostruktur mit einem flachen Profil führt. Die ideale Morphologie kann visualisiert werden, wenn Partikel für 18 und 24 s versiegelt werden, da sie Fracht enthalten, die vollständig vom Polymer eingekapselt ist, während eine Partikelstruktur erhalten bleibt. Abbildung 1C zeigt mehrere mögliche Ergebnisse nach dem Befüllen und Versiegeln. Wenn das Lösungsmittel während des Dosierens den Partikelboden nicht erreicht, bleibt der gelöste Stoff in der Mitte des Partikelkerns getrocknet (falsch gefüllt); Obwohl diese Partikel immer noch versiegeln können, kann die schlechte Beladung der Fracht die Ladeeffizienz einschränken. Werden Partikel mit zu viel Ladung gefüllt (überfüllt), wird der Versiegelungsprozess gehemmt, da die Ladung verhindert, dass PLGA über die Öffnung fließt. Bei korrekter Befüllung und Versiegelung sind Partikel dieser Geometrie klein genug, um problemlos in eine 19-G-Nadel zu passen. Darüber hinaus flossen 10 Partikel konsistent durch eine 19-G-Nadel (100 % ± 0 %), wenn sie mit einer viskosen Lösung, wie z. B. 2 % Carboxymethylcellulose, injiziert wurden (ergänzende Abbildung 7).

Abbildung 1: Häufige Probleme beim Befüll- und Verschließungsprozess . (A) Die Abbildungen zeigen die Verdampfung des Lösungsmittels nach einem Füllzyklus, bei dem die Partikel mit 6 nL 100 mg/ml in Wasser gelöstem Fluorescein-Natriumsalz beladen werden. (B) Repräsentative Bilder von 502H-PLGA-Partikeln, die nach 0, 12, 18, 24 und 36 s aus dem Versiegelungsprozess entfernt wurden. (C) Unterschiedliche Ergebnisse des Versiegelungsprozesses, wenn die Partikel korrekt, falsch oder übergefüllt sind. Bilder werden erzeugt, indem mehrere Bilder gestapelt und mit einer Focus-Stacking-Software zusammengeführt werden. Maßstabsbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Verarbeitung des Antigens durch einen Spinfilter vor dem Laden in die Partikel ist aus zwei Gründen wichtig. Erstens dient die Zentrifugation dazu, Stammhilfsstoffe in der Impfstofflösung zu entfernen, die die Partikelbeladungskapazität einschränken können, während das RABV-Antigen erhalten bleibt. Das aktuelle Protokoll reinigt das Antigen um etwa das 50-fache. Zweitens wird das Antigen während dieses Prozesses ebenfalls konzentriert. Abbildung 2A zeigt eine Mikroskopaufnahme der intakten RABV-Virionen in der konzentrierten Antigenprobe. Dieses Antigen ist etwa 4,4-fach konzentrierter als die Ausgangslösung (Abbildung 2B). Die Menge an Antigen, die anfänglich in die Zentrifugal-Spin-Filter geladen wird, kann geändert werden, um die erreichte endgültige Faltungskonzentration zu modulieren. Zum Beispiel führt die Beladung mit 40 μl Stammantigen zu einer etwa 1,75-fachen Konzentration. Ergänzend zeigt Abbildung 8 die Bedeutung des Wirbelns (Schritt 5.15) im Konzentrationsprozess. Die Vernachlässigung oder unsachgemäße Verwirbelung der Proben schränkt den Konzentrationsprozess ein.

Abbildung 2: Antigenkonzentration. Die Konzentration des Antigens durch Zentrifugalfiltration wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (A) gezeigt und durch ELISA (B) bestätigt. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Die statistische Analyse erfolgt unter Verwendung der Mehrfachvergleichstests von Tukey mit einfaktorieller ANOVA. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3A zeigt konzentriertes Antigen, das in unversiegelte und versiegelte Partikel gefüllt ist. Obwohl eine beträchtliche Menge an Antigen in die Partikel geladen ist (0,0469 ± 0,0086 IE), macht dieses Material <90 % der Partikelkapazität aus, so dass ausreichend Platz für die Beladung mit zusätzlichem Antigen bleibt. Interessanterweise enthalten unversiegelte Partikel nur 0,0396 ± 0,0077 IE, was nur 85 % ± 16 % der geladenen Gesamtmenge ausmacht. Obwohl es sich um einen statistisch nicht signifikanten Verlust handelt, kann ein Teil des RABV-Antigens während der wiederholten Rehydrierung und Trocknung im Abfüllprozess denaturiert worden sein. Nach der Versiegelung bleiben 69 % ± 5 % des Antigens in bioaktiver Form verkapselt. Obwohl dies darauf hindeutet, dass während des Versiegelungsprozesses aufgrund von thermischem Stress erhebliche Verluste auftreten, bleibt der größte Teil des inaktivierten viralen Antigens intakt (Abbildung 3B). Die Co-Verkapselung stabilisierender Hilfsstoffe zusammen mit dem Antigen ist eine mögliche Strategie, um die Antigenstabilität während des gesamten Herstellungsprozesses weiter zu erhöhen, und war bereits bei anderen inaktivierten Virusantigenen erfolgreich^14,15.

