Methodenartikel

Zellbasierte elektrische Impedanzplattform zur Evaluierung von Zika-Virus-Inhibitoren in Echtzeit

DOI:

10.3791/65149

⸱

24. März 2023

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Rega Institute for Medical Research, Laboratory of Virology and Chemotherapy, KU Leuven

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier demonstrieren wir die Verwendung der zellbasierten elektrischen Impedanz (CEI) als eine sehr einfache und unkomplizierte Methode, um die Infektion und Replikation des Zika-Virus in menschlichen Zellen in Echtzeit zu untersuchen. Darüber hinaus ist der CEI-Assay nützlich für die Bewertung antiviraler Verbindungen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die zellbasierte elektrische Impedanztechnologie (CEI) misst Impedanzänderungen, die durch eine wachsende oder manipulierte adhärente Zellmonoschicht auf Kulturplattenvertiefungen verursacht werden, in die Elektroden eingebettet sind. Die Technologie kann verwendet werden, um die Folgen einer Infektion mit dem Zika-Virus (ZIKV) und die adhärente Zellreplikation in Echtzeit zu überwachen, da dieses Virus stark zytopathogen ist. Es handelt sich um einen unkomplizierten Assay, der keine Markierungen oder invasiven Methoden erfordert und den Vorteil hat, Echtzeitdaten zu liefern. Die Kinetik der ZIKV-Infektion hängt stark von der verwendeten Zelllinie, dem Virusstamm und der Multiplizität der Infektion (MOI) ab, die mit herkömmlichen Endpunkt-Assays nicht einfach untersucht werden kann. Darüber hinaus kann der CEI-Assay auch zur Bewertung und Charakterisierung von antiviralen Verbindungen verwendet werden, die ebenfalls dynamische inhibitorische Eigenschaften im Verlauf der Infektion aufweisen können. Dieser Methodenartikel erläutert ausführlich die praktische Durchführung des CEI-Tests und seine Anwendungsmöglichkeiten in der ZIKV-Forschung und der antiviralen Forschung im Allgemeinen.

Einleitung

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Ausbrüche des Zika-Virus (ZIKV) sind mit schwerwiegenden Krankheitskomplikationen wie Mikrozephalie und Guillain-Barré-Syndrom verbunden 1,2,3. Obwohl zukünftige Epidemien aufgrund verschiedener Risikofaktoren wie der Ausbreitung von Mückenvektoren und der zunehmenden Urbanisierung plausibel sind, hat es bisher noch kein Impfstoff oder antivirales Medikament auf den Markt geschafft 3,4. Daher sollten traditionelle ZIKV-Forschungsmethoden durch neuartige Werkzeuge ergänzt werden, um dieses Virus und seine potenziellen antiviralen Verbindungen zu untersuchen. Die antivirale Forschung basiert häufig auf phänotypischen Assays, bei denen der Endpunkt das Vorhandensein eines bestimmten Parameters ist, wie z. B. das Auftreten eines virusinduzierten zytopathischen Effekts (CPE) oder die Produktion eines bestimmten virusinduzierten Proteins mittels eines Reportergens 5,6,7. Diese Methoden verfügen jedoch über Endpunktauslesungen, sind arbeitsintensiv und erfordern möglicherweise eine komplexe Analyse. Impedanzbasierte Verfahren bieten daher eine attraktive Alternative.

Die zellbasierte elektrische Impedanz (CEI) ist definiert als der Widerstand gegen den Stromfluss von einer Elektrode zur anderen, der durch eine adhärente Zellschicht verursacht wird, die auf elektrodenhaltigen Vertiefungen liegt. Die etablierte CEI-Technologie, die in dieser Methodik verwendet wird, ist Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS), die ursprünglich von Giaever und Keese entwickelt wurde 8,9. Dies wird in einem breiten Feld biologischer Forschungsbereiche eingesetzt, wie z. B. Krebsmetastasierung, Toxikologie und Wundheilung10,11,12. Sein Prinzip beruht auf einem elektrischen Feld, das durch ein kontinuierliches Schwenken von Wechselstromspannungen (AC) über einen Frequenzbereicherzeugt wird 13. Die Zellen werden diesen nicht-invasiven elektrischen Feldern ausgesetzt, und in vorbestimmten Intervallen werden die durch Zellwachstum verursachten Impedanzänderungen oder Änderungen der Zelladhärenz oder -morphologie gemessen14. Darüber hinaus führt eine veränderte Zellviabilität auch zu Impedanzänderungen, was die Technologie zu einem nützlichen Werkzeug zur Überwachung von Infektionen mit zytopathogenen Viren macht15,16,17. Da morphologische Veränderungen der Zellschicht im nanoskaligen Bereich detektiert werden sollen, bietet die Technologie ein hochempfindliches Detektionswerkzeug. Der in diesem Artikel beschriebene CEI-Assay ist eine einfache, nicht-invasive, markierungsfreie Echtzeit-Methode zur Messung der Impedanzänderungen der Zellschicht im Laufe der Zeit.

