Methodenartikel

Ultraschnelle Amplicon-basierte Next-Generation-Sequenzierung bei nicht-plattenepithelialem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs

DOI:

10.3791/65190

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8. September 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Clinical and Experimental Pathology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d’Azur, CHU de Nice, 2Hospital-Integrated Biobank (BB-0033-00025), Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, 3Institut Hospitalo-Universitaire (IHU), RespirERA, Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, 4FHU OncoAge, Université Côte d'Azur, 5Team 4, Institute of Research on Cancer and Aging (IRCAN), CNRS INSERM, Centre Antoine-Lacassagne, Université Côte d'Azur, 6Department of Pulmonary Medicine and Thoracic Oncology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d'Azur

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Zunahme molekularer Biomarker, die für die Behandlung von nicht-plattenepithelialem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NS-NSCLC) getestet werden sollen, hat zur Entwicklung schneller und zuverlässiger molekularer Nachweismethoden geführt. Wir beschreiben einen Arbeitsablauf für die Beurteilung genomischer Veränderungen bei NS-NSCLC-Patienten unter Verwendung eines ultraschnellen Next Generation Sequencing (NGS)-Ansatzes.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Zahl der molekularen Veränderungen, die für die zielgerichtete Therapie von Patienten mit nicht-plattenepithelialem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NS-NSCLC) getestet werden sollen, hat in den letzten Jahren deutlich zugenommen. Der Nachweis molekularer Anomalien ist für die optimale Versorgung von Patienten mit fortgeschrittenem oder metastasiertem NS-NSCLC unerlässlich, so dass zielgerichtete Therapien mit einer Verbesserung des Gesamtüberlebens verabreicht werden können. Nichtsdestotrotz entwickeln diese Tumoren Resistenzmechanismen, die mit neuartigen Therapien potenziell angegriffen werden können. Einige molekulare Veränderungen können auch das Ansprechen auf die Behandlung modulieren. Die molekulare Charakterisierung von NS-NSCLC muss in einer kurzen Durchlaufzeit (TAT) von weniger als 10 Arbeitstagen durchgeführt werden, wie es in den internationalen Leitlinien empfohlen wird. Darüber hinaus ist die Herkunft der Gewebebiopsien für die Genomanalyse vielfältig, und ihre Größe nimmt mit der Entwicklung weniger invasiver Methoden und Protokolle kontinuierlich ab. Folglich stehen Pathologen vor der Herausforderung, effektive molekulare Techniken anzuwenden und gleichzeitig eine effiziente und schnelle Diagnosestrategie aufrechtzuerhalten. Hier beschreiben wir den ultraschnellen Amplicon-basierten Next-Generation-Sequencing-Workflow (NGS), der in der täglichen Routinepraxis bei der Diagnose von NS-NSCLC-Patienten verwendet wird. Wir konnten zeigen, dass dieses System in der Lage ist, die aktuellen molekularen Targets, die in der Präzisionsmedizin in der thorakalen Onkologie verwendet werden, in einem geeigneten TAT zu identifizieren.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In den letzten zehn Jahren hat die Entwicklung zielgerichteter Immuntherapien das Gesamtüberleben (OS) von nicht-plattenepithelialem nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NS-NSCLC) signifikant erhöht1,2. In diesem Zusammenhang hat die Anzahl der obligatorischen Gene und molekularen Ziele, die bei der Behandlung von NS-NSCLC analysiert werden müssen, in den letzten Jahren zugenommen 3,4.

Aktuelle internationale Leitlinien empfehlen die Untersuchung von EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK, RET, und MET bei der Diagnose von fortgeschrittenem NS-NSCLC5. Da neue Medikamente in jüngster Zeit in klinischen Studien sehr vielversprechende Ergebnisse erzielt haben, werden in Kürze weitere genomische Veränderungen in einer Reihe weiterer Gene untersucht, insbesondere KRAS und HER2 sowie BRAC1/BRAC2, PI3KA, NRG1 und NUT 6,7,8,9. Darüber hinaus kann der Status verschiedener assoziierter Gene wie STK11, KEAP1 und TP53 von großem Interesse sein, um das Ansprechen oder die Resistenz auf bestimmte zielgerichtete Therapien und/oder Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) besser vorhersagen zu können10,11,12.

