Summary
כתב יד זה מתאר מכשיר עירוי צמחי ישיר חדשני לבדיקת יעילותן של מולקולות כנגד החיידק (Candidatus Liberibacter asiaticus) או וקטור החרקים שלו (Diaphorina citri, Kuwayama) הקשורים בשילוב למחלת ההדרים Huanglongbing.
Abstract
בדיקת תפקודן של תרכובות טיפוליות בצמחים היא מרכיב חשוב במחקר החקלאי. שיטות פוליאריות וספוגות קרקע הן שגרתיות אך יש להן חסרונות, כולל ספיגה משתנה ופירוק סביבתי של מולקולות שנבדקו. הזרקת גזע של עצים מבוססת היטב, אך רוב השיטות לכך דורשות ציוד יקר וקנייני. כדי לסנן טיפולים שונים עבור Huanglongbing, יש צורך בשיטה פשוטה וזולה להעברת תרכובות אלה לרקמת כלי הדם של עצי הדר קטנים שגדלו בחממה הנגועים בחיידק המוגבל בפלואם Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) או שורצים בווקטור החרק CLas הניזון מפלואם Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
כדי לעמוד בדרישות סינון אלה, תוכנן מכשיר עירוי צמחים ישיר (DPI) המתחבר לגזע המפעל. המכשיר מיוצר באמצעות מערכת הדפסה תלת ממדית מבוססת ניילון ורכיבי עזר הניתנים להשגה בקלות. יעילות ספיגת התרכובת של מכשיר זה נבדקה בצמחי הדר באמצעות סמן פלואורסצנטי 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. פיזור אחיד של הסמן בכל הצמחים נצפה באופן שגרתי.
יתר על כן, מכשיר זה שימש כדי לספק מולקולות מיקרוביאליות וקוטלי חרקים כדי לקבוע את השפעתם על CLas ו - D. citri בהתאמה. הסטרפטומיצין האנטיביוטי של אמינוגליקוזיד הועבר לצמחי הדר נגועים ב-CLas באמצעות המכשיר, מה שהביא לירידה בטיטר CLas משבועיים ל-4 שבועות לאחר הטיפול. העברת קוטל החרקים הניאוניקוטינואיד אימידקלופריד לצמחי הדרים שורצי D. citri הביאה לעלייה משמעותית בתמותה של פסיליד לאחר 7 ימים. תוצאות אלה מצביעות על כך שהתקן DPI זה מייצג מערכת שימושית להעברת מולקולות לצמחים לצורך בדיקה ולהקל על מטרות מחקר וסינון.
Introduction
ניהול צמחים בסביבה מסחרית ונוף דורש לעתים קרובות שימוש בתרכובות כימיות כדי לייעל את צמיחת הצמח ובריאותו. האופן שבו מולקולות אלה מועברות תלוי בסוג המולקולה, בתפקוד המולקולה, בסוג הצמח ובמערכת הניהול הקיימת. יישומים פוליאריים ויישומי קרקע הם אסטרטגיות המסירה הקלות ביותר, אך מגבלות בספיגה של מולקולות מסוימות מחייבות העברה ישירה. דוגמה למולקולות אלה היא מולקולות טיפוליות המתפקדות בצורה הטובה ביותר כאשר הן נעות באופן מערכתי בתוך הצמח, אך אינן יכולות להיות מועברות ביעילות על ידי יישומים אקטואליים פשוטים1. זה המקרה עם Huanglongbing (HLB), המכונה גם מחלת הדר ירוק. HLB היא מחלה הקשורה לחיידק מוגבל פלואם, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), שלא ניתן לגדל בתרבית מחוץ לצמח, או לווקטור החרק שלו, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
אם המולקולות הטיפוליות המשוערות הן תוצרים גנטיים, ניתן לבדוק אותן על ידי יצירת צמחים טרנסגניים המבטאים תרכובות אלה. עם זאת, ייצור צמחים טרנסגניים יכול להיות עתיר זמן ומשאבים, תלוי מאוד בגנוטיפ, וניתן לעכב אותו על ידי השתקת גנים3. בנוסף, גם אם טרנסגניות אלה מראות תוצאות מבטיחות, אילוצי רגולציה ותפיסה ציבורית מפחיתים את הסיכוי לקבלתם המסחרית 4,5. היישום האקסוגני של תרכובות, לעומת זאת, מפשט את הבדיקה של מולקולות ביולוגיות וסינתטיות מכיוון שהוא אינו דורש ייצור של צמחים טרנסגניים יציבים או בעלי ביטוי חולף, מה שמקטין את הזמן והמשאבים לבדיקת השפעות המולקולה. שיטה לאספקה מערכתית יעילה ויעילה של תרכובות אקסוגניות יכולה לשמש למגוון רחב של מטרות מחקר וסינון.
אחד היישומים הללו הוא ניתוח של תנועת מולקולות מערכתיות בתוך מערכת כלי הדם של הצמח, אשר יכול להיעשות באמצעות סמנים הניתנים למעקב, בין אם הם פלואורסצנטיים, גלויים, או איזוטופים כימיים ייחודיים 6,7,8,9. סמן פלואורסצנטי נפוץ אחד הוא 5,6-carboxyfluorescein-diacetate (CFDA), שהוא צבע חדיר לקרום שמתפרק על ידי אסטראזות תוך-תאיות ל-5,6-carboxyfluorescein (CF) ולאחר מכן הופך לפלואורסצנטי ואטום-קרום10. CFDA נמצא בשימוש נרחב כדי לפקח על הובלת פלואם, יחסי כיור ומקור, ודפוסי כלי דם ברקמת צמח11,12.
בנוסף לסמנים אלה, תרכובות מסוימות עשויות לשנות ישירות את הפיזיולוגיה של הצמח כדי להגדיל את התפוקה או להרוג את הצמח במקרה של קוטלי עשבים. גם קוטלי חרקים וגם תרכובות אנטי-מיקרוביאליות הם אמצעי להגדלת התפוקה של צמחים, במיוחד בנוכחות HLB. דוגמה למולקולה אנטי-מיקרוביאלית המשמשת לבקרת CLas היא סטרפטומיצין. סטרפטומיצין היא אנטיביוטיקה אמינוגליקוזידית שבודדה במקור מסטרפטומיצס גריסוס והוכחה כמעכבת צמיחת חיידקים באמצעות עיכוב של ביוסינתזה של חלבונים13. במונחים של קוטלי חרקים, היעד העיקרי למחקר HLB הוא D. citri, אשר מעביר CLas מעץ לעץ14. לשם כך משתמשים בדרך כלל בניאוניקוטינואידים, כגון אימידקלופריד, שכן הם תקן הזהב להדברת מזיקים15. כל השימושים המגוונים הללו הם היבטים חשובים של אסטרטגיות ניהול המפעל הנוכחיות, ופיתוח מוצרים חדשים תלוי בבדיקות סינון יעילות.