Abbildung 3: Bioaktives RABV-Antigen nach der Partikelherstellung. (A) Die Bilder zeigen unversiegelte und versiegelte Partikel, die das RABV-Antigen enthalten. (B) Antigenstabilität durch den Partikelherstellungsprozess (n = 4). Die Beladungskontrolle wird durch die Abgabe des Antigens direkt in die Lösung erzeugt. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Maßstabsbalken = 200 μm. Die statistische Analyse erfolgt unter Verwendung der Mehrfachvergleichstests von Tukey mit einfaktorieller ANOVA. *p < 0,05. Bilder werden erzeugt, indem mehrere Bilder gestapelt und mit einer Focus-Stacking-Software zusammengeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Partikel-, Passermarken- und Array-Dimensionen. Die Abbildung zeigt die geometrischen Eigenschaften des Vierzacksterns (A), des zylindrischen Mikropartikels (B), des Fünfzacksterns (C) und einer Reihe von Partikeln mit Passermarken (D), die in der CAD-Software angezeigt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Diese Abbildung zeigt einen Querschnitt der Struktur, die in den Ofen gelegt wird, um PDMS-Formen auszuhärten. Pfeile zeigen an, wo Binderklammern angebracht sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Geeignete Technik zur effizienten Rückgewinnung von konzentriertem Antigen. Am Ende des ersten Spins wird die konzentrierte Probe rot eingekreist (A) im Filter zurückgehalten, während das Filtrat am Boden des Sammelrohrs (größeres Außenrohr) gesammelt wird. Um das pelletierte Antigen zu resuspendieren, wird die Zentrifugalfiltereinheit mit dem Sammelrohr (B) verschlossen, um das Vortexen vorzubereiten. Beim Wirbeln wird die Spitze des Rohrs in Kontakt mit dem Wirbelkissen gehalten und das Kappenende unter Beibehaltung eines 45°-Winkels mit dem Wirbelkissen (C) gedreht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Piezoelektrischer Dispenser mit Vorlaufprogrammierung. (A) Richten Sie die Funktion "Zielreferenzpunkte suchen" ein, indem Sie von der Registerkarte "Haupteinstellungen" zur Funktion "Robot Setup > Miscellaneous >Div. > Find Target Reference Points navigieren. Verwenden Sie die blau hinterlegten Schaltflächen, um die Treuhänderzeichen zu setzen. Wählen Sie zunächst "Vorlage lernen" und zeichnen Sie ein Kästchen um die Treuhandmarke, überprüfen Sie die Genauigkeit der Vorlage, indem Sie auf "Vorlage suchen" klicken, und speichern Sie die Vorlage. Tun Sie dies für die vier- und fünfzackigen Sterne und speichern Sie die Dateinamen gemäß den Anweisungen unter Verwenden von zwei verschiedenen Vorlagenbildern. Stellen Sie als Nächstes sicher, dass alle Parameter in den Blackboxen übereinstimmen. Laden Sie das vierzackige Passermarkenzeichen mit der Vorlage laden (grünes Kästchen). Speichern Sie das Programm "Zielreferenzpunkte suchen", indem Sie Aufgabenliste (orangefarbenes Kästchen) auswählen. (B) Richten Sie den Lauf ein, indem Sie zur Registerkarte Robot Setup > Tasks navigieren, und laden Sie dann die im blauen Feld angezeigte Sequenz von Tasks, indem Sie Aufgaben aus der Aufgabenliste (schwarzes Kästchen) hinzufügen, indem Sie die Auswahl Task in Run (grünes Kästchen) verwenden. Speichern Sie abschließend die Aufgabe (orangefarbenes Kästchen). (C) Richten Sie das "Zielsubstrat" ein, indem Sie zum Roboter-Setup > Zielsubstrat navigieren und dann ein Ziel hinzufügen (blaues Kästchen). (D) Geben Sie die hier angezeigten Parameter ein und wählen Sie Speichern (blaues Kästchen). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Laden des Antigens und Kalibrieren des Dispending-Alignments. (A) Navigieren Sie zur Registerkarte " Nozzle Setup > Do Task " und saugen Sie 10 μl des Antigens in die Dosierspitze ein, indem Sie TakeProbe10 uL (Black Box) auswählen und auf DO (Black Box) klicken. (B) Es öffnet sich ein separates Fenster. Wählen Sie die Vertiefung aus, in die das konzentrierte Antigen geladen wurde, und wählen Sie OK (blaues Kästchen). (C) Nachdem das Antigen abgesaugt wurde, waschen Sie die Spitze, indem Sie das blaue Kästchen auswählen, und wiederholen Sie dieses Waschen noch zweimal. Wählen Sie die Kamera (schwarzes Kästchen) aus und bestimmen Sie das Tropfenvolumen, indem Sie das Tropfenvolumen (grünes Kästchen) auswählen. Stellen Sie sicher, dass sich ein stabiler Tropfen mit einer Volumenstandardabweichung (%) <2 (orangefarbenes Kästchen) bildet. (D) Wenn Sie diese Schritte ausführen, wird die Snap Drop Cam geöffnet. Wählen Sie Bild (blaues Feld) im Dropdown-Menü und wählen Sie Düsenkopfkamera-Assistent aus. Es öffnet sich ein neues Fenster. Führen Sie die nächste Schrittfolge schnell aus. (E) Stellen Sie sicher, dass das in der ergänzenden Abbildung 4 erstellte Ziel geladen ist, und wählen Sie dann Zum Ziel verschieben (blaues Kästchen). Stellen Sie die Tropfen auf 15 ein und wählen Sie Spot (schwarzes Kästchen ). Sobald Sie entdeckt wurden, wählen Sie sofort Verschieben (grünes Kästchen ). Stellen Sie sicher, dass die automatische Suche ausgewählt ist, löschen Sie die Partikelgröße = 12 und klicken Sie dann auf Start (orangefarbene Kästchen). Wenn die automatische Erkennung fehlschlägt, wiederholen Sie diesen Vorgang, nachdem Sie zu einem anderen Bereich auf der Folie gewechselt sind (violettes Kästchen). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzend Abbildung 6: Programmieren des Spotting-Arrays und Starten des Laufs. (A) Navigieren Sie zu Target Setup > Target und geben Sie dann die im blauen Feld angezeigten Parameter ein. (B) Navigieren Sie als Nächstes zur Registerkarte "Feldeinrichtung" und geben Sie 20 in das Feld Nr. des Drops-Feldes (blaues Kästchen), wählen Sie ein Vertiefungsfeld (schwarzes Kästchen) aus und wählen Sie dann Ziele/Partikel aus, in die ausgegeben werden soll (grünes Kästchen). Durch die Auswahl einer anderen Vertiefung und die erneute Auswahl der Ziele/Partikel werden zusätzliche Füllzyklen während eines einzigen Durchlaufs durchgeführt. (C) Stellen Sie sicher, dass auf dem Hauptbildschirm die in der ergänzenden Abbildung 5 erstellte Ausführung und das Ziel ausgewählt sind. (D) Navigieren Sie zur Registerkarte "Ausführen" und wählen Sie Ausführung starten (blaues Kästchen). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: Injizierbarkeit von Mikropartikeln. (A-C) Fokusgestapelte Stereoskopbilder von Mikropartikeln, die mit Fluorescein-Natriumsalz gefüllt und in einer 19-G-Nadel versiegelt sind. (D) Insgesamt wurden 10 Partikel durch eine 19-G-Nadel mit einer 2%igen Carboxymethylcelluloselösung (n = 8) injiziert. Maßstabsleiste = 1 mm. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 8: Mögliche Probleme mit der Antigenkonzentration. Die rote Linie zeigt den zu erwartenden Konzentrationsanstieg der Faltung an. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung der multiplen Vergleichstests von Tukey mit einfaktorieller ANOVA. p < 0,001, ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdossier 1: Herstellung von Puffern und Lösungen für RABV-ELISA. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 1: STL-Datei mit Partikelarray. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Codierungsdatei 2: STL-Datei mit Geometrie für den benutzerdefinierten Objektträgerhalter, der zum Versiegeln von Partikeln verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Es ist möglich, die Partikelgeometrie für spezifische Anforderungen zu ändern. Für zylindrische Strukturen empfehlen die Autoren jedoch, ein im Protokoll beschriebenes Verhältnis von 5:4:1 von Höhe:Durchmesser:Wanddicke beizubehalten. Dieses Aspektverhältnis stellt sicher, dass genügend PLGA-Material vorhanden ist, um die Partikel zu versiegeln und mechanisch robust genug für die Handhabung zu bleiben. Partikelabmessungen und -formen können während des CAD-Prozesses leicht geändert werden, wodurch eine Vielzahl von Geometrien generiert werden kann. Die Kombination der Flexibilität des CAD mit dem 3D-Druck ermöglicht die schnelle Iteration von Mikropartikeldesigns. Obwohl dieses Protokoll einen Multi-Photonen-3D-Drucker verwendet, kann jeder 3D-Drucker mit Spezifikationen, die in der Lage sind, die Mikrostrukturabmessungen in einem geeigneten Material zu drucken, zur Erzeugung der ersten Urform verwendet werden. Darüber hinaus wurde die Fotolithografie früher verwendet, um ähnliche Strukturen in Arrays herzustellen, die viel größer sind als die, die in diesem Protokoll erzeugt werden. Der Arbeitsaufwand, die Verzögerung bei der Bestellung maßgeschneiderter Fotomasken und die Zugänglichkeit der Ausrüstung würden jedoch den iterativen Designprozess^{verlangsamen 16}. Schließlich kann die Herstellung von Stammformen an Honorarunternehmen ausgelagert werden, wenn eine interne Herstellung von Stammformen nicht möglich ist. Unabhängig vom 3D-Drucker oder der Methode, mit der die Urformen hergestellt werden, ist die Haftung des Drucks auf dem Substrat für nachgelagerte Schritte entscheidend. Insbesondere, wenn die Haftung während der PDMS-Formerzeugung unzureichend ist, verbleiben gedruckte Partikel in der PDMS-Form, was eine manuelle Entfernung der gedruckten Partikel und die Zerstörung der Stammform erfordert.

Die Partikelfüllung ist ein weiterer kritischer Aspekt, den es zu berücksichtigen gilt. Mikropartikel haben nur begrenzte Füllkapazitäten, so dass die Filtration nicht nur zur Konzentration des RABV-Antigens verwendet wird, sondern auch zur Entfernung von Hilfsstoffen, die sonst einen großen Teil des Mikropartikelkernvolumens einnehmen würden. Aufgrund der Größe des RABV-Antigens (ca. 60 nm x 180 nm)¹⁷ ist es jedoch möglich, das Antigen während der Zentrifugationsschritte teilweise zu pelletieren. Aus diesem Grund ist es wichtig, das Antigen nach der Zentrifugation durch Pipettieren oder Vortexen zu resuspendieren, um eine hohe Wiederfindung des RABV-Antigens zu erreichen. Eine hochkonzentrierte Lösung ist ideal für die Dosierung, da sie die Dosierzyklen verkürzt und dadurch den Antigenabbau während der Abfüllung begrenzt. Die Viskosität ist jedoch eine wesentliche Einschränkung für piezoelektrische Dosierroboter, die einen stabilen Tropfen bilden, so dass das Dosieren einer sehr hochkonzentrierten Lösung möglicherweise nicht möglich oder ratsam ist. Das Verdünnen der Fülllösung ist der einfachste Weg, um eine stabile Tropfenbildung zu erreichen, aber die Antigenstabilität über die zusätzlichen Füllzyklen, die erforderlich sind, um die gewünschte Beladung zu erreichen, und die längere Zeit, die zum Abfüllen der Partikel benötigt wird, sollten berücksichtigt werden.

Begrenzungen
Diese Methode erfordert hochspezialisierte Anlagen zur Herstellung der ersten Formen und ein spezielles Füllinstrument für die Mikropartikelproduktion. Obwohl der Bedarf an einem 3D-Drucker mit einer Druckauflösung, die in der Lage ist, die ersten Urformen zu erzeugen, durch einen Fee-for-Service-Ansatz untergraben werden kann, ist der Zugang zu einem piezoelektrischen Dosierroboter begrenzt. Die Anschaffung eines piezoelektrischen Dosierroboters erfordert eine erhebliche Anfangsinvestition, die je nach Marke, Durchsatz und Fähigkeiten oft zwischen 80.000 und 200.000 US-Dollar liegt. Obwohl mehrere andere Füllungsmethoden mögliche Alternativen darstellen, wurden diese Methoden nicht mit dem RABV-Antigen¹² validiert.