Obwohl CEI nicht zur Beurteilung des Verlaufs einer ZIKV-Infektion oder ihrer potenziellen Virostatika verwendet wurde, wurde ihre Verwendung als diagnostisches Instrument bereits vordem 18. Lebensjahr untersucht. In einer aktuellen Studie wurde erstmals die Verwendung des CEI-Assays zur Bestimmung der antiviralen Aktivität mehrerer ZIKV-Inhibitoren in A549-Zellen validiert19. Dieser Methodenartikel beschreibt diesen CEI-Assay genauer und erweitert ihn auf verschiedene adhärente Zelllinien sowie eine Vielzahl von ZIKV-Stämmen bei verschiedenen Infektionsmultiplizitäten (MOI). Hiermit wird der vielseitige Einsatz dieser Methode in der antiviralen Flavivirenforschung demonstriert. Die Methode hat den entscheidenden Vorteil des Echtzeit-Zellmonitorings, das die Detektion wichtiger Infektionszeitpunkte und die dynamische Hemmaktivität potenzieller antiviraler Verbindungen ermöglicht. Zusammengenommen bietet die CEI-Technologie ein leistungsstarkes und wertvolles Werkzeug, um das derzeitige Angebot an antiviralen Methoden zu ergänzen.

Protokoll

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Alle beschriebenen Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow-Schrank eines Labors der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt. Alle verwendeten Viren wurden gemäß den Regeln eines belgischen institutionellen Prüfungsausschusses (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, Protokoll SBB 219 2011/0011) und des Ausschusses für biologische Sicherheit der KU Leuven beschafft und zugelassen.

1. Pflege der Zellkultur

HINWEIS: Dieses Protokoll wird mit einer Auswahl von Zelllinien durchgeführt, kann aber natürlich an jede adhärente Zelllinie angepasst werden, wobei nur eine Optimierung der Zellkeimdichte erforderlich ist.

  1. Die humane Lungenadenokarzinom-Zelllinie A549, die humane maligne Glioblastom-Zelllinie U87 und die humanen embryonalen Lungenfibroblastenzellen HEL 299 werden in T75-Kulturflaschen bei 37 °C und 5 % CO2 in einem befeuchteten Inkubator gezüchtet.
  2. Subkultur der Zellen bei 80%-95% Konfluenz. Alle Reagenzien sollten vor der Kultivierung der Zellen bei Raumtemperatur (RT) behandelt werden.
  3. Entfernen Sie das konditionierte Nährmedium aus den Zellen. Verwenden Sie 5 ml der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco, um die Zellmonoschicht einmal zu waschen.
  4. Verteilen Sie 1 ml 0,25%ige Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gleichmäßig über die Zellmonoschicht. Anschließend bis zu 3 min bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen zu lösen beginnen.
  5. Fügen Sie 9 ml frisches, vollständiges Nährmedium hinzu (siehe Materialtabelle für Details). Pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen wieder zu suspendieren.
  6. Übertragen Sie das gewünschte Volumen der Zellsuspension in einen neuen T75-Kulturkolben und fügen Sie ein geeignetes Volumen frisches Wachstumsmedium hinzu, um ein Gesamtvolumen von 15 ml zu erhalten.
    HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten In-vitro-Zelllinien werden je nach Zelllinie in Verdünnungen von 1:4 bis 1:10 subkultiviert, um ideale Wachstumsbedingungen zu ermöglichen. Subkulturen werden alle 3-4 Tage durchgeführt, so dass das gewünschte Zellsuspensionsvolumen auch je nach Anzahl der Inkubationstage variieren kann.