Wichtig ist, dass die molekularen Veränderungen ohne signifikante Verzögerung gemeldet werden müssen, um eine sorgfältige klinische Entscheidungsfindung zu gewährleisten. Das Fehlen einer molekularen Charakterisierung eines Tumors kann zur Einleitung nicht-zielgerichteter Therapien wie Chemotherapie mit/ohne Immuntherapie führen, was zu einer suboptimalen Behandlungsstrategie führt, da das Ansprechen auf die Chemotherapie bei Patienten mit verwertbaren Veränderungen wie EGFR-Mutationen oder Genfusionen begrenzt ist13.

Darüber hinaus könnte die derzeitige Entwicklung zielgerichteter Therapien/Immuntherapien in neoadjuvanten und/oder adjuvanten Settings dazu führen, dass systematisch zumindest nach EGFR- und ALK-Veränderungen bei NS-NSCLC im Frühstadium gesucht wird, da ICIs nur bei Tumoren verabreicht werden sollten, die Wildtyp-Tumoren für EGFR und ALK14 sind. Es ist nun auch obligatorisch, auf das Vorhandensein von EGFR-Mutationen bei NS-NSCLC im Frühstadium zu testen, da Osimertinib (ein EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitor der dritten Generation) als adjuvante Therapie bei EGFR-mutiertem NS-NSCLC eingesetzt werden kann15.

Die Strategie zur Bewertung der verschiedenen Biomarker zur Vorhersage des Ansprechens auf verschiedene zielgerichtete Therapien und/oder Immuntherapien bei NS-NSCLC-Patienten schreitet schnell voran, was die Identifizierung dieser Biomarker sequentiell schwierig macht 3,16. In dieser Hinsicht ist Next-Generation Sequencing (NGS) nun der optimale Ansatz für die parallele Hochdurchsatz-Bewertung von Genveränderungen bei NS-NSCLC 5,17.

Der NGS-Workflow kann jedoch schwierig zu meistern sein und zu längeren TAT18,19 führen. Daher führen viele Zentren immer noch sequentielle Ansätze durch (Immunhistochemie (IHC), Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und/oder gezielte Sequenzierung). Diese Strategie ist jedoch bei geringer Stichprobengröße und vor allem wegen der erhöhten Anzahl von verwertbaren Mutationen, die in NS-NSCLC20 getestet werden müssen, begrenzt. Ultraschnelle und unkomplizierte Testmethoden, die eine schnelle Beurteilung von Genveränderungen ermöglichen, werden daher für eine optimale klinische Entscheidungsfindung immer wichtiger. Darüber hinaus werden zugelassene und akkreditierte Systeme für molekulare Tests für die Verschreibung spezifischer zielgerichteter Therapien verpflichtend.

Hier beschreiben wir einen ultraschnellen und automatisierten Amplicon-basierten DNA/RNA NGS-Assay für die molekulare Testung von NS-NSCLC, der im Labor für klinische und experimentelle Pathologie (LPCE) des Universitätsklinikums Nizza, Frankreich, verwendet wird und nach der Norm ISO 15189 vom französischen Akkreditierungsausschuss (COFRAC) akkreditiert ist (https://www.cofrac.fr/). Die COFRAC bescheinigt, dass das Labor die Anforderungen der Norm ISO 15189 und der COFRAC-Anwendungsregeln für die Tätigkeiten der Prüfung/Kalibrierung in der molekularen Analyse in automatisierter NGS auf einem Sequenzierer mit dem vom Labor durchgeführten Panel erfüllt. Die Akkreditierung nach der anerkannten internationalen Norm ISO 15189 belegt die technische Kompetenz des Labors für einen definierten Umfang und den ordnungsgemäßen Betrieb eines geeigneten Managementsystems in diesem Labor. Die Vorteile und Grenzen dieses Arbeitsablaufs, beginnend mit der Vorbereitung der Gewebebiopsieproben bis hin zur Erstellung des Berichts, werden diskutiert.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Verfahren wurden von der lokalen Ethikkommission (Ethikkommission für Humanforschung, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Tumorothek BB-0033-00025) genehmigt. Alle Patienten erhielten eine Einverständniserklärung zur Verwendung von Proben und generierten Daten. Alle Proben wurden von Patienten entnommen, bei denen zwischen dem 20. September und dem 31. Januar 2022 in LPCE (Nizza, Frankreich) im Rahmen der medizinischen Versorgung NS-NSCLC diagnostiziert wurde.