Zukünftige Anwendungen
Ein erheblicher Teil des verkapselten RABV-Antigens blieb während des Versiegelungsprozesses stabil. Theoretisch könnten durch den Einbau dieses Antigens in Partikel, die aus verschiedenen PLGA-Typen bestehen, die den Verabreichungszeitplan der postexpositionellen Prophylaxebehandlung nachahmen, alle Dosen in einer einzigen Injektion verabreicht werden. Durch den Wegfall wiederholter Krankenhausbesuche zur Verabreichung zusätzlicher Dosen wird die Compliance der Patienten verbessert, was zu besseren Behandlungsergebnissen führt. Nachdem die Fähigkeit gezeigt wurde, die ELISA-Reaktivität des hochkomplexen inaktivierten Tollwutvirus aufrechtzuerhalten, ist es wahrscheinlich, dass andere Antigene, einschließlich Subunit-Impfstoffe, mit dieser Verkapselungsmethode kompatibel sind. Die Verwendung anderer prophylaktischer Antigene mit PULSED-Mikropartikeln könnte Millionen von Leben in LMICs retten, indem die Impfraten von unzureichend geimpften Bevölkerungsgruppen erhöht werden. Um dies zu erreichen, müssen die Impfstoffe jedoch nicht nur durch die Verkapselung, sondern auch durch die Freisetzung stabil bleiben, was eine Herausforderung darstellen kann, da die Nutzlast aufgrund von Körperwärme und PLGA-Abbauprodukten erhöhten Temperaturen und einer potenziell sauren Mikroumgebung ausgesetzt ist¹⁸. Zukünftige Arbeiten werden Strategien zur Stabilisierung des Antigens durch Freisetzung verfolgen, was das Potenzial für eine Impfplattform mit einer einzigen Injektion eröffnen würde, die breit anwendbar ist, um viele Infektionskrankheiten zu verhindern.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 &Mikro; m PES-Filter	Cole-Parmer + B4B2: B63	04396-26
0,25 mm Unterlegscheiben	McMaster Carr	98090A935
0,75 Zoll Binder Clips	Heftklammern	480114
10 mL Spritze	Becton, Dickinson and Company	309604
10 mL  Sterile serologische Einwegpipetten aus Polystyrol mit Lupe Streifen	Fisherbrand	13-678-11E
101,6 mm C-Klemme	Amazon	PT-SD-CP01A	Der schwarze Griff fällt schließlich ab. Verwenden Sie eine Zange, um dies einzustellen.
19 G Nadel	EXCELINT	26438
25 mL  Sterile serologische Einwegpipetten aus Polystyrol mit Lupenstreifen	Fisherbrand	13-678-11
3-(Trimethoxysilyl) propylmethacrylat	Millipore Sigma	M6514-25ML
5 ml  Sterile serologische Einwegpipetten aus Polystyrol mit Lupenstreifen	Eppendorf	22431081
50 mL Zentrifugenröhrchen	Corning
50 mL  Sterile serologische Einwegpipetten aus Polystyrol mit Lupenstreifen	Fisherbrand	13-678-11F
Aceton	Fisher	AC268310010
Aluminiumblock	McMaster Carr	9057K175
Aluminiumfolie	VWR	89079-069
Amicon Ultra 0,5 mL Zentrifugalfilter, 100 kDa	Millipore Sigma	C82301
Anti-Tollwutvirus-Antikörper, serumfreier Antikörper, Klon 1112-1, 100	Fisherbrand	13-678-11D
Anti-Tollwutvirus-Maus-Monoklonaler Antikörper, Klon D1-25, biotinyliert	Fisherbrand	14-388-100
Carboxymethylcellulose	Tokyo Chemical Industries	C0045
ClipTip 300, Filter, im Rack	Fisherbrand	13-678-11
Costar 0,65 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss mit niedriger Bindung	Corning	3206
Costar 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss mit niedriger Bindung	Corning	3207
Beschreiben Sie	die Nanoscribe-Software		, die zum Definieren der Druckparameter für den Nanoscribe 3D-Drucker verwendet wird, ist Schritt 1.2. Software, die mit dem Drucker geliefert wird.