2. Vorbereitung der CEI-Platte

  1. Man nehme eine 96-Well-Platte mit interdigitalisierten Elektroden (siehe Materialtabelle) und fülle alle Wells mit 100 μl Nährmedium.
  2. Füllen Sie die Zwischenräume zwischen den Vertiefungen mit DPBS.
    HINWEIS: Dies geschieht, um den Kanteneffekt aufgrund der Verdunstung zu reduzieren, der bei der Kultivierung von Zellen in 96-Well-Platten beobachtet wird.
  3. Die Platte wird 4 h bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 inkubiert.

3. Aussaat von Zellen

  1. Lösen Sie die Zellen wie in Abschnitt 1 beschrieben aus dem Kulturkolben und resuspendieren Sie sie in frischem Nährmedium in einem 50-ml-Röhrchen.
  2. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit der Methode Ihrer Wahl.
    HINWEIS: Im Fall von A549-Zellen erreicht die Viabilität im Allgemeinen ~100%. Zur Bestimmung der Zellzahl verwenden wir ein automatisiertes Zellanalysesystem, das auf Acridinorange/Propidiumiodid-Färbung basiert (siehe Materialtabelle). Andere Methoden zur Zellzählung funktionieren ebenso gut.
  3. Resuspendieren Sie die Zellen in frischem Wachstumsmedium, um die gewünschte Zelldichte zu erreichen. In dieser Studie beträgt die optimale A549-Zelldichte 0,15 × 106 (lebensfähige) Zellen/ml.
  4. Nehmen Sie die 96-Well-Platte mit den interdigitalisierten Elektroden aus dem Inkubator und entfernen Sie das Medium mit einer Mehrkanalpipette.
  5. Geben Sie 100 μl der Zellsuspension (in diesem Fall entsprechend 15 × 103 Zellen) pro Well in die 96-Well-Platte.
  6. Lassen Sie die Zellen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur ausgleichen, bevor Sie sie in das CEI-Gerät einsetzen.

4. Einrichten und Ausführen des CEI-Assays

  1. Stellen Sie den Inkubator, in dem sich der CEI-Geräteplattenhalter befindet, bei 37 °C und 5 % CO2 auf.
  2. Setzen Sie die 96-Well-Platte in das Gerät ein.
  3. Öffnen Sie die Software des Geräts, und richten Sie ein neues Experiment ein, indem Sie im Bereich Daten erfassen auf Setup klicken. Warten Sie, bis der Laptop mit dem ECIS-Gerät verbunden ist, und konfigurieren Sie die Platte, indem Sie die Impedanzen der Wells überprüfen. Überprüfen Sie, ob alle Vertiefungen korrekt konfiguriert sind, was durch eine grüne Farbe angezeigt wird. Wenn nicht, wiederholen Sie Schritt 4.2, bis alle Vertiefungen grün sind.
  4. Wählen Sie im Bereich Well-Konfiguration den Array-Typ entsprechend der verwendeten Cultureware aus.
  5. Wählen Sie den Modus Mehrere Frequenzen/Zeit.
    Anmerkungen: In diesem Modus misst das Gerät Impedanzänderungen in einem Frequenzbereich.
  6. Starten Sie die Messung, indem Sie auf Start klicken.
    HINWEIS: Die Echtzeit-Impedanz kann über die Benutzeroberfläche der Software überwacht werden. Wählen Sie die gewünschte Frequenz aus, die angezeigt werden soll. In diesem Beispiel wird 16 kHz gewählt.

5. Präparation und Inkubation

HINWEIS: Als Beispiel für eine antivirale Verbindung wird Labyrinthopeptin A1 verwendet (siehe Materialtabelle). Da dieses Protokoll auf alle Verbindungen mit potenzieller antiviraler Aktivität verallgemeinert werden kann, bezeichnen wir es als "die Verbindung".