שיטה אחת המשמשת להחדרת תרכובות לצמחים עציים היא הזרקה ישירה לגזע. תוכננו מגוון מערכות המשתנות בצרכיהן באתרי הזרקה שנקדחו מראש, ומערכות אלה משתמשות בהזרקה מבוססת לחץ או בזרימה פסיבית16. למרות שמערכות מבוססות לחץ מאפשרות החדרה מהירה של תרכובת נתונה,יש לקחת בחשבון את הנזק הפיזי הפוטנציאלי שנגרם על ידי אילוץ נוזלים דרך כלי דם חסומים או תסחיפים. אף על פי שיישום העלווה או הספוג של תרכובות דורש פחות זמן ליישום, הזרקה ישירה של הצמח מפחיתה את בזבוז התרכובת הריבית עקב הפסדים לאוויר או לקרקע ויכולה גם להאריך את הזמן שבו תרכובות נמצאות במצב פעיל על ידי הפחתת החשיפה לסביבה החיצונית18. שני היבטים אלה חשובים לשימור ריאגנטים יקרים ולהבטחת עקביות בין משכפלים במסגרות מחקר.
מחקר זה מתאר את התכנון, הבנייה והשימוש במכשיר חדשני לעירוי צמחים ישיר (DPI), שניתן להשתמש בו כדי להעריך כיצד תרכובות עניין משפיעות על צמח מארח. מדפסת תלת ממד סטנדרטית שימשה לייצור המכשיר עצמו ומספר רכיבים הקשורים לבנייתו. שיטת בנייה פנימית זו מאפשרת לחוקרים לשנות את רכיבי המכשיר והמכשיר בהתבסס על צרכי הניסוי הספציפיים שלהם ומפחיתה את ההסתמכות על מכשירי הזרקת צמחים זמינים מסחרית. הגדרת המכשיר פשוטה ויעילה, וכל רכיבי העזר זמינים וזולים. למרות שהמערכת תוכננה לשימוש עם מגוון מיני צמחים, הדוגמאות המובאות כאן מתייחסות לעציצי הדרים. בנוסף, מחקר זה מדגים כי מכשיר זה מסוגל להעביר ביעילות סוגים רבים של תרכובות באופן מערכתי לצמחי הדר צעירים מבלי לגרום לקטלניות. התרכובות שנבדקו כללו CFDA, ששימש להערכת התפלגות התרכובות בצמח, וסטרפטומיצין ואימידקלופריד, ששימשו כדי לוודא שההשפעות האנטי-מיקרוביאליות וקוטלי החרקים של תרכובות אלה נצפו כאשר הועברו באמצעות DPI.
Protocol
1. ייצור צמחי הדר להזרקת תרכובת ניסיונית
- הפיצו עציצים קטנים של עצי הדר מייחורים צמחיים מושרשים או מזרעים. הגדילו את קווי ההדרים בעציצים באורך יום בהיר/כהה של 16 שעות/8 שעות ובטמפרטורה של 28°C.
- בחר צמחי הדר בגודל המתאים לניסוי. היישומים המתוארים דרשו שהצמחים יהיו בגובה של בין 12 ס"מ ל-100 ס"מ וקוטר גזע של 4-14 מ"מ. אם יש צורך בגידול סומק חדש, צמצמו את הצמחים לפני הניסוי.
2. הדפסה תלת מימדית של מכשיר ה- DPI ורכיבי תבנית
- יש למרוח שכבה דקה של דבק על בסיס פוליוויניל אצטט על מיטת ההדפסה.
- טען ניילון ניילון למדפסת תלת מימד, והכן את המדפסת בהתאם להוראות היצרן. ייבא את הרצוי . קובץ STL (קובץ משלים 1, קובץ משלים 2, קובץ משלים 3, קובץ משלים 4, קובץ משלים 5, קובץ משלים 6, קובץ משלים 7, קובץ משלים 8, קובץ משלים 9, קובץ משלים 10, קובץ משלים 11, קובץ משלים 12, קובץ משלים 13 וקובץ משלים 14), הגדר והתחל להדפיס.
- הסר את הפריט ממיטת ההדפסה. שטפו את הדבק על בסיס פוליוויניל אצטט מבסיס הרכיב המודפס במים, והסירו את כל מבני התמיכה.
- רססו את רכיב ה-DPI בשתי שכבות של צבע ספריי מבריק שקוף.
3. ייצור תבנית טבעת הפלסטיזול
- הרכיבו תבנית גדולה מספיק כדי להכיל את חלקי הדוגמה על-ידי בניית מארז מלבני באמצעות קוביות פלסטיק צמודות זו לזו על בסיס (איור משלים S1A).
- ערבבו את מונומר הסיליקון RTV ואת הזרז יחד ביחס של 10:1, וערבבו מבלי ליצור בועות במשך דקה אחת. צבעו על-ידי הוספת צבעי מאכל (3 טיפות/25 מ"ל תערובת סיליקון) וסבון ידיים (1 מ"ל סבון/25 מ"ל תערובת סיליקון) (איור משלים S1B).
- יוצקים שכבה דקה של סיליקון לתוך צורת התבנית כי הוא מספיק כדי לכסות לחלוטין את התחתית. מהדקים כדי לשטח את פני השטח, וממתינים 24 שעות עד שהסיליקון שוקע (איור משלים S1C).
- יוצקים שכבה שנייה של סיליקון, כפי שתואר לעיל, עמוקה מספיק כדי לכסות את טביעת ליבת החור המרכזית על התבנית (ניתן לראות בחלק העליון של הדוגמה באיור משלים S1D). הכניסו את הדוגמה לסיליקון הנוזלי כאשר הדפס ליבת החור המרכזי פונה כלפי מטה. ודאו שלא נלכדו בועות ושהדפוסים מופרדים היטב ואינם נוגעים (איור משלים S1E).
- הדקו את הדוגמאות באמצעות חפץ כבד ו/או סרט הדבקה כדי למנוע מהן לצוף החוצה מהסיליקון בזמן שהוא שוקע. המתינו 24 שעות עד שהשכבה שזה עתה נמזגה תשקע (איור משלים S1F).
- יוצקים שכבות סיליקון נוספות עד שהרמה סומקת עם החלק העליון של התבנית. המתן 24 שעות כדי לרפא (איור משלים S1G).
- יש לפרק את קוביות הפלסטיק הצמודות זו לזו כדי לשחרר את התבנית. הסירו את הדפוסים (איור משלים S1H). בדקו את התבנית לאיתור קרעים או עיוותים (איור משלים S1I).