Exsikkator	Fisher Scientific	10529901	oder gleichwertige
doppelseitige	Klebebandklammern	649280
DPBS (10x), kein Kalzium, kein Magnesium	Gibco	14200075
Ethanol	VWR	89370-084
F1-ClipTip Mehrkanalpipetten, 30 bis 300 &; Mikro; L	Fisherbrand	13-678-11E
Fisherbrand SureOne Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere, 0,1 – 10 & micro; L	Fisherbrand	13-678-11F
Fisherbrand SureOne Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere, 100 – 1000 & micro; L	Fisherbrand	03-448-17
Fisherbrand SureOne Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere, 2 – 20 & micro; L	Fisherbrand	FB14955202
Fisherbrand SureOne Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere, 20 & 200 & Mikro; L	Fisherbrand	13-374-10
Fisherbrand  Elite Pipettenset	Fisherbrand	05-408-137
Fisherbrand  Pipettier-Steuerung	Fisherbrand	FB14955202
Petrischale aus Glas, 90 mm	VWR	470313-346
Objektträger	Globe Scientific	1380-10
Helicon Focus 8	HeliconSoft		Software zum Fokussieren von Stack-Bildern
IP-Q Resin	Nanoscribe		Das Druckerharz ist mit der 10-fach-Linse kompatibel und wird zum Drucken großer Mikrostrukturen auf dem Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermoelement	Amazon	5053485896236	oder gleichwertiger
Microscope Slide Box	Millipore Sigma	Z374385-1EA	oder gleichwertigem
Nanoscribe Photonic Professional GT2 mit 10X Objektiv	Nanoscribe
verwendetNanoWrite	Nanoscribe		Software für die Schnittstelle mit dem nanoscrive 3D-Drucker. Software, die mit dem Drucker geliefert wird.
Nunc MaxiSorp 96-Well-Platte mit flachem Boden	Invitrogen	44-2404-21
OPD-Substrattabletten (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid)	Fisherbrand	02-707-432
Parafilm M Verpackungsfolie, 4 Zoll	Fisherbrand	13-374-10
PDC 60 mit Typ 3 Beschichtung	Scienion	P-2020
PDMS Partikelformen	Rice University	n/a	N/A- Partikel sind 400 μ m Durchmesser bei einer Wandstärke von 100 μ m und einer Höhe von 500 μm; m, woraus sich ein Innendurchmesser von 200 μm ergibt. Die Arrays sind 14 x 22 Teilchen im Abstand von 600 μm; m voneinander entfernt. 4- und 5-zackige Sterne werden als Passermarken verwendet, positioniert 600 μ m rechts und links von den oberen rechten und oberen linken Partikeln auf dem Array.
Petrischale	Fisher Scientific	08-757-100D
Pierce Stabiler Peroxid-Substratpuffer (10x)	Fisherbrand	02-707-430
Plastikbecher	Fisher Scientific	S04170
PLGA Film, 502H	Sigma	502H: 719897-1G
Propylenglykol Monomethyletheracetat	Millipore Sigma	484431
Rabies Antigen	Chiron Behring und Bharat Biotech International		Material wurden durch den Abschluss einer Materialtransfervereinbarung mit dem Unternehmen erworben.
Rasierklingen	VWR	55411-050
Skalpell	VWR	21899-530 und 76457-512
SciFLEXARRAYER S3 mit PCD 60	Scienion		oder gleichwertig
Dichtband für 96-Well-Platten	Thermo Scientific	15036
Silizium Wafer	University Wafer	1025
Federklemmen	IRWIN
Edelstahlblock	McMaster Carr	9083K12
Streptavidin− Peroxidase-Polymer, hochempfindlich	Fisherbrand	02-707-404
Sylgard 184	DOW	2646340
Teflonblatt	McMaster Carr	9266K12	Wird zur Herstellung von PLGA-Folien verwendet. Muss in entsprechend große Stücke geschnitten werden.
Teflonplatte, 0,8 mm dick	McMaster Carr	9266K81
Trichlor(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) Silane	Sigma	448931-10G
Pinzette	Pixnor	ESD-16
UltraPure Distilled	Water Fisher Scientific	10977015
UV Oven, CL-1000S UV Crosslinker	UVP	95-0174-01	Oder gleichwertiger
Vakuum-Exsikkator	Bel-Art	F420100000	Hinweis: Sie benötigen zwei davon. Eine wird ausschließlich zur Vorbehandlung von Proben mit Trichlor(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyl)-Silan verwendet, um eine Kontamination zu verhindern.
Vakuumofen mit einer Auflösung von 120 & Grad; C	VWR	97027-664	oder gleichwertiger
Unterdruck, CRVpro4	Welch	3041-01	Oder gleichwertig
Zungenspatel aus Holz	Elektronenmikroskopie Sciences	72320