  1. Lassen Sie das vollständige Zellkulturmedium ohne Zusatz von fötalem Kälberserum (FBS) (als "Assay-Puffer" bezeichnet) bei RT äquilibrieren.
  2. Bewahren Sie die Verbindungen auf Eis auf.
  3. Bereiten Sie eine 10-fache konzentrierte Verdünnung jeder Verbindung in Assay-Medium in 5-ml-Polypropylenröhrchen vor.
  4. Die Verbindungen werden seriell in Assaymedium in 5-ml-Polypropylenröhrchen verdünnt, um die gewünschten 10-fachen Konzentrationen zu erhalten.
  5. Halten Sie das CEI-Gerät an, indem Sie im Bereich "Datenerfassungseinrichtung" auf "Anhalten" klicken. Warten Sie, bis der aktuelle Zeitpunkt abgeschlossen ist, und nehmen Sie die 96-Well-Platte heraus.
  6. Überprüfen Sie die Adhärenz und Monolagenbildung der Zellen unter einem Lichtmikroskop.
  7. Entnehmen Sie 20 μl aus jeder Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette.
  8. Geben Sie 20 μl Verbindungslösung oder Vehikel in die gewünschten Vertiefungen. Bereiten Sie ein Layout mit den spezifischen Bedingungen für ein ordnungsgemäßes Pipettieren vor.
  9. Die Platte wird 15 min bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.
    HINWEIS: Für diesen Inkubationsschritt wird anstelle eines CEI-Geräts ein normaler Zellinkubator verwendet. Zellenkontrollbohrungen (CC-Bohrlöcher) sind fahrzeugbehandelte Bohrlöcher.

6. Virusvorbereitung und -infektion

  1. Tauen Sie ein Fläschchen mit Virenbrühe auf. In diesem Beispiel werden ZIKV MR766 und ZIKV PRVABC59 verwendet.
  2. Bereiten Sie Virusverdünnungen mit dem gewünschten MOI oder Verdünnungen in Assaymedium in einem 15-ml-Polypropylenröhrchen vor.
    HINWEIS: In diesem repräsentativen Beispiel werden MOI 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001, 0,005 und 0,00005 verwendet.
  3. Fügen Sie 100 μl Virusverdünnung in die zugewiesenen Vertiefungen der 96-Well-Platte hinzu. Geben Sie Assay-Medium in die CC-Wells.
  4. Dekontaminieren Sie die eingesetzten Virenbehälter.
  5. Setzen Sie die Platte wieder in das CEI-Gerät ein und setzen Sie die Messungen an 6 aufeinanderfolgenden Tagen fort, indem Sie auf Experiment fortsetzen klicken.
    HINWEIS: Viruskontroll-Wells (VC-Wells) sind mit Vehikeln behandelte infizierte Zellen, während in CC-Wells Assay-Medium anstelle der Virusverdünnung hinzugefügt wird. Wenn die Zytotoxizität der Verbindungen bewertet wird, fügen Sie 100 μl Assay-Puffer anstelle der Virusverdünnung hinzu.

7. Datenanalyse

  1. Beenden Sie das Experiment, indem Sie auf Fertig stellen klicken, und fügen Sie optionale Zusammenfassungskommentare hinzu, z. B. Informationen zu den spezifischen Versuchsbedingungen im angezeigten Fenster. Klicken Sie auf OK , wenn die Datenerfassung abgeschlossen ist.
  2. Wählen Sie im Diagrammbereich die gewünschte Frequenz aus, in der am Ende des Experiments die größte Impedanzdifferenz zwischen CC und VC gemessen wird.
    1. Um die beste Frequenz zu bestimmen, führen Sie ein Pilotexperiment mit nicht infizierten und infizierten Zellen durch und wählen Sie die Frequenz, die zu dem Zeitpunkt, an dem die Impedanz der infizierten Zellen auf den Ausgangswert gesunken ist, zu dem größten beobachteten Impedanzunterschied zwischen den nicht infizierten und infizierten Zellen führt. Bei A549-Zellen, die mit ZIKV infiziert sind, sind dies 16 kHz.
  3. Um alle Daten in ein Tabellenformat zu exportieren, stellen Sie sicher, dass alle Wells im Bereich Well-Konfiguration ausgewählt sind, und klicken Sie auf Datei | Daten exportieren | Daten grafisch darstellen.
  4. Normalisieren Sie die Daten, indem Sie den am Ende des Experiments gemessenen durchschnittlichen VC-Impedanzwert von allen Datenpunkten subtrahieren und diesen durch den durchschnittlichen CC-Impedanzwert des letzten vor der Infektion gemessenen Zeitpunkts dividieren.
  5. Zeichnen Sie die normalisierten Daten in Abhängigkeit von der Zeit, um CEI-Profildiagramme zu erhalten.
  6. Berechnen Sie die normalisierte Fläche unter der Kurve (AUCn) jeder Bedingung, um Parameter wie 50 % Hemmkonzentrationen (IC50) zu bestimmen.
  7. Berechnen Sie weitere nützliche Parameter, wie z. B. CIT50, um z. B. die Infektiosität verschiedener Virusstämme zu vergleichen.