4. יציקת טבעות הפלסטיזול
- מצפים את פנים התבנית, את כל רכיבי הליבה, ואת טבעות ה-O בשמן בישול (איור משלים S2A, B). הניחו טבעת O סביב החריץ במרכז ליבת העמוד המרכזית, ומקמו את הליבה בחור המרכזי של תבנית טבעת הפלסטיזול (איור משלים S2C).
- הכנס את ליבת תעלת המסירה לחור בצד תבנית טבעת הפלסטיזול. כוונו את הקצה בצורת V בקצה ליבת ערוץ המסירה כך שיישר עם טבעת ה-O בליבת הפוסט המרכזית (איור משלים S2D,E).
- חממו פלסטיזול במיקרוגל להתפרצויות קצרות של 10 שניות (איור משלים S2F, G). יש לערבב פלסטיזול בעדינות כדי למנוע בועות (איור משלים S2H). חזרו על החימום והערבוב עד שהתמיסה תגיע לטמפרטורה שבין 160°C ל-170°C (איור משלים S2I).
זהירות: התחממות יתר של הפלסטיזול עלולה להוביל לשחרור אדים רעילים. בצע את ההליך באזור מאוורר היטב או מכסה אדים. אין לחמם את הפלסטיזול מעל 170°C. - יוצקים את הפלסטיזול המותך לתוך תבנית טבעת הפלסטיזול ליד הקצה החיצוני של התבנית מבלי להכניס בועות (איור משלים S2J). המתינו שעה אחת עד שטבעות הפלסטיזול יתקררו (איור משלים S2K). מוציאים את הטבעות מהתבנית. ודא התאמה נאותה עם התקן ה- DPI לפני השימוש בבדיקות ניסיוניות (איור משלים S2L).
5. חיבור מכשיר ה- DPI למפעל
- מצא אתר חלק ובריא בתא המטען עבור הקובץ המצורף למכשיר. הימנע מכל בליטות או קשרים, שכן אלה יכולים לתרום לדליפת המכשיר.
- השתמשו במקדח בקוטר 2 מ"מ כדי לקדוח חור אופקית דרך מרכז הגבעול בזווית של 90° עם משטח תא המטען (איור משלים S3A). העבירו את המקדחה דרך החור מספר פעמים כדי לנקות ולהחליק אותה וליצור חור ללא הפרעה (איור משלים S3B).
- צרו פרוסה אנכית בטבעת הפלסטיזול בצד הנגדי של תעלת ההולכה המורכבת (איור משלים S3C). התאימו את הטבעת סביב הצמח, ורפדו את תעלת המסירה עם החור שנקדח קודם לכן (איור משלים S3D).
הערה: הטבעת חייבת להתאים היטב סביב תא המטען כדי למנוע דליפות; ניתן להשתמש במכלולי ליבה בקטרים שונים להכנת טבעות פלסטיזול לגבעולי צמחים בגדלים שונים. - הוסף את התקן ה- DPI לטבעת הפלסטיזול, וודא שהם מתאימים היטב זה לזה. יישר את זרבובית התקן ה- DPI עם תעלת המסירה של טבעת הפלסטיזול והחור שנקדח (איור משלים S3E).
הערה: שימוש במקדחה כדי ליישר את החור ואת זרבובית התקן ה- DPI יכול להיות מועיל. - עטפו היטב בסרט סיליקון כדי להחזיק את המכשיר במקומו (איור משלים S3F). בדוק את המכשיר המורכב והמחובר במלואו כדי להבטיח יישור והתמצאות נאותים על הצמח.
6. החלת דריבית ריבית באמצעות מכשיר DPI
- השתמש מזרק או פיפטה כדי למלא את מכשיר ה- DPI בתמיסה מעניינת (איור משלים S3G). השתמשו במזרק כדי לחדור את סרט הסיליקון ואת טבעת הפלסטיזול בצד הנגדי של מכשיר ה-DPI כדי למשוך אוויר מהתעלה הפנימית ולמנוע החדרת בועות אוויר לכלי הדם של הצמח (איור משלים S3H). החלף את כל התרכובת שחולצה בחזרה להתקן DPI.
- מוסיפים עוד טלאי קטן של סרט סיליקון מעל החור שנוצר על ידי המזרק כדי לחזק את האזור ולמנוע קרעים. בדוק את המנגנון לאיתור נזילות גלויות בנקודת החיבור, ובדוק את מאגר המכשיר לרמת נוזל יציבה.
הערה: ניתן להשתמש במים בתחילה כדי לבדוק דליפות כדי למנוע בזבוז של תמיסת בדיקה. - כסו את הקצה הפתוח של מכשיר ה- DPI בסרט איטום שעווה, ומשכו מטה כדי ליצור אטם ולהפחית את אידוי התרכובת הניסיונית. תקעו חור בודד בסרט השעווה עם קצה מזרק כדי למנוע התפתחות ואקום, ולאחר מכן מלאו מחדש את המכשיר (איור משלים S3I).
- בדקו את המכשיר מדי יום כדי לוודא יישור נכון של הרכיבים (איור משלים S3J), ומלאו את הנוזל באמצעות מזרק כדי למנוע מהמאגר להתייבש. חזור על תהליך זה עד להצגת הכמות הרצויה של פתרון ניסיוני.
הערה: ניתן להציג בהצלחה תרכובות ממכשיר נתון למשך עד חודש אחד. יש לבדוק אמפירית משכי קליטה של פתרונות החורגים ממסגרת זמן זו לפני התקנת הניסוי.
7. שימוש ב- CFDA לצפייה בתנועת כלי הדם עם צמחי הדר
- חבר את התקן ה- DPI לצמחי ציטרון (Citrus medica L.) בגובה 25 ס"מ, החל טיפול יחיד של 2.0 מ"ל של 20% DMSO בבקרת H2O או CFDA על מכשיר ה- DPI, ואפשר לו להיקלט למשך 24 שעות. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, הכן את פתרון CFDA הפועל על ידי הוספת 1.6 מ"ל של H 2 O עד 400 מיקרוליטר של תמיסת מלאי CFDA (פתרון המניות מכיל 10 mM CFDA מומס ב 100% dimethyl sulfoxide [DMSO]) כדי ליצור ריכוז CFDA סופי של2mM ו 20% DMSO.
- צור חתכים של רקמות שונות של הצמח, והשתמש בסטריאוסקופ או במיקרוסקופ מורכב עם מסנן פלואורסצנטי הכולל את אורך הגל של 498 ננומטר כדי לדמיין את CFDA ברקמות הצמח. השווה את התמונות לפקדי DMSO של 20% בפקדי H2O כדי להסביר אוטופלואורסצנטיות ברקמה.
