Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Etablierung von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben, die effektiv und stetig reine und lebensfähige Fibroblasten bereitstellen können.
Methodenartikel
Diese Studie beschreibt ein optimiertes Protokoll zur Etablierung von primären Fibroblasten aus Keloidgeweben, die effektiv und stetig reine und lebensfähige Fibroblasten bereitstellen können.
Fibroblasten, der wichtigste Zelltyp im Keloidgewebe, spielen eine wesentliche Rolle bei der Bildung und Entwicklung von Keloiden. Die Isolierung und Kultivierung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe sind die Grundlage für weitere Untersuchungen der biologischen Funktion und der molekularen Mechanismen von Keloiden sowie für neue therapeutische Strategien zu ihrer Behandlung. Die traditionelle Methode zur Gewinnung primärer Fibroblasten hat Einschränkungen, wie z. B. einen schlechten Zellzustand, eine Vermischung mit anderen Zelltypen und eine Anfälligkeit für Kontamination. In diesem Artikel wird ein optimiertes und leicht reproduzierbares Protokoll beschrieben, das das Auftreten möglicher Probleme bei der Gewinnung von Fibroblasten reduzieren könnte. In diesem Protokoll können Fibroblasten 5 Tage nach der Isolierung beobachtet werden und erreichen nach 10 Tagen Kultur eine Konfluenz von fast 80 %. Anschließend werden die Fibroblasten mit PDGFRα- und Vimentin-Antikörpern für Immunfluoreszenz-Assays und CD90-Antikörpern für die Durchflusszytometrie verifiziert und verifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Fibroblasten aus Keloidgewebe durch dieses Protokoll leicht gewonnen werden können, was eine reichhaltige und stabile Quelle von Zellen im Labor für die Keloidforschung darstellen kann.
Keloid, eine fibroproliferative Erkrankung, manifestiert sich durch das kontinuierliche Wachstum von Plaques, die oft ohne Selbstbeschränkung in die umgebende normale Haut eindringen und bei den Patienten verschiedene Grade von Juckreiz, Schmerzen sowie kosmetischen und psychischen Belastungen verursachen1. Fibroblasten, die primären Zellen, die an Keloiden beteiligt sind, spielen eine wesentliche Rolle bei der Entstehung und Entwicklung dieser Krankheit durch übermäßige Proliferation, redundante extrazelluläre Matrixproduktion und desorganisierte Kollagene 2,3. Die zugrundeliegende Pat....
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Diese Studie wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss des Dermatologischen Krankenhauses der Southern Medical University (2020081) genehmigt. Die informierte Einwilligung der Patienten wurde eingeholt, bevor Gewebe von den Personen entnommen wurde.
1. Vorbereitung
HINWEIS: Die folgenden Verfahren sollten in einer sterilen Umgebung unter einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.
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Der zeitliche Ablauf des Protokolls ist in Abbildung 1A zusammengefasst. Einige repräsentative Bilder des Isolationsprozesses sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Epidermis- und Fettschichten wurden vorsichtig entfernt, und die Dermisschicht wurde in kleine Fragmente von 3-4 mm2 getrennt, die in die Petrischalen inokuliert wurden.
Wie in Abbildung 3A gezeigt, wurden 5 Tage nach der Verarbei.......
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Die Gewinnung von primären Fibroblasten aus Keloidgewebe ist eine wichtige Grundlage für die weitere Forschung. Bisher gab es zwei Methoden zur Gewinnung primärer Fibroblasten: Enzymverdau und Explantatkultur11,12,13,14. Beide traditionellen Methoden haben jedoch Einschränkungen, wie z. B. die Anfälligkeit für Kontamination, die Vermischung mit anderen Zelltypen, eine lange Kulturzeit und eine .......
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Es sind keine Interessenkonflikte zu deklarieren.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Fördernummern 81903189 und 82073418) und der Science and Technology Foundation of Guangzhou (Fördernummer 202102020025) unterstützt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL steriles Zentrifugenröhrchen | JETBIOFIL | CFT002015 | |
| 15 mL steriles Zentrifugenröhrchen | JETBIOFIL | 8076 | |
| 4% Polyformaldehyd | Beyotime Biotechnology | P0099 | Zellfixierung |
| 50 mL steriles Zentrifugenröhrchen | JETBIOFIL | 8081 | Put Keloidgewebe |
| Alexa Fluor-555 Ziege Anti-Kaninchen IgG | Abcam | Alexa Fluor 555 | Zweiter Antikörper für Immunfluoreszenz-Färbeassay |
| Anti-Human-CD90 | BioLegend | B301002 | Identifizieren Sie die Reinheit von Fibroblasten |
| Antikörper-Verdünnungsmittel | Beyotime Biotechnology | P0262 | |
| Biologische Sicherheitswerkbank | Thermo Scientific | 1300 Serie A2 | Isolierungs- und Kulturzellen |
| Rinderserumalbumin, | Aladdin | B265993 | Blockierung für Immunfluoreszenz-Färbeassay |
| Kohlendioxid-Inkubator | ESCO | CCL-170B-8 | Verwendung für die Kultivierung |
| von Zellen Kryoröhrchen | Corning | 43513 | Lagern Sie die Zellen in einer |
| Thermo Fisher | ST 16R | Überstand ablegen | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | Färbung des Zellkerns |
| DMSO | MP Biomedicals | 196055 | Verwendung von |
| Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium | von Zellen Gibco | C11995500BT | Kulturmedium Lösung |
| Fötales Rinderserum | BI | 04-001-1A | |
| Durchflusszytometer | BD | BD FACSCelesta | Beobachtung die Identität von Zellen |
| Tiefkühlbox | Thermo Scientific | 5100-0050 | |
| Inverses Mikroskop | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Konfokales Lasermikroskop | Nikon | AIR-HD25 | Beobachtung des Immunfluoreszenz-Färbeassays |
| PDGFR-& alpha-Antikörper | CST | 3174T | Erster Antikörper für Immunfluoreszenz-Färbeassay |
| Penicillin-Streptomycin-Am-Lösung | Solarbio | P1410 | Zugabe von Nährmedium zur Vermeidung von Kontamination |
| Petrischale | JETBIOFIL | 7556 | Kulturfibroblasten |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Gibco | C10010500BT | Nährmedium |
| Kaninchen (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE) | Cell Signaling Technology | 5742S | Als Kontrolle für die Durchflusszytometrie |
| Runddeckglas | Biosharp | 801007 | Zellkultur |
| Triton X 100 | Solarbio | T8200 | Löcher in die Zellmembran stanzen |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 | Wird für die Passage von Zellen |
| verwendet Vimentin Antikörper | Abcam | ab8978 | Erster Antikörper für Immunfluoreszenz-Färbeassay |
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