Ergebnisse

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In diesem Artikel wird der Einsatz des CEI-Assays in der ZIKV-Forschung ausführlich beschrieben. Der Arbeitsablauf dieses Assays ist in Abbildung 1 dargestellt. Wir demonstrieren die Bequemlichkeit der Echtzeitüberwachung der ZIKV-Infektion in einem gewünschten Zelltyp sowie die Bewertung der Infektionshemmung durch einen antiviralen Wirkstoff. Als antivirales Beispiel verwenden wir das gut beschriebene Peptid Labyrinthopeptin A1 (Laby A1); Wir bezeichnen dies als "die Verbindung", da ihre spezifischen Eigenschaften den Rahmen dieses Methodenartikels sprengen und an anderer Stelle diskutiert werden20,21. Bemerkenswert ist, dass die Reproduzierbarkeit der Methode im Abschnitt über die Ergebnisse nicht diskutiert wird, da wir uns auf die einzelnen Impedanzprofile konzentrieren wollen, die mit der Methodik erhalten wurden. Dies wurde jedoch bereitsfrüher 19 beschrieben.

In der ersten Reihe von Experimenten zeigen wir die Bedeutung der Zelldichteoptimierung bei der Durchführung von CEI-Infektionsassays (Abbildung 2). Wenn zu viele Zellen ausgesät sind, ist die Zellmonoschicht vollständig gewachsen und kann sich nicht mehr über die CEI-Elektroden ausbreiten. Dies führt zu einem geringeren Unterschied zwischen CC und VC und damit zu einer geringeren Auflösung, wodurch sich das Nachweisfenster der antiviralen Aktivität verringert. Dies ist in Abbildung 2E gut veranschaulicht. Bei bestimmten größeren Zelltypen, wie z. B. U87-Zellen, kann eine zu dichte Aussaat der Zellen sogar zu einer vollständigen Ablösung der Zellmonoschicht führen, wenn die Platte manipuliert wird, wie hier gezeigt (Abbildung 2F). Dies wird auch mikroskopisch beobachtet.

Abbildung 2 zeigt auch, dass der Assay sehr nützlich für die Durchführung von Zellempfindlichkeitsstudien ist. Aus Abbildung 2A,B ist ersichtlich, dass die Infektionskinetik stark vom Zelltyp abhängt. Abbildung 2C zeigt, dass U87-Zellen nur bei hohen MOIs anfällig für eine ZIKV-Infektion sind.

In der zweiten Versuchsreihe wird die vielseitige Verwendung des CEI-Infektionstests unter Verwendung verschiedener ZIKV-Stämme an verschiedenen MOIs und in Gegenwart einer gut beschriebenen antiviralen Verbindung hervorgehoben (Abbildung 3). Diese Experimente werden mit A549-Zellen durchgeführt, einem Modell, das häufig in der Flavivirenforschung verwendet wird22,23. Diese Zelllinie wurde auch in anderen Studien verwendet, die ihre Eignung für CEI-Assays gezeigt haben24. Zunächst wird die Infektionskinetik eines repräsentativen ZIKV-Stammes der afrikanischen Linie MR766 mit der der asiatischen Linie PRVABC59 verglichen. Abbildung 3A zeigt, dass beide Stämme vergleichbare CEI-Muster aufweisen, wobei PRVABC59 etwas langsamere CPE-induzierende Eigenschaften aufweist. Dies spiegelt sich auch in den CIT50-Werten wider (Abbildung 3B). Dieser interessante Parameter wurde erstmals von Fang et al.16 eingeführt und berücksichtigt die Kinetik von CEI-Messungen. Sie ist definiert als die Zeit, die benötigt wird, um die Impedanz im Vergleich zur Zellsteuerung um 50 % zu reduzieren.