8. מדידת שינויים בטיטר CLas בדגימות עלים לאחר טיפול בסטרפטומיצין
- באמצעות צמחי CLas נגועים בחממה בגובה 0.75 מ' (Citrus sinensis (L .) Osbeck "Valencia"), אוספים מכל צמח את הפטוטרת והצלע האמצעית של שני עלים סימפטומטיים מסוג HLB, קוצצים אותם למקטעים קטנים, מאגדים כל סוג רקמה ומאחסנים אותם בנפרד בצינורות דגימה עמידים בפני פגיעות של 2 מ"ל המכילים כדור פלדה בקוטר 6.35 מ"מ.
- טחנו את הדגימה באמצעות הומוגנייזר שתוכנת לשני מחזורים של 15 שניות במהירות של 3.4 מטר לשנייה. חלץ את חומצת הגרעין הכוללת כמתואר קודם19.
- בצע qPCR על דגימות עלים נגועים ב-CLas באמצעות תערובת qPCR המוגדרת בטבלה 1 ותנאי התגובה שהוגדרו בטבלה 2. השתמש בצמחים המציגים זיהומי CLas חזקים (זיהום חזק מוגדר בדרך כלל כערכי Ct מבוססי qPCR < 30 עבור ערכת הפריימר CLas 16S LasLong (LL) לניתוח נוסף.
הערה: הטיטר החיידקי מוערך באמצעות CLas 16S Las Long (LL) ופריימרים DNA של דהידרין הדרים כדי להעריך את המקבילות הגנומיות היחסיות, כפי שתואר קודם לכן20. - הלבישו את צמחי ההדר העומדים בטיטר הזיהום המינימלי שתואר לעיל במכשירי DPI, והעבירו אותם לטיפול חד פעמי של 2.0 מ"ל בתמיסת H2O או בתמיסת סטרפטומיצין בריכוז הרצוי. כדי לעקוב אחר מחקר זה, השתמש בטיפול יחיד של 2.0 מ"ל של 9.5 מ"ג / מ"ל (19 מ"ג בסך הכל) סטרפטומיצין מומס ב H2O.
- יש לאסוף דגימות עלים לאחר 7 ימים, 14 ימים ו-28 ימים לאחר הטיפול. בדוק את העלים שנדגמו עבור טיטר CLas באמצעות אותו פרוטוקול שתואר לעיל.
- לאחר 60 יום לאחר הטיפול, להשיג תמונות של הצמחים שטופלו עם H2O או סטרפטומיצין. השתמש בתצפיות חזותיות של זיהום CLas כדי לדרג את חומרת הזיהום. חפשו <50% מהעלים המראים כלורוזיס בין-ורידי ופקק ורידים יחד עם צמיחת סומק עלים כסימנים לזיהום קל ויותר מ-50% מהעלים עם כלורוזיס בין-ורידי פקק ורידים, כמו גם בקיעת עלים ועיכוב בצמיחת הצמח כסימנים לזיהומים חמורים יותר.
9. מדידת התמותה של D. citri לאחר טיפול באימידקלופריד
- גזום צמחי ציטרון (Citrus medica L.) בגובה 0.5 מ' לגובה של 12 ס"מ כדי לעודד צמיחה של סומק חדש.
הערה: מהירות צמיחת הסומק יכולה להיות תלויה בבריאות הצמח ובזמן השנה; לכן, קחו זאת בחשבון במהלך תכנון ניסיוני. - לאחר >6 סומק, 1-2 ס"מ אורך, התפתחו, להכניס את הצמחים לתוך כלובים המכילים D. citri בוגר. השאירו את הצמחים בכלובים למשך 24 שעות כדי לאפשר שקיעת ביצים.
- בצע ספירת ביצים מייצגת על שלושה יורה סומק 1-2 ימים לאחר ההטלה, ולאחר מכן להחיל את מכשירי DPI. מלא מכשירים אלה עם 2.0 מ"ל של בקרת מים או את הריכוז הרצוי של imidacloprid (21.8% חומר פעיל). כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש ב- 528 μL/L, 52.8 μL/L ו- 5.28 μL/L של imidacloprid.
הערה: ספירת ביצים היא אמצעי הרסני, ולכן הספירות בשלב זה משמשות להערכת מספר הביצים על סומק שלא נספר של אותו צמח ועוזרות לספק קו בסיס לספירות הבאות של הופעת הנימפה שנערכות בסוף הניסוי. - אספו את שיעור הופעת D. citri על לפחות שלושה משוט ההדחה הנותר. רכשו צילומי צמחים מייצגים 7 ימים לאחר הכנסת התרכובת.
Representative Results
רכיבי התקן עירוי ישיר
גרסת הבסיס של מכשיר העירוי הישיר היא בגובה 8 ס"מ וברוחב 3.3 ס"מ מלפנים ובצד (איור 1A). הוא מכיל מאגר מרכזי יחיד שרציף עם הזרבובית, והנפח הכולל שניתן להכיל בתוך הרכיבים האלה הוא 2.0 מ"ל (איור 1D). טבעת הפלסטיזול היא בגובה 1.8 ס"מ וקוטרה 2.7 ס"מ (איור 1C). טבעת זו מכילה גם שני ערוצים: אחד כדי להכיל את זרבובית מכשיר DPI והשני בקוטר משתנה שמתאים סביב גזע העץ המטופל. נוסף על כך, יש חריץ סביב התעלה האנכית כדי לכוון טיפול עודף להקיף את העץ, מה שמאפשר ספיגה נוספת של תרכובת דרך הקליפה (איור 1F). כאשר היא מורכבת כראוי, טבעת הפלסטיזול צריכה להיות צמודה למכשיר ה-DPI, והפיה צריכה להתיישר עם החור שנקדח בעץ (איור 1B ואיור 1E).
CFDA
כדי לחקור את היעילות של מכשיר DPI להחדרת כימיקלים אקסוגניים לצמחי הדרים, 2.0 מ"ל של 2 mM CFDA הסתננו באמצעות המכשיר. אות פלואורסצנטי זוהה בכלי הדם של הצמח שטופל (איור 2A), אולם נעדר במפעלי הבקרה שטופלו ב-20% DMSO ב-H2O (איור 2B). האות הזה נצפה בכל סוגי רקמות הצמחים שנותחו, כולל מזופיל עלים, כלי דם פטיוליים, כלי דם גזעיים וכלי דם שורשיים (איור 2C). אות זה נצפה בצמח תוך 24 שעות מהטיפול והופץ באופן שווה יחסית בכל הרקמות.