1. Vorbereitung von FFPE-DNA- und RNA-Proben mit einem automatisierten Aufreinigungsgerät ( API ) (Bearbeitungszeit: 5 h 15 min)

  1. Führen Sie die Planung auf dem Gerät durch.
    1. Schalten Sie das Gerät ein und melden Sie sich mit dem Benutzernamen und dem Kennwort an (Materialtabelle). Erstellen Sie einen Ausführungsplan für die Bereinigung, indem Sie auf Ausführen und dann auf Plan hinzufügen klicken und dem Ausführungsplan einen Namen geben.
    2. Wählen Sie dann das geeignete Aufreinigungskit und das entsprechende Protokoll für die sequenzielle Aufreinigung von DNA und RNA aus formalinfixierten, paraffineingebetteten (FFPE) Proben aus. Aktivieren Sie die Quantifizierung nach der Reinigung.
    3. Wählen Sie das gewünschte Elutionsvolumen (50 μl) aus der Dropdown-Liste aus und klicken Sie dann auf Weiter. Wählen Sie die Anzahl der Proben aus, die extrahiert werden sollen.
    4. Wählen Sie dann jedes Beispiel aus, klicken Sie auf Bearbeiten, geben Sie Beispiel-ID ein, und klicken Sie dann auf Speichern.
  2. Präparation von FFPE-DNA- und RNA-Proben mit GPI
    1. Bereiten Sie FFPE-Gewebeproben vor (4 Schnitte von 10 μm mit einem Mikrotom) oder führen Sie eine Makrodissektion direkt an FFPE-Blöcken durch. Geben Sie jede FFPE-Gewebeprobe in getrennte und identifizierte FFPE-Probenverarbeitungsröhrchen (Materialtabelle).
    2. Bei 2000 x g 1 min zentrifugieren, um das Gewebe am Boden der Röhrchen zu sammeln.
    3. Zu jedem FFPE-Probenverarbeitungsröhrchen wird ein Protease-Digest-Mastermix aus einem Nukleinsäure-Aufreinigungskit gegeben und bei 60 °C für mindestens 60 Minuten inkubiert (Materialtabelle). Die Proben werden bei 90 °C für 60 min inkubiert.
    4. Nach der Inkubation lassen Sie die Proben 5 min bei Raumtemperatur (RT) abkühlen.
    5. Heben Sie für jedes FFPE-Probenverarbeitungsröhrchen das Innenröhrchen an, verriegeln Sie es durch Drehen nach links und zentrifugieren Sie die Proben dann 10 Minuten lang bei 2000 x g .
    6. Entriegeln Sie die Schläuche, indem Sie sie nach rechts drehen, trennen Sie sie von den Außenrohren und entsorgen Sie sie. Bewahren Sie die Proben in den äußeren Röhrchen auf Eis auf, bis sie auf den Wirkstoff geladen werden.
    7. Bereiten Sie einen DNase-Aufschluss-Mastermix vor und laden Sie ihn in eine vorgefüllte FFPE-DNA- und RNA-Aufreinigungsplatte 2. Anschließend werden die vorbereiteten Proben in die FFPE-DNA- und RNA-Aufreinigungsplatte 1 (Materialtabelle) geladen.
  3. Starten Sie die Bereinigungsausführung auf der API.
    1. Klicken Sie auf dem API-Bildschirm auf Ausführen, wählen Sie den Ausführungsplan aus und klicken Sie dann auf Weiter.
    2. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um den Wirkstoff mit den erforderlichen Verbrauchsmaterialien und Reagenzien zu beladen, die für den Reinigungslauf erforderlich sind (Materialtabelle).
    3. Wenn alle Reagenzien geladen sind, klicken Sie auf Weiter. Schließen Sie die API-Tür und klicken Sie auf Start.
    4. Klicken Sie am Ende des Laufs auf dem Touchscreen auf "Entladen" und entfernen Sie sofort die 48-Well-Nukleinsäure-Archivplatte, die die DNA und RNA der gereinigten Probe enthält.
    5. Exportieren Sie die Quantifizierungsergebnisse. Versiegeln Sie die Platte und lagern Sie die gereinigten Proben bei -80 °C. Übertragen Sie die 96-Well-Platte auf den zu analysierenden Sequenzer.
  4. Erstellen Sie ein Beispiel, und erstellen Sie eine Ausführung.
    1. Öffnen Sie die Software, melden Sie sich an, wählen Sie dann in der Menüleiste Beispiele aus und klicken Sie auf Beispiel erstellen.
    2. Geben Sie den Namen, das Geschlecht und den Prozentsatz der Tumorzellen der Probe ein und füllen Sie bei Bedarf die erforderlichen Felder und optionalen Felder aus.
    3. Speichern Sie die Details (das Geschlecht und der Prozentsatz der Tumorzellen sind wichtig für die Analyse von Kopienzahlvarianten [CNVs]).
    4. Wählen Sie in der Menüleiste "Läufe" und "Nukleinsäure zu Ergebnis " aus.
    5. Geben Sie den Ausführungsnamen im Setup-Schritt ein. Klicken Sie auf Weiter.
    6. Wählen Sie den Assay im Schritt Assays aus. Klicken Sie auf Weiter.
    7. Wählen Sie im Schritt Proben die Proben aus, die mit dem Assay ausgeführt werden sollen.
    8. Klicken Sie dann im Bereich "Ausgewählte Assays" auf "Zuweisen". Klicken Sie auf Weiter.
    9. Überprüfen Sie die Probenpositionen auf der Probenzufuhrplatte. Klicken Sie auf Weiter.
    10. Überprüfen Sie die Zusammenfassung des Ausführungsplans, und klicken Sie dann auf Speichern und Drucken oder Speichern.