Als nächstes wurden die Zellen mit drei verschiedenen MOIs von ZIKV MR766 oder PRVABC59 infiziert, in Anwesenheit oder Abwesenheit verschiedener Verbindungskonzentrationen, und die Impedanzprofile wurden überwacht. Wie in Abbildung 3C-H zu sehen ist, hemmen oder verzögern bestimmte Substanzkonzentrationen den durch eine ZIKV-Infektion verursachten Impedanzabfall. Dies spiegelt sich auch bei der Berechnung der AUC-Werte wider. Die Ergebnisse des CEI-Assays zeigen auch visuell, dass die antivirale Aktivität vom MOI und vom Zeitpunkt der Potenzbewertung abhängt. AUCn-Berechnungen können verwendet werden, um IC50-Werte zu bestimmen, wie in Abbildung 3I dargestellt. Schließlich zeigt Abbildung 3H, dass CIT50-Werte auch zur Bestimmung und zum Vergleich von Verbindungspotenzen verwendet werden können. Inaktive Verbindungen oder Substanzkonzentrationen werden durch CEI-Profile, AUC und CIT50-Werte charakterisiert, die mit denen von VC vergleichbar sind.

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Abbildung 1: Schematische Übersicht über den Arbeitsablauf des Assays. Der zeitliche Ablauf und die verschiedenen Handhabungs- und Inkubationsschritte des CEI-Assays sind hier dargestellt. Abkürzungen: CEI = cell-based electrical impedanz; ZIKV = Zika-Virus; D = Tage. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 2: Normalisierte CEI-Profile von ZIKV-infizierten Zellen bei unterschiedlichen Dichten. (A,D) A549, (B,E) HEL 299 oder (C,F) U87 Zellen wurden mit (A-C) 15.000-20.000 ("optimal") oder (D-F) 75.000 ("suboptimalen") Zellen pro Well in einer 96-Well-CEI-Platte ausgesät. Nach 24-stündiger Impedanzüberwachung wurden die Zellen mit zehnfachen MOI-Verdünnungen von ZIKV MR766 infiziert. Die Impedanz wurde an 5 aufeinanderfolgenden Tagen weiter überwacht. Es werden CEI-Profile (Mittelwert ± Bereich zweier technischer Replikate) eines repräsentativen Experiments gezeigt. Abkürzungen: CEI = cell-based electrical impedanz; MOI = Vielzahl der Infektionen; ZIKV = Zika-Virus; Norm = normalisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 3: Normalisierte CEI-Profile von A549-Zellen nach Infektion mit zwei ZIKV-Stämmen und Hemmung durch eine antivirale Verbindung. (A) Adhärente A549-Zellen wurden mit verschiedenen MOIs von ZIKV MR766 oder ZIKV PRVABC59 infiziert und die Impedanz wurde kontinuierlich überwacht. Dargestellt ist der Mittelwert ± SD von drei technischen Repliken eines repräsentativen Experiments. (B) Die CIT50-Werte wurden auf der Grundlage des CEI-Profils von A berechnet und verglichen. Dargestellt ist die mittlere ± SD von drei durchgeführten technischen Replikationen. (C-H) Adhärente A549-Zellen wurden mit verschiedenen Substanzkonzentrationen behandelt und anschließend mit einem spezifischen MOI von ZIKV MR766 (C-E) oder ZIKV PRVABC59 (F-H) infiziert. Die Impedanz wurde kontinuierlich überwacht. Dargestellt ist der mittlere ± Bereich zweier technischer Replikate eines repräsentativen Experiments. (I) Um die Inhibition der Verbindung mit verschiedenen ZIKV-Stämmen und -Verdünnungen zu vergleichen, wurde die AUC n berechnet, und die inhibitorischen Prozentsätze wurden bestimmt, indem alle Bedingungen durch die CC AUC n subtrahiert und durch die VC AUCn dividiert wurden. (J) Die CIT50-Werte des in C-H gezeigten Experiments wurden berechnet, um die verschiedenen ZIKV-Stämme und das MOI zu vergleichen. Der mittlere ± Bereich von zwei technischen Replikationen wird angezeigt. Abkürzungen: CEI = cell-based electrical impedanz; MOI = Vielzahl der Infektionen; ZIKV = Zika-Virus; Norm = normalisiert; CIT 50 = Zeitpunkt, zu dem die Impedanz um50 % im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle abnahm; AUC = Fläche unter der Kurve; CC = Zellkontrolle; VC = Virenkontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Diskussion

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Dieser Artikel beschreibt den Einsatz des CEI-Tests in der antiviralen Forschung des ZIKV. Der Assay hat den Vorteil eines Echtzeit-Monitorings und kann daher verwendet werden, um die Kinetik der ZIKV-Infektion und die antivirale Hemmung mit selektiven Substanzen zu bewerten. Die mit dieser Methode gewonnenen Daten ermöglichen eine objektive und visuelle Beobachtung des virusinduzierten CPE und der Wirksamkeit eines potenziellen antiviralen Wirkstoffs.