סטרפטומיצין
כדי לבדוק אם לתרכובות שהוכנסו הייתה השפעה טיפולית על מחלת HLB, 2.0 מ"ל של תרכובת קוטלת חיידקים, סטרפטומיצין, הוכנסו לצמחי תפוז מתוקים חיוביים ל-CLas (Citrus sinensis) בריכוז של 9.5 מ"ג/מ"ל (19 מ"ג בסך הכל). הצמחים האלה נשמרו בעציצי חממה, וטיטר CLas (שנמדד על-ידי מקבילות גנום CLas לכל שווה ערך לגנום הדרים) נוטר לאורך זמן באמצעות qPCR (איור 3A). הממוצע הראשוני של DNA CLas עבור צמחים שטופלו בסטרפטומיצין ו-H2O-treated היה 0.562 CLas גנום/גנום הדרים ו-0.49 CLas גנום/גנום הדרים, בהתאמה. הפחתה בטיטר החיידקי הממוצע זוהתה על ידי qPCR 7-28 ימים לאחר הטיפול בסטרפטומיצין בהשוואה לבקרות H2O באותה נקודת זמן. בנוסף, ההבדל בין הזמן 0 ליום 28 הממוצע היה 0.314 ו 0.117 עבור צמחים שטופלו סטרפטומיצין ו H2צמחים שטופלו O, בהתאמה.
ניסוי זה נועד למדוד את תגובת הצמח לטיפולים שונים על פני תקופות זמן שונות. נעשה שימוש בתכנון משטח תגובה ריבועית דו-גורמית, כאשר הזמן טופל כגורם בדיד כמותי עם ארבע רמות (0 ימים, 7 ימים, 14 ימים ו-28 ימים) והטיפול כגורם קטגורי עם שתי רמות (H2O וסטרפטומיצין). חמישה עותקים משוכפלים שימשו עבור כל אחד משמונת שילובי הטיפולים, וטיטר CLas נמדד כמשתנה התגובה. הנתונים שונו באמצעות יומן10 בהתבסס על ניתוח עלילה של בוקס-קוקס. הפחתת המודל בוצעה על ידי בחירה קדימה באמצעות קריטריון המידע של Akaike (AICc)21, שהביא להסרת השפעות הזמן והאינטראקציה. הגורם הנותר, הטיפול, היה משמעותי (p = 0.0252), כאשר צמחים שטופלו בסטרפטומיצין הראו ממוצע CLas titer נמוך יותר (0.349) מאשר הצמחים שטופלו ב-H2O (0.496) בכל נקודות הזמן יחד (איור 3B). ירידה זו בטיטר CLas תאמה לעלייה מזדמנת בצמיחת סומק בריאה חדשה לאחר 60 יום בצמחים שטופלו בסטרפטומיצין, כפי שניתן לראות בתצלומים של עצים מייצגים שטופלו ב-H2O (איור 3C) לעומת 19 מ"ג סטרפטומיצין (איור 3D).
אימידקלופריד
Imidacloprid הוכנס לצמחי ציטרון שורצי הדרים אסיאתיים צעירים (ACP) באמצעות מכשיר DPI כדי לבחון את הפוטנציאל שלו כבדיקת D. citri לבדיקת קוטלי חרקים. טיפול יחיד של 2.0 מ"ל בתמיסת קוטל חרקים אימידקלופריד מסחרית נבדק בשלושה ריכוזים שונים (5.28 μL/L, 52.8 μL/L ו-528 μL/L), יחד עם בקרת מים. ספירת הביצים הכוללת הממוצעת לשלושה נבטי הדחה לפני הטיפול נעה בין 280.5 ל-321, ולא היו הבדלים משמעותיים בין הצמחים ששימשו בכל קבוצת טיפול (איור 4A). הנימפות הממוצעות ששרדו בשלושה שוטי הדחה 7 ימים לאחר הטיפול היו 293.75, 268, 97.5 ו-2 עבור בקרת המים ו-5.28 μL/L, 52.8 μL/L ו-528 μL/L imidacloprid solutions, בהתאמה (איור 4B). זה ייצג ירידה משמעותית בהופעת נימפה פסילידית ברמות 52.8 μL/L (p = 0.029) ו- 528 μL/L (p = 0.002) imidacloprid solution בהשוואה לבקרת המים על פי ANOVA חד-כיווני ואחריו ניתוח פוסט-הוק של Tukey. נוסף על כך, העלייה הזו בתמותה של נימפות פסיליד ברמת התמיסה האימידקלופרית הגבוהה ביותר נראתה לעין על-ידי הירידה בייצור טל הדבש של הנימפה בקווים שטופלו באימידקלופריד (איור 4D) בהשוואה לבקרת המים (איור 4C).