2. Automatisiertes NGS auf dem Sequenzer (Bearbeitungszeit: 30 min)

  1. Legen Sie die Probenplatte ein.
    HINWEIS: Die optimale Nukleinsäurekonzentration beträgt 0,5 ng/μl. Der validierte Nukleinsäurekonzentrationsbereich beträgt 0,33-1 ng/μl. Für DNA und RNA wurde die Konzentration von 1 ng/μl im Labor validiert.
    1. Der Sequenzer benötigt ein Gesamtvolumen von 20 μl. Stellen Sie sicher, dass genügend Volumen für die Probenbeladung vorhanden ist.
    2. Fügen Sie Positivkontrollen (DNA und RNA) und NTC (DNA und RNA) zur 1. Stufe des Reinigungsinstruments hinzu, ohne extrahiert zu werden. Verwenden Sie DNA- und RNA-Kontrollen für jeden Lauf, um den Lauf zu validieren und die verwendeten Chargen zu validieren. Fügen Sie der Platte am Ende des API-Laufs DNA- und RNA-Kontrollen hinzu.
  2. Laden Sie den Sequenzer und starten Sie einen Lauf.
    1. Entnehmen Sie alle Reagenzien aus ihren Behältern im Kühlschrank oder Gefrierschrank und tauen Sie sie bei RT für einen Zeitraum von mindestens 30 Minuten (Materialtabelle) und maximal 12 Stunden auf.
    2. Lassen Sie den Sequenzer im Labor immer eingeschaltet und befolgen Sie die Anweisungen des Lieferanten während der Schulung vor Ort. Melden Sie sich beim System an.
    3. Laden Sie die Platte aus dem Aufreinigungsgerät, das Proben enthält, nachdem Sie die Platte mit einer Folie aus selbstklebender PCR-Plattenfolie (Materialtabelle) versiegelt haben.
    4. Installiere alle Verbrauchsmaterialien im Deck. Der Sequenzer bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen, um jedes benötigte Verbrauchsmaterial an einer hervorgehobenen Stelle (Materialtabelle) zu laden.
    5. Vergewissern Sie sich, dass sich auf dem Rohr 3 des Streifens 2-HD keine Niederschläge befinden. Schnippen Sie das Rohr oder wirbeln Sie den Streifen vorsichtig vor, um den Niederschlag bei Bedarf aufzulösen.
    6. Streifen 1 und Streifen 3 enthalten magnetische Perlen. Dieser Schritt ist sehr wichtig: Stellen Sie sicher, dass die Perlen wieder aufgehängt sind. Im oberen Teil der Tube sollten keine Perlen mehr vorhanden sein.
    7. Drehen Sie den Streifen 3-4 Mal auf den Kopf und zurück, um die Perlen zu entfernen. Halten Sie den Streifen an einem Ende mit der Banddichtung nach oben gerichtet. Schwingen Sie den Streifen anschließend mit einer schnellen Zentrifugalarmbewegung schnell nach unten und beenden Sie ihn mit einer scharfen Bewegung des Handgelenks.
    8. Bei 300 x g 15 s zentrifugieren. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf. Zentrifugieren Sie die Streifen mit Adaptern und Streifenhaltern, um Ausfälle zu minimieren, die zufällig im Zusammenhang mit Kugelresten im oberen Teil der Streifen beobachtet werden.
    9. Schließen Sie das System und klicken Sie auf Weiter. Installieren Sie die Schachttüren der Sequenzierungsreagenzien (Materialtabelle). Schließen Sie die Tür. Der Sequenzer startet den Lauf automatisch.
  3. Reinigung
    1. Wenn die Bereinigung nach der Ausführung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Weiter.
    2. Die Tür öffnet sich sukzessive. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um den Abfall zu entleeren und alle Verbrauchsmaterialien zu entfernen. Klicken Sie auf Weiter.
    3. Schließen Sie den Stapel, wenn Sie fertig sind, und klicken Sie auf Weiter. Eine 2-minütige UV-Reinigung beginnt. Der Sequenzer ist bereit, einen neuen Lauf zu starten.

3. Analyse der Ergebnisse mit Hilfe der integrierten Software (Analysezeit pro Patient [Proben ADN und ARN]: 15 min)

HINWEIS: Die Technik ist vom französischen Akkreditierungsausschuss (COFRAC) ISO 15189 (https://www.cofrac.fr/) akkreditiert