Da es sich bei CEI um eine sehr empfindliche Methode handelt, ist bei der Durchführung dieses zellulären Assays große Vorsicht geboten. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass ein präzises Pipettieren durchgeführt wird, um Pipettierschwankungen so weit wie möglich zu vermeiden. Darüber hinaus müssen andere Faktoren, die die Versuchsergebnisse beeinflussen könnten, wie z. B. die Zellzahl und der verwendete Virusbestand, zwischen den Versuchswiederholungen konstant gehalten werden. Dies sind Faktoren, die die Kinetik des Zellwachstums und der Infektion stark beeinflussen und daher zu Variationen der berechneten CIT50-Werte und/oder anderer Parameter führen können.

Bei der Durchführung des CEI-Assays in Gegenwart von (potenziellen) antiviralen Verbindungen ist es wichtig festzustellen, ob diese die Impedanz der Zellen in Abwesenheit eines Virus beeinflussen. Die Technik ist so empfindlich, dass Impedanzänderungen deutlich unterhalb der zytotoxischen Konzentrationen der Verbindung gemessen werden können19.

Obwohl in diesem Artikel nur ZIKV-Daten gezeigt werden, kann der Assay leicht auf andere zytopathogene (Flavi-)Viren angewendet werden, mit nur minimalem Optimierungsaufwand, wie z. B. der Bestimmung der Häufigkeit eines optimalen CEI-Monitorings. Anpassungen des CEI-Assays wurden mit verschiedenen humanen und tierischen Viren wie Chikungunya, Influenza A und humanen und equinen Herpesviren durchgeführt25,26,27,28. Hier wird es auch als einfache Methode zur Quantifizierung von Virustitern oder zur Identifizierung antiviraler Verbindungen eingesetzt. In diesen Studien wurde die Echtzeit-Zellanalyse, eine alternative CEI-Methode, verwendet.

Der Einsatz der CEI-Technologie ist auf adhärente Zelltypen beschränkt, da das Prinzip des Assays auf den Eigenschaften adhärenter Zellen beruht, um sich über die in die Elektroden eingebetteten Vertiefungen auszubreiten. Well-Oberflächenbeschichtungen wie Fibronektin können verwendet werden, um die Zellanheftung29 zu verbessern. Die Methodik hat einige andere Nachteile, von denen der erste mit den Kosten zusammenhängt. Abgesehen von der Investition in das CEI-Überwachungsgerät und die dazugehörige Hard- und Software sind auch die Verbrauchsmaterialien etwas teuer. Da das Protokoll außerdem eine mehrtägige Überwachung der Virusinfektion vorschreibt, kann eine 96-Well-Platte pro Woche ausgewertet werden. Zusammen mit den hohen Kosten schränkt dies die Verwendung auf Einstellungen mit niedrigem bis mittlerem Durchsatz ein.