איור 1: מכשיר העירוי הישיר של הצמח וטבעת הפלסטיזול. (A) מכשיר העירוי הישיר של הצמח השלם ו-(C) טבעת הפלסטיזול יחד עם מידותיהם. (B) מכשיר העירוי הישיר של הצמח וטבעת הפלסטיזול המחוברים ומחוברים לעץ הדר. חתכים אנכיים של (D) מכשיר עירוי ישיר של צמחים, (F) טבעת פלסטיזול, ו-(E) שני רכיבים אלה מחוברים ומחוברים לעץ הדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: חתך רוחב של צלע אמצע העלה של צמח הדר בקוטר 25 ס"מ. תמונות המציגות 24 שעות לאחר הטיפול עם (A) 2 mM CFDA או (B) 20% DMSO ב- H2O באמצעות מכשיר העירוי הצמחי הישיר. (C) חתכי רוחב של רקמת צמח שונים 24 שעות לאחר טיפול CFDA של 2 mM, כולל הגזע 5 ס"מ מעל מכשיר העירוי הישיר של הצמח (למעלה משמאל), הגזע 5 ס"מ מתחת למכשיר העירוי הישיר של הצמח (אמצע שמאל), השורש (למטה משמאל), הצלע האמצעית של העלה (למעלה מימין), פטוטרת העלה (אמצע ימין) ומזופיל העלה (למטה מימין). פסי קנה מידה = 1 מ"מ. קיצורים: CFDA = 5,6-carboxyfluorescein-diacetate; DMSO = דימתיל סולפוקסיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניטור טיטר CLas (נמדד על-ידי מקבילות גנום CLas לכל שווה ערך לגנום הדרים) לאורך זמן באמצעות qPCR. (A) מהלך זמן המציג שינויים בטיטר הדנ"א של CLas המשווה בין חמשת הצמחים שטופלו בסטרפטומיצין במינון 19 מ"ג לבין חמשת הצמחים שטופלו בביקורת H2O. הנקודות מייצגות את הממוצע לטיפול נתון בנקודת זמן נתונה. קווי השגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. (B) גרף עמודות המציג את ממוצע ה-CLas titer של צמחים H2O וסטרפטומיצין בכל נקודות הזמן. פסי השגיאה מייצגים את הרווח בר-סמך של 95%, והכוכביות מציינות הבדלים משמעותיים (* = p < 0.05) בין טיטרי CLas ממוצעים עבור הסטרפטומיצין לבין H2O-מטופלים על פי ANOVA חד-כיוונית. (C) תמונות מייצגות של צמחי הדר 0 חודשים וחודשיים לאחר טיפול ישיר בעירוי צמחים עם (C) H2O או (D) סטרפטומיצין. הצמחים שטופלו בסטרפטומיצין מראים צמיחה חדשה של סומק עלים בצבע ירוק בהיר לאחר חודשיים, מה שמרמז על ירידה בטיטר CLas. קיצור: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מעקב אחר תמותת נימפות פסיליד בצמחי ציטרון צעירים שורצי ACP. גרפים של עמודות המראים (A) את ספירת הביצים הראשונית המשוערת ו-(B) נימפות D. citri ששרדו על שלושה הדרים 7 ימים לאחר הטיפול בבקרת מים ודילולים שונים של אימידקלופריד. קווי השגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע, והכוכביות מציינות הבדלים משמעותיים (* = p < 0.05, ** = p < 0.01) בין רמת טיפול נתונה לבין בקרת המים על פי ANOVA חד-כיווני ואחריו ניתוח פוסט-הוק של Tukey. תמונות של D. citri נימפה שורץ הדרים סומק 7 ימים לאחר הטיפול עם (C) בקרת המים או (D) 528 μL / L imidacloprid באמצעות מכשיר עירוי הצמח ישיר. קיצורים: ACP = פסיליד הדרים אסייתי; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| נפח לדגימה (μL) | רכיב | |||||
| 12.5 | 2x GoTaq qPCR עם BRYT Green Dye Master Mix | |||||
| 5 | תבנית DNA (20 ng/μL) | |||||
| 0.5 | פריימר F ו-R של 10 מיקרומטר עבור CLas | Clas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (קדימה); TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGTAAAA (הפוך) |
||||
| 0.5 | 10 מיקרומטר פריימר F ו-R למשק בית הדרים | הדרים dehydrin: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (קדימה); AAAACTTCACCGATCCACCAG (הפוך) |
||||
| 6.5 | ח2O | |||||
טבלה 1: תערובת qPCR המשמשת לכימות טיטר CLas בקווי הדרים שטופלו בסטרפטומיצין. הרצף של פריימרים 16S Las Long ופריימרים של הדר דהידרין לכימות DNA CLas וכימות DNA הדרי מוצגים.
| צעד | טמפרטורה (°C) | זמן | |
| 1 | דנטורציה ראשונית | 95 | 2 דקות |
| 2 | דנטורציה | 95 | 15 שניות |
| 3 | חישול | 60 | 20 שניות |
| 4 | סיומת | 72 | 20 שניות |
| 5 | עבור לשלב 2, חזור על 39x | ||
| 6 | עקומת התכה | 60 השתוללות עד 95 ב-0.2° צלזיוס/שנייה | 3 דקות |
טבלה 2: תנאי תגובה עבור qPCR המשמש לכימות טיטר CLas בקווי הדרים שטופלו בסטרפטומיצין.
איור משלים S1: תמונות המציגות את תהליך ההרכבה של התבנית ליצירת טבעת הפלסטיזול. (A) בלוקים מפלסטיק מחוברים שימשו ליצירת השכבה הראשונה של תבנית טבעת הפלסטיזל. (B) תמיסה מעורבבת באופן אחיד המכילה סיליקון RTV גומי, זרז, צבעי מאכל וסבון. (C) יוצקים באופן שווה את השכבה הראשונה של תבנית טבעת הפלסטיזול. (D) תמונה של תבניות טבעת הפלסטיזול עם טביעת הליבה המרכזית בחלק העליון. (E) תבניות טבעת פלסטיזול המוחדרות לשכבה השנייה של התבנית. (F) סרט מיסוך ומאלט גומי המשמש לאבטחת התבניות בזמן שהשכבה השנייה מרפאת. (ז) שכבה שלישית של התבנית שמוסיפים עד שהיא צמודה לחלק העליון של התבניות. (ח) הסרת התבניות מהתבנית. (I) תבנית טבעת פלסטיזול בנויה במלואה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S2: תמונות המציגות את תהליך ההרכבה של טבעת הפלסטיזול הקשורה למכשיר העירוי הישיר של הצמח. (A) רכיבי הרכבת טבעת פלסטיזול, כולל התבנית, הליבה המרכזית עם טבעת O וליבת תעלת המסירה. (B) ציפוי הליבות בשמן בישול בתרסיס נון סטיק כדי להקל על הסרת טבעת הפלסטיזול לאחר ההתקשות. (C) החדרת הליבה המרכזית וטבעת ה-O לתבנית. (D) החדרת ליבת תעלת המסירה בניצב לליבה המרכזית. (ה) הרכבה תקינה של רכיבי הליבה של טבעת הפלסטיזול בחלל התבנית. (F) פלסטיזול המשמש ליצירת טבעת הפלסטיזול. (G) חימום הפלסטיזול במיקרוגל. (H) ערבוב הפלסטיזול לאחר חימום. (I) בדיקת טמפרטורת הפלסטיזול. (J) יציקת הפלסטיזול המחומם לתוך הליבה המורכבת. (K) לאפשר קירור של הפלסטיזול סביב הליבה המורכבת. (L) טבעות פלסטיזול בהרכבה מלאה המחוברות למכשיר העירוי הישיר של הצמח. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S3: תמונות המציגות את תהליך ההרכבה של מכשיר העירוי הישיר של הצמח. (א) קידוח חור במרכז צמח ההדר ליצירת תעלה להעברת תרכובות. (B) מבט חזיתי על החור שנקדח. (C) חיתוך טבעת הפלסטיזול עם סכין גילוח מול תעלת ההולכה של התרכובת. (D) התאמת טבעת הפלסטיזול בחוזקה סביב הגבעול במקום החור שנקדח קודם לכן. (ה) התאמת מכשיר העירוי הישיר של הצמח לטבעת הפלסטיזול, כאשר ברז העברת התרכובת על המכשיר מוכנס לתעלה של טבעת הפלסטיזול. (ו) שימוש בסרט סיליקון כדי להצמיד את מכשיר העירוי הישיר של הצמח לטבעת הפלסטיזול ולהחזיק את כל המכשיר במקומו. (ז) מילוי תא מכשיר העירוי הישיר של הצמח בריבית הגבוהה. (H) שימוש במזרק כדי למשוך אוויר מהחור שנקדח בצמח ולהתחיל את זרימת התרכובת. (I) מריחת סרט איטום שעווה על הפתח בתא התקן העירוי הישיר של הצמח וניקוב חור למניעת ואקום. (י) מכשיר עירוי צמחי ישיר בהרכבה מלאה על צמח הדר. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 1: טבעת הפלסטיזול המרכזית פוסט ליבה . קובץ STL לעץ 4 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: טבעת פלסטיזול מרכז פוסט ליבה . קובץ STL לעץ 6 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 3: טבעת הפלסטיזול המרכזית פוסט ליבה . קובץ STL לעץ 8 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 4: טבעת הפלסטיזול המרכזית פוסט ליבה . קובץ STL לעץ 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 5: ליבת הפוסט המרכזית של טבעת הפלסטיזול . קובץ STL לעץ 12 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 6: טבעת הפלסטיזול המרכזית פוסט ליבה . קובץ STL לעץ 14 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 7: ליבת ערוץ מסירת טבעת הפלסטיזול . קובץ STL לעץ 4 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 8: ליבת ערוץ מסירת טבעת הפלסטיזול . קובץ STL לעץ 6 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 9: ליבת ערוץ אספקת טבעת הפלסטיזול . קובץ STL לעץ 8 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 10: ליבת ערוץ אספקת טבעת הפלסטיזול . קובץ STL לעץ 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 11: ליבת ערוץ אספקת טבעת הפלסטיזול . קובץ STL לעץ 12 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 12: ליבת ערוץ מסירת טבעת הפלסטיזול . קובץ STL לעץ 14 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 13: מכשיר העירוי הישיר לצמחים. קובץ STL. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 14: התבנית ששימשה ליצירת התבנית לטבעת הפלסטיזול . קובץ STL. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
כדי שהתקן ה- DPI ייחשב לשיטה בת קיימא להעברת תרכובות אקסוגניות לצמחים, עליו לתרום לספיגת תרכובת חזקה ועקבית למגוון סוגי רקמות. הניסוי באמצעות CFDA הראה בבירור הן את תנועת התרכובת האקרופטלית והן את תנועת התרכובת הבזיפטלית, כמו גם במערכת כלי הדם ובתאי מזופיל של העלה. בנוסף, וככל הנראה מכיוון שהחור המשועמם המשמש במכשיר DPI זה מספק כמות גדולה של שטח פנים לספיגת תרכובות, CFDA היה נוכח בכמויות שוות יחסית בכל חלקי הגבעול, ולא רק בתת-קבוצה קטנה של כלי הדם הסמוכים למכשיר, כפי שנראה במחקרי ספיגת צבע קודמים בצמחים באמצעות הזרקת גזע6. בנוסף, נבדקה אספקת חלבון פלואורסצנטי ירוק וצבע פרחוני באמצעות מכשיר DPI, ונצפתה התפלגות של תרכובות אלה בדומה ל- CFDA (הנתונים אינם מוצגים). נתונים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש במכשיר כדי לספק באופן שיטתי מגוון תרכובות המשתנות בגודל ובמבנה המולקולרי. עם זאת, ראוי לציין כי היו הבדלים בספיגת התרכובת בהתבסס על שלב התפתחות העלים, כאשר עלים מתפתחים צעירים יותר תופסים יותר תרכובת מאשר עלים מבוססים מבוגרים יותר. זה יכול להיות בגלל השינויים בתכונות כלי הדם הקיימים ברקמת הכיור לעומת רקמת המקור ויש להתאים אותם לניסוי נתון.
מכשיר ה- DPI הראה ספיגה מספקת של תרכובת להדמיה של CFDA, GFP וצבע פרחים, והוא גם לקח מספיק כדי להראות את ההשפעות האנטיבקטריאליות וקוטלי החרקים של סטרפטומיצין ואימידקלופריד, בהתאמה. שתי תרכובות אלה הביאו לשינויים בכדאיות אורגניזם המטרה שבוע לאחר טיפול יחיד של 2.0 מ"ל. נתונים אלה מצביעים על כך שמכשיר ה- DPI יכול לשמש בבדיקות צמחים שלמים כדי לבדוק את הכדאיות של מגוון רחב של תרכובות להדברת מזיקים מיקרוביאליים וחרקים. יתר על כן, בשל המגע הישיר שלו עם מערכת כלי הדם, מכשיר זה עשוי אפילו לספק הזדמנות לבדוק תרכובות שאינן נלקחות ביעילות על ידי השורשים או תאי האפידרמיס. עניין מיוחד יהיה RNA interference (RNAi), שכן זה יכול לשמש כדי לווסת את ביטוי הגן בתוך הצמח המארח, פתוגן, או וקטור פתוגן. מחקרים קודמים שהכניסו רנ"א סיכות שיער דרך חור קדוח בגזע של צמחי תפוח וענבים הראו כי מולקולות הרנ"א היו מוגבלות לרקמת הקסילם, מה שמרמז על כך שמולקולות אלה עשויות להיות יעילות רק נגד אורגניזמים הניזונים מלשד לעיסה וקסילם22. בהתחשב בכך שמכשיר ה- DPI משתמש במערכת העברת חורים קדוחים דומה, סביר להניח כי RNA סיכת שיער המועבר עם מכשיר זה עשוי להיות מוגבל גם לרקמת הקסילם. עם זאת, הירידה שנצפתה בטיטר של CLas מוגבל פלואם לאחר טיפול סטרפטומיצין ממכשיר DPI מצביע מאוד על כך שאנטיביוטיקה זו הייתה נוכחת בפלואם. לכן, סביר להניח שפיזור כלי הדם של התרכובות המועברות באמצעות מכשיר ה- DPI תלוי בגודל ובכימיה שלהן, ויש להעריך כל מולקולה על בסיס אישי.
