Das vorliegende Protokoll bereitet die physikalischen Eigenschaften, die Immunantwort und die In-vivo-Schutzwirkung eines neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs vor und bewertet sie.
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Methodenartikel
Evaluierung der Immunantwort eines adjuvanten Nanoemulsionsimpfstoffs gegen Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)-Infektion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffe haben aufgrund ihrer geringen Partikelgröße, ihrer hohen thermischen Stabilität und ihrer Fähigkeit, gültige Immunreaktionen zu induzieren, große Aufmerksamkeit erregt. Die Etablierung einer Reihe umfassender Protokolle zur Bewertung der Immunantwort eines neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs ist jedoch von entscheidender Bedeutung. Daher wird in diesem Artikel ein strenges Verfahren zur Bestimmung der physikalisch-chemischen Eigenschaften eines Impfstoffs (mittels Transmissionselektronenmikroskopie [TEM], Rasterkraftmikroskopie [AFM] und dynamischer Lichtstreuung [DLS]), der Stabilität des Impfstoffantigens und -systems (durch einen Hochgeschwindigkeitszentrifugentest, einem thermodynamischen Stabilitätstest, SDS-PAGE und Western Blot) und der spezifischen Immunantwort (IgG1, IgG2a und IgG2b). Mit diesem Ansatz können Forscher die Schutzwirkung eines neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs in einem tödlichen MRSA252-Mausmodell genau bewerten. Mit diesen Protokollen kann das vielversprechendste Nanoemulsions-Impfstoff-Adjuvans in Bezug auf das effektive Adjuvanspotenzial identifiziert werden. Darüber hinaus können die Methoden dazu beitragen, neuartige Impfstoffe für die zukünftige Entwicklung zu optimieren.
Einleitung
Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) ist ein opportunistischer Erreger mit einer der höchsten Infektionsraten auf einer Intensivstation (ICU) Station1, kardiologischen Abteilungen und Verbrennungsabteilungen weltweit. MRSA weist hohe Infektionsraten, Mortalität und breite Arzneimittelresistenzen auf, was eine große klinische Behandlung erschwert2. In der 2017 von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) veröffentlichten globalen Prioritätenliste antibiotikaresistenter Bakterien wurde MRSA in die kritischste Kategorie3 eingestuft. Ein Impfstoff gegen eine MRSA-Infektion wird d....
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Protokoll
Die Tierversuche wurden auf der Grundlage des Handbuchs zur Verwendung und Pflege von Versuchstieren durchgeführt und von der Versuchstierschutz- und Ethikkommission der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden weibliche Balb/c-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen verwendet. Die Tiere wurden aus kommerziellen Quellen bezogen (siehe Materialtabelle).
1. Herstellung des MRSA-HI-Antigen-Proteins
- Sie beziehen IsdB- und Hla-Klone aus kommerziellen Quellen (siehe Materialtabelle), führen eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation durch, um IsdB<....
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Ergebnisse
Das Protokoll für die Herstellung des Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs und In-vitro- und In-vivo-Tests dieses Impfstoffs wurde evaluiert. TEM, AFM und DLS wurden verwendet, um die wichtigen Eigenschaften des Zetapotenzials und der Partikelgröße auf der Oberfläche dieser Probe zu bestimmen (Abbildung 1). SDS-PAGE und Western Blot zeigten, dass die Menge des Antigens im Niederschlag und Überstand nach der Zentrifugation nicht signifikant abnahm, was darauf hindeutete, dass d.......
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Diskussion
IsdB, ein bakterielles, zellwandverankertes und eisenreguliertes Oberflächenprotein, spielt eine wichtige Rolle bei der Gewinnung von Hämeisen15. Hla, Alpha-Toxin, gehört zu den wirksamsten bakteriellen Toxinen, die bei MRSA bekannt sind, und kann Poren in eukaryotischen Zellen bilden und Adhäsions- und Epithelzellen stören16. In unserer Arbeit wurde ein neuartiges Rekombinations-MRSA-Antigen-Protein (HI) konstruiert und gentechnisch auf Basis der Antigeng.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dieser Arbeit haben.
Danksagungen
Diese Forschung wurde von Nr. 2021YFC2302603 des National Key Research and Development Program of China, No. 32070924 und 32000651 des NSFC und Nr. 2019jcyjA-msxmx0159 des Natural Science Foundation Project Program of Chongqing unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 5424-Kleine HochgeschwindigkeitszentrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Deutschland | ||
| 96-Well-Platten | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Deutschland | ||
| Alkohollampe | Shenzhen Yibaxun Technology Co., China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c Mäuse | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company, China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 Mikroplatten-Reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Kompetente Zelle | Merck Millipore, Deutschland | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Zentrifuge 5810 R | Eppendorf, Deutschland | ||
| Coomassie hellblau G-250 Färbelösung | MIKX, China | DB236 | |
| Entfärbungslösung | BOSTER, China | AR0163-2 | |
| Elektroheizung mit stehendem Temperaturgrubber HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | Null | |
| Elektrophoresegerät | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gelbild | Tanon, USA | null | |
| Glutathion-Sepharose-Harz GST | Mei5bio, China | Affinitätschromatographie-Harz | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD, China | 7664-93-9 | |
| HI rekombinantes Protein | Dritte Militärmedizinische Universität, China | 110-27-0 | |
| HRP - Ziege Anti-Maus IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP - Ziege Anti-Maus IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP - Ziege Anti-Maus IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP - Ziege Anti-Maus IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Impföse | Haimen Feiyue Co., LTD, China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB- und Hla-Klone | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropylmuskatnuss (pharmazeutisches Adjuvans) | SEPPIC, Frankreich | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranosid | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB Bouillon Kulturmedium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared Physiotherapie-Lampe | Guangzhou Runman Medical Equipment Co., China | 7600 | |
| Niedertemperatur-Kühlzentrifuge | Eppendorf, Deutschland | ||
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Mikroplatten-Waschmaschine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park, USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co., LTD, China | 1658030 | |
| MMC Verpackung | TOSOH (SHANGHAI) CO., LTD | ||
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop Ultraviolett Spektralphotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Proteinelektrophorese-Gel-Kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | Biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-Zielgen rekombinantes Plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co, China | B3528G | |
| Phosphotwolframsäure | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| Pipette | Eppendorf, Deutschland | ||
| polyoxyethyliertes Rizinusöl (pharmazeutisches Adjuvans) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primärantikörper | Labor hausgemacht:von immunisierten Mäusen mit positiven Seren | null | Einzelheiten siehe Referenz 11 |
| Propylenglykol (pharmazeutisches Adjuvans) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen, USA | 88518 | |
| Rasterelektronenmikroskop | JEOL, Japan | JSM-IT800 | |
| Natrium-Pentobarbital | Merck, Deutschland | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB Farblösung | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Schildkröten-Kits | Xiamen Bioendo Technology Co., LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
Referenzen
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epide....
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Nachdrucke und Genehmigungen