Aufgrund dieser Durchsatzprobleme ist die Technologie für antivirale Screening-Umgebungen ungeeignet. In ersten experimentellen Phasen ist es jedoch sehr attraktiv, zum Beispiel bei der Bewertung der Zellanfälligkeit für die Untersuchung einer ZIKV-Infektion in einem bestimmten krankheitsbedingten Setting. Die Technologie ist auch bei transfizierten oder Knockout-Zelllinien nützlich, um Veränderungen in der Infektionskinetik leicht zu beobachten, z. B. in der An- oder Abwesenheit bestimmter Eintrittsrezeptoren. Dies ist interessant, wenn man die Beteiligung zellulärer Faktoren an der ZIKV-Infektion untersucht. Darüber hinaus kann der CEI-Assay in späteren präklinischen Phasen, wenn ein bestimmter Leitkandidat ausgewählt wurde, zur weiteren eingehenden Charakterisierung einer ausgewählten Verbindung verwendet werden. CEI-Biosensoren können auch modifiziert werden, indem bestimmte Bioerkennungselemente, wie z. B. virusspezifische Antikörper, für den Nachweis von Viren immobilisiert werden18. Insgesamt unterstreicht dies den vielseitigen Einsatz von CEI in der Virologie.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren bestätigen, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Clément Heymann und Gorrit Lootsma für das Korrekturlesen des Manuskripts. Die Studie wurde durch interne Zuschüsse des Labors für Virologie und Chemotherapie (Rega-Institut, KU Leuven) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
A549 ZellenAmerican Type Culture Collection (ATCC)CCL-185Diese Zellen werden in MEM Rega-3 kultiviert, ergänzt mit 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin und 0,075 % Natriumbicarbonat.
Acridine Orange/Propidium Iodid StainLogosBiosystems F23001Lebend-/Totfleck
Cellstar Polypropylen-Röhrchen, 15 mLGreiner bio-one1,88,271
Cellstar Polypropylen-Röhrchen, 50 mLGreiner bio-one2,27,261
Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM)Gibco, Thermo Fisher Scientific41965-039Zellkulturmedium für U87 und HEL 299 Zellen
Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-094
ECIS-Kulturware 96W20idfAngewandte Biophysik96W20idffür CEI-Gerät
Elektrische Zell-Substrat-Impedanzmessung (ECIS) Z-Array-StationAngewandte BiophysikCEI-Gerät, einschließlich 96-Well-Station, externem Steuermodul und Laptop mit Steuerungs-, Erfassungs- und Anzeigesoftware. Die notwendige Software wird vor dem Versand installiert. HINWEIS: Dieses Gerät wird derzeit nicht mehr hergestellt und wurde durch das fortschrittlichere ECIS Z-Theta-Gerät ersetzt
Falcon Polystyrolröhrchen, 5 mLCorning352054
Fötales Rinderserum (FBS)CytivaSV30160.03Zellkulturmedium Additiv für alle verwendeten Zellen
HEL 299 ZellenATCCCCL-137Diese Zellen werden in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10 % FBS und 0,01 M HEPES.
HEPES-Puffer, 1 MGibco, Thermo Fisher Scientific15630-056Zellkulturmedium Additiv für U87-Zellen
Labyrinthopeptin A1Freundliches Geschenk von Prof. Dr. Roderich Sü ssmuth, Technische Universitätä t Berlin, DeutschlandAntivirale Verbindung, die in diesem Protokoll als Beispiel verwendet wird. Es wird in DMSO aufgelöst.
L-Glutamin, 200 mMGibco, Thermo Fisher Scientific25030-024Additiv für Zellkulturmedium für A549-Zellen
Luna Objektträger zur ZellzählungLogos BiosystemsL12001
Luna-FL Dual-Fluoreszenz-ZellzählerLogos BiosystemsL20001Zellviabilitätszähler
Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3)Gibco, Thermo Fisher Scientific19993013Zellkulturmedium für A549-Zellen
Natriumbicarbonat, 7,5 %Gibco, Thermo Fisher Scientific25080-060Zellkulturmedium-Additiv für A549-Zellen
Gewebekulturkolben T75TPPY9076
Trypsin-EDTA, 0,25 %Gibco, Thermo Fisher Scientific25200-056Dissoziationsreagenz
U87-ZellenATCCHTB-14Diese Zellen werden in DMEM kultiviert, das mit 10 % FBS und 0,01 M HEPES ergänzt wird.
  Virkon Rely+On TablettenLanxess115-0020Desinfektionsmittel
Lösung Zika-Virus (ZIKV) MR766ATCCVR-84ZIKV-Prototyp-Stamm, isoliert aus einem Sentinel-Rhesusaffen in Uganda im Jahr 1968
ZIKV PRVABC59ATCCVR-1843ZIKV-Stamm, isoliert von einem Patienten in Puerto Rico im Jahr 2015
PET-Assay-Platte

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  2. Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
  3. Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
  4. Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
  5. Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725(2018).
  6. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  7. Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
  8. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
  9. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  10. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792(2011).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  12. Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309(2018).
  13. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  14. Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
  15. Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039(2017).
  16. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  17. McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
  18. Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922(2022).
  19. Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122(2022).
  20. Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471(2020).
  21. Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
  22. Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
  23. Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503(2020).
  24. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137(2012).
  25. Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
  26. Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133(2021).
  27. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  28. Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
  29. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126(2022).

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