Transmitochondriale Cybrid-Generierung mit Hilfe von Krebszelllinien

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Cybrid-Generierung aus suspensionswachsenden Krebszellen, um die Rolle der Mitochondrien im tumorigenen Prozess zu untersuchen.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren ist die Zahl der Studien, die sich mit der Aufklärung des Zusammenhangs zwischen Mitochondrien und Krebs befassen, deutlich gestiegen. Es sind jedoch noch weitere Anstrengungen erforderlich, um den Zusammenhang zwischen Veränderungen der Mitochondrien und der Tumorentstehung vollständig zu verstehen und tumorassoziierte mitochondriale Phänotypen zu identifizieren. Um beispielsweise den Beitrag von Mitochondrien bei Tumorentstehungs- und Metastasierungsprozessen zu bewerten, ist es wichtig, den Einfluss von Mitochondrien aus Tumorzellen in verschiedenen nukleären Umgebungen zu verstehen. Ein möglicher Ansatz besteht darin, Mitochondrien in einen anderen Kernhintergrund zu überführen, um die sogenannten Cybridzellen zu erhalten. Bei den traditionellen Cybridisierungstechniken wird eine Zelllinie, der mtDNA fehlt (ρ⁰, Kernspenderzelle), mit Mitochondrien neu besiedelt, die entweder von enukleierten Zellen oder Blutplättchen stammen. Der Enukleationsprozess erfordert jedoch eine gute Zelladhäsion auf der Kulturplatte, eine Eigenschaft, die in vielen Fällen bei invasiven Zellen teilweise oder vollständig verloren geht. Darüber hinaus besteht eine weitere Schwierigkeit bei den traditionellen Methoden darin, die endogene mtDNA vollständig aus der mitochondrialen Empfängerzelllinie zu entfernen, um reine nukleäre und mitochondriale DNA-Hintergründe zu erhalten, wodurch das Vorhandensein von zwei verschiedenen mtDNA-Spezies in der erzeugten Cybrid vermieden wird. In dieser Arbeit stellen wir ein mitochondriales Austauschprotokoll vor, das auf suspensionswachsende Krebszellen angewendet wird, basierend auf der Wiederbesiedlung von Rhodamin 6G-vorbehandelten Zellen mit isolierten Mitochondrien. Diese Methodik ermöglicht es uns, die Einschränkungen der traditionellen Ansätze zu überwinden und kann daher als Werkzeug verwendet werden, um das Verständnis der mitochondrialen Rolle bei der Krebsprogression und Metastasierung zu erweitern.

Einleitung

Die Reprogrammierung des Energiestoffwechsels ist ein Kennzeichen von Krebs¹, das erstmals in den 1930er Jahren von Otto Warburg beobachtet wurde². Unter aeroben Bedingungen wandeln normale Zellen Glukose in Pyruvat um, das dann Acetyl-CoA erzeugt, das die mitochondriale Maschinerie antreibt und die Zellatmung fördert. Dennoch zeigte Warburg, dass die meisten Krebszellen auch unter normoxischen Bedingungen Pyruvat, das sie bei der Glykolyse erhalten, in Laktat umwandeln und sich so auf die Energiegewinnung verlagern. Diese metabolische Anpassung wird als "Warburg-Effekt" bezeichnet und ermöglicht es einigen Krebszellen, ....

Protokoll

HINWEIS: Alle Nährmedien und Pufferzusammensetzungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Vor der Cybrid-Generierung müssen sowohl mitochondriale als auch nukleäre DNA-Profile von Spender- und Empfängerzellen typisiert werden, um das Vorhandensein genetischer Unterschiede in beiden Genomen zwischen Zelllinien zu bestätigen. In dieser Studie wurden eine kommerziell erhältliche L929-Zelllinie und die daraus abgeleitete Zelllinie L929dt verwendet, die spontan in unserem Labor erzeugt wurde (siehe¹³ für weitere Informationen). Diese Zelllinien weisen zwei Unterschiede in der Sequenz ihres mt-Nd2-Gens auf, die verwendet werden kön....

Ergebnisse

Nach Befolgung des oben vorgestellten Protokolls sollte eine homoplasmatische Cybrid-Zelllinie mit konserviertem Kernhintergrund, aber mit einem neuen Mitochondrien-Genotyp erhalten werden, wie in den Schemata in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Die Reinheit der mitochondrialen und nukleären DNA, die in den Cybriden vorhanden ist, kann durch RFLP (siehe Abbildung 3) und durch eine nukleäre DNA-Genotypisierungsanalyse (siehe .......

Diskussion

Seit Otto Warburg berichtete, dass Krebszellen ihren Stoffwechsel verändern und die "aerobe Glykolyse"^3,4 potenzieren, während sie gleichzeitig die mitochondriale Atmung reduzieren^, ist das Interesse an der Rolle der Mitochondrien bei der Transformation und Progression von Krebs exponentiell gewachsen. In den letzten Jahren wurden Mutationen in der mtDNA und mitochondriale Dysfunktionen als Kennzeichen vieler Krebsarten postuliert²⁵. Bis h.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3500XL Genetischer Analysator	ThermoFisher Scientific	4406016
6-Well-Platte	Corning	08-772-1B
Ammoniumpersulfat	Sigma-Aldrich	A3678
AmpFlSTR Identifiler Plus PCR-Amplifikationskit	ThermoFisher Scientific	4427368
Anodenpufferbehälter Serie 3500 Angewandte	Biosysteme	4393927
Borsäure	PanReac	131015
Bradford-Assay	Biorad	5000002
Kathodenpufferbehälter Serie 3500 Applied	Biosystems	4408256
Zellkulturflaschen	TPP	90076
DMEM mit hohem Glukosegehalt	Gibco	11965092
EDTA	PanReac	131026
Ethidiumbromid	Sigma-Aldrich	E8751
Geneticin	Gibco	10131027
Homogenisator Teflonstößel	Deltalab	196102
L929 Zelllinie	ATCC	CCL-1
MiniProtean Tetra4 Gel System	BioRad	1658004
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
PCR Primer	Sigma-Aldrich	Kundenspezifische Produkte
Polyacrylamid Lösung 30%	PanReac	A3626
Polyethylenglykol	Sigma-Aldrich	P7181
POP-7	Angewandte Biosysteme	4393714
Pyruvat	Sigma-Aldrich	P5280
QIAmp DNA Mini Kit	Qiagen	51306
Rhodamin-6G	Sigma-Aldrich	R4127
Serum Fötales Rind	Sigma-Aldrich	F7524
SspI	New England Biolabs	R3132
Streptomycin/Penicillin	PAN biotech	P06-07100
Saccharose	Sigma-Aldrich	S3089
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Tris	PanReac	P14030b
Uridin	Sigma-Aldrich	U3750