  1. Daten und Ergebnisse
    1. Wählen Sie im Menü Ergebnisse ein Ausführungsergebnis oder ein Beispielergebnis aus. Auf dem Bild Ergebnisse/Laufergebnisse werden alle Läufe aufgelistet.
    2. Durchsuchen Sie die Ergebnisliste, indem Sie in einer Spaltenüberschrift filtern.
    3. Klicken Sie auf Ergebnisse und dann auf Beispielergebnisse. Klicken Sie dann in der Spalte Beispielname auf den Namen der gewünschten Probe, um die Sequenzierungsergebnisse für eine eindeutige Probe anzuzeigen.
    4. Klicken Sie in der oberen linken Ecke des Bildschirms auf Spalten oder heben Sie die Auswahl der Spalten in der Tabelle auf.
  2. Sehen Sie sich die QC-Ergebnisse an und sehen Sie sich die Amplikonabdeckung an.
    1. Klicken Sie auf die Registerkarte QC im Ergebnisbildschirm.
    2. Stellen Sie für DNA sicher, dass die medianen absoluten paarweisen Differenzen (MAPDs) zwischen 0 und 0,5 liegen, um die Analyse der Kopienzahlvarianten (CNV) zu validieren. Die zugeordneten Lesevorgänge müssen größer als 1,5 Millionen sein.
    3. Überprüfen Sie für RNA, ob die zugeordneten Lesevorgänge zwischen 150.000 und 400.000 liegen. Darunter besteht das Risiko von falsch negativen Ergebnissen, und darüber hinaus besteht das Risiko von falsch positiven Ergebnissen.
    4. Klicken Sie auf einen Beispielnamen, um die Registerkarte "Wichtige Ergebnisse" zu öffnen.
    5. Scrollen Sie zu den amplikon Coverage Graphs.
    6. Sehen Sie sich die Abdeckungsdiagramme an. Definieren Sie den Mindestschwellenwert für die Amplikon-Abdeckung, da der Lieferant ihn nicht bereitstellt. Um einen Bereich und einen Schwellenwert zu definieren, mischen Sie ein Steuerelement und ein Wildtyp-Beispiel (WT). Beobachten Sie dann den kleinsten Wert der Amplikonabdeckung für eine oder mehrere ausgewählte Mutationen.
  3. Zeigen Sie Variantenergebnisse an.
    1. Um die Daten im Tabellenformat zu exportieren, klicken Sie in der oberen rechten Ecke des Bildschirms auf Exportieren .
    2. Um das Ergebnis der einzelnen Nukleotidvariante/Insertions-Deletionsvariante (SNV/INDEL) anzuzeigen, klicken Sie auf die Registerkarte Varianten und dann auf SNVs/Indels. Klicken Sie auf "Filter bearbeiten " und wählen Sie "Kein Filter" aus.
      HINWEIS: Die Sensitivitätsschwelle wurde gemäß den Empfehlungen der INCA-Gruppe (Französisches Nationales Krebsinstitut) (https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes) auf 5 % festgelegt.
    3. Fusionsergebnisse und RNA-Exon-Varianten anzeigen: Klicken Sie auf die Registerkarte "Varianten" und dann auf "Fusionen".
    4. Klicken Sie oben rechts auf Visualisierung und RNA-Exon-Variante, und überprüfen Sie dann das Diagramm RNA-Exon-Varianten .
    5. Mit diesem Kit kann das Exon-Skipping der EGFR-, MET- und AR-Gene nachgewiesen werden. Klicken Sie auf Visualisierung. Es ist einfacher zu analysieren.
    6. RNA-Exon-Kachel-Fusionsungleichgewicht anzeigen: Klicken Sie auf den Tab "Varianten " und dann auf "Fusionen".
    7. Klicken Sie oben rechts auf Visualisierung und RNA-Exon-Kachelfusions-Ungleichgewicht, und überprüfen Sie dann die Diagramme der RNA-Exon-Kachelfusions-Ungleichgewicht . Eine Ungleichgewichtsfusion ist eine Verschmelzung zwischen einem bekannten Partner und einem Partner, der nicht durch das Gremium abgedeckt wird.
    8. CNV-Ergebnisse anzeigen: Klicken Sie auf der Registerkarte "Varianten" auf CNVs, um die Daten anzuzeigen.
      HINWEIS: Es ist notwendig, bei den Ergebnissen der CNV wachsam zu sein, indem man bei der Vorbereitung der Proben über das Geschlecht und den Prozentsatz der Tumorzellen der Probe informiert. Das AR-Gen wird nur vom X-Chromosom getragen. Wenn das Geschlecht nicht angegeben wird, kann es beim männlichen Geschlecht zu Verlusten kommen, was bei männlichen Patienten zu falsch positiven Ergebnissen führt.
  4. Überprüfen Sie die Plugin-Ergebnisse.
    1. Überprüfen Sie die Ergebnisse des Coverage-Analyse-Plugins : Klicken Sie oben rechts auf und wählen Sie Dateien herunterladen aus.
    2. Das Coverage-Analyse-Plugin generiert einen Coverage-Analyse-Bericht.
    3. Überprüfen Sie die Ergebnisse des Molecular Coverage Analysis-Plugins : Klicken Sie oben rechts auf und wählen Sie Dateien herunterladen aus. Diese Analyse überprüft, ob alle Amplikons abgedeckt sind, und bestätigt die von der Software bereitgestellten Ergebnisse der Kopienzahlvarianten (CNVs).
  5. Anzeigen von Assay-Metriken und des Ausführungsberichts
    1. Klicken Sie in der Ausführungszusammenfassung auf die Registerkarte Bericht ausführen.
    2. Um den Ausführungsbericht anzuzeigen, wählen Sie im Dropdown-Menü die Option Stichprobe auswählen aus.
    3. Assay-Metriken und der Ausführungsbericht: Oben auf dem Bildschirm finden Sie die Sequenzierungsmetriken, gefolgt von den stichprobenspezifischen Metriken in der Tabelle "Run Samples ".
      HINWEIS: Informationen in der CSA-Datei (Customer Support Archive) können bei der Fehlerbehebung helfen, sie können jedoch nicht direkt analysiert werden. Die CSA-Dateien fassen die Daten der gesamten Ausführungsdaten zusammen und heben die Ursachen eines Problems im Falle einer fehlgeschlagenen Ausführung hervor.
    4. Ausführungsbericht herunterladen: Klicke auf den Tab "Berichte ".
    5. Klicken Sie auf Bericht herunterladen , um eine Zusammenfassung des Ausführungsberichts im PDF-Format herunterzuladen.
  6. Variantenbericht generieren.
    1. Aktivieren Sie Bericht generieren im Schritt Setup, um während der Datenanalyse eines Laufs automatisch einen Variantenbericht für jede Stichprobe zu generieren.
    2. Nach der Generierung des Variantenberichts zu einer Stichprobe stellt das System den Bericht an zwei Stellen zur Verfügung: Zunächst wird ein Link auf dem Bild Ergebnisse/Stichprobenergebnisse zur Verfügung gestellt. Klicken Sie auf den Link, um die PDF-Datei herunterzuladen.
    3. Gehen Sie anschließend zum Bereich Variantenbericht auf der Registerkarte Berichte und klicken Sie auf die Schaltfläche Bericht herunterladen . Signieren Sie die Variantenberichte elektronisch oder manuell.
      HINWEIS: Elektronisch signierte Berichte haben (Sign off) nach dem Beispielnamen auf dem Bildschirm "Sample Results ".

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mit Hilfe des hier vorgestellten Verfahrens, das in unseren aktuellen Publikationen21 ausführlich beschrieben wurde, entwickelten wir einen optimalen Workflow für die Beurteilung molekularer Veränderungen als Reflextest in der routinemäßig durchgeführten klinischen Praxis zur Diagnose bei Patienten mit NS-NSCLC unter Verwendung eines ultraschnellen Amplicon-basierten Next-Generation-Sequencing-Ansatzes. Der molekulare Ablauf der Methode ist in Abbildung 1 dargestellt....

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Entwicklung eines ultraschnellen Amplicon-basierten NGS-Ansatzes als Reflextest zur Beurteilung molekularer Veränderungen bei der Diagnose eines NS-NSLC in jedem Stadium ist eine optimale Option für den Nachweis aller leitlinienempfohlenen und neu auftretenden Biomarker bei NS-NSCLC 5,22,23. Während sich sequentielle Methoden (IHC, PCR, FISH) nur auf bestimmte Gene konzentrieren und zu einer Erschöpfung des Gewebematerials f...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Christophe Bontoux nimmt an bezahlten Referentenaktivitäten teil und erhält Vorteile von Thermo Fisher Scientific. Paul Hofman nimmt an bezahlten Referentenaktivitäten teil und erhält Vorteile und Finanzmittel von Thermo Fisher Scientific.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Thermo Fisher Scientific für die Möglichkeit, ihr Gerät und ihre Materialien zu verwenden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
96 Well Hartschalenplatte klarThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)4483354
selbstklebende PCR-PlattenfolieThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)AB0626
AutoLys M Tube Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A38738FFPE-Probenverarbeitungsröhrchen
Genexus Barcodes 1-32 HDThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40261
Genexus GX5 Chip und Genexus KopplerThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40269
Genexus PipettenspitzenThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40266
Genexus AufreinigungsgerätThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A48148Automatisiertes Aufreinigungsgerät (API)
Genexus SequenzierungskitThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40271
Genexus Schablonenstreifen 3-GX5 und 4Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A40263
Genexus Integrierter SequenzerThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A45727
Ionen-Torrent  Genexus FFPE DNA/RNA Aufreinigungs-Kombi-KitThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A45539
Oncomine  Precision Assay GX (OPA) Panel (im Lieferumfang der Streifen 1 und 2-HD enthalten)Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA)A46291

Referenzen

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