למרות שישנם מספר התקני DPI זמינים מסחרית הזמינים בשוק, המכשיר המתואר כאן יכול להיות מיוצר בבית וניתן לשינוי. בדרך זו, שיפורים ושינויים בגודל עשויים להתבצע על בסיס מיני הצמחים ועיצוב הניסוי בשימוש, והוא אינו מסתמך על מוצרים מסחריים. בנוסף, המכשיר מחובר באופן חצי קבוע לצמח, כלומר ניתן לבצע טיפולים מרובים בתרכובת נתונה במקביל ללא צורך לפצוע מחדש את הצמח בהזרקות מורכבות מרובות. בהערת אזהרה, המכשיר עלול לדלוף אם אינו מותקן כראוי. כתוצאה מכך, התרכובת אובדת לסביבה במקום להיות מועברת לצמח. לכן, יש להקפיד לבדוק את המכשיר לאיתור סימני דליפה במהלך ההתקנה ובימים הראשונים שלאחריה. למרות שקידוח חור בעץ עלול להזיק, שיטה זו נבחרה כדי להבטיח ספיגה חזקה ועקבית של התרכובת. בנוסף, לא נצפו השפעות שליליות על בריאות הצמח מחיבור מכשיר ה- DPI בניסויים אלה. עם זאת, צמחים נוספים צריכים להיכלל בתכנון הניסוי כדי להחליף את אלה שעלולים לאבד מרץ במהלך ניסוי נתון. לבסוף, מאחר שמכשיר זה משתמש בזרימה פסיבית כדי להציג תרכובות, קשה לחזות את קצב הספיגה של מיני צמחים שונים או שלבי התפתחות של אותו מין. זה עלול לסבך ניסויים אם מהירות ספיגת התרכובת היא גורם מגביל. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, ניסויים צריכים להיות מתוכננים כך מספיק זמן מסופק עבור הצמח לספוג באופן מלא את 2.5 מ"ל של תרכובת, אשר יכול להימשך עד 1 שבוע. לסיכום, מכשיר DPI זה הוא כלי יעיל להערכה מהירה של פעילות בצמח של תרכובות אנטי-מיקרוביאליות או קוטלי חרקים כנגד CLas והווקטור שלו, D. citri, ובכך מספק מידע רב יותר על היעילות המערכתית וההשפעה על ביצועי הצמח מאשר בדיקת העלה המנותק23 שהוצגה קודם לכן. אין ספק, מגוון היישומים עבור מערכת זו מגיע הרבה מעבר לשימושים הספציפיים המתוארים במחקר זה.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים. השימוש בשמות מסחריים, חברות או תאגידים בפרסום זה הוא לידיעת הקורא ולנוחיותו. שימוש כזה אינו מהווה אישור רשמי או אישור של משרד החקלאות של ארצות הברית או של שירות המחקר החקלאי של כל מוצר או שירות, למעט אחרים שעשויים להתאים. משרד החקלאות של ארה"ב (USDA) אוסר על אפליה בכל התוכניות והפעילויות שלו על בסיס גזע, צבע, מוצא לאומי, גיל, מוגבלות, והיכן שרלוונטי, מין, מצב משפחתי, מצב משפחתי, מצב הורי, דת, נטייה מינית, מידע גנטי, אמונות פוליטיות, נקמה, או משום שהכנסתו של אדם, כולה או חלקה, נובעת מכל תוכנית סיוע ציבורית. לא כל הבסיסים האסורים חלים על כל התוכניות. אנשים עם מוגבלויות הזקוקים לאמצעים חלופיים להעברת מידע על התוכנית (ברייל, אותיות גדולות, קלטת שמע וכו') מתבקשים לפנות למרכז TARGET של משרד החקלאות האמריקאי בטלפון (202) 720-2600 (קול ו-TDD). כדי להגיש תלונה על אפליה, כתוב למשרד החקלאות האמריקאי, מנהל המשרד לזכויות האזרח, 1400 Independence Avenue, S.W., Washington, D.C. 20250-9410, או התקשר (800) 795-3272 (קול) או (202) 720-6382 (TDD). משרד החקלאות האמריקאי הוא ספק הזדמנות שווה ומעסיק.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות למנט אקון על הצמחים ששימשו במחקר זה. המימון ניתן על ידי פרויקט CRIS 8062-22410-007-000-D של משרד החקלאות האמריקאי (USDA) ומענק NIFA של USDA 2020-70029-33176.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
| 20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
| 2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
| 3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
| 3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
| 3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
| 3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
| 5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
| 5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
| 96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
| Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
| Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
| Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
| Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
| Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
| Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
| Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
| Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
| Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
| NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
| Parafilm | Bemis | HS234526A | |
| Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
| qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
| Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
| Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
| Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
| Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
| Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
| White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
| White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |
References
- Hu, J., Wang, N. Evaluation of the spatiotemporal dynamics of oxytetracycline and its control effect against citrus huanglongbing via trunk injection. Phytopathology. 106 (12), 1495-1503 (2016).
- Bendix, C., Lewis, J. D. The enemy within: Phloem-limited pathogens. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 238-254 (2018).
- Keshavareddy, G., Kumar, A. R. V., Ramu, V. S. Methods of plant transformation- A review. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (7), 2656-2668 (2018).
- Qaim, M. Role of new plant breeding technologies for food security and sustainable agricultural development. Applied Economics Perspectives and Policy. 42 (2), 129-150 (2020).
- Siegrist, M., Hartmann, C. Consumer acceptance of novel food technologies. Nature Food. 1 (6), 343-350 (2020).
- Larson, D. W., Doubt, J., Matthes-Sears, U. Radially sectored hydraulic pathways in the xylem of Thuja occidentalis as revealed by the use of dyes. International Journal of Plant Sciences. 155 (5), 569-582 (1994).
- Mehdi, R., et al. Symplasmic phloem unloading and radial post-phloem transport via vascular rays in tuberous roots of Manihot esculenta. Journal of Experimental Botany. 70 (20), 5559-5573 (2019).
- Miller, G. S., Parente, R. M., Santra, S., Gesquiere, A. J. Tracking of fluorescent antibiotic conjugate in planta utilizing fluorescence lifetime imaging. Planta. 253 (2), (2021).
- Treydte, K., Lehmann, M. M., Wyczesany, T., Pfautsch, S. Radial and axial water movement in adult trees recorded by stable isotope tracing. Tree Physiology. 41 (12), 2248-2261 (2021).
- Nie, P. Liping Hu, Haiyan Zhang, Jixiang Zhang, Zhenxian Zhang, Lingyun Zhang, The predominance of the apoplasmic phloem-unloading pathway is interrupted by a symplasmic pathway during Chinese jujube fruit development. Plant and Cell Physiology. 51 (6), 1007-1018 (2010).
- Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. Shootward movement of CFDA tracer loaded in the bottom sink tissues of Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59606 (2019).
- Liu, H., Si, C., Shi, C., Wang, S. Zhe Sun, Yanxi Shi, from apoplasmic to symplasmic phloem unloading during storage roots formation and bulking of sweet potato. Crop Science. 59 (2), 675-683 (2019).
- Erdos, T., Ullmann, A. Effect of streptomycin on the incorporation of amino-acids labeled with carbon-14 into ribonucleic acid and protein in a cell-free system of a Mycobacterium. Nature. 183 (4661), 618-619 (1959).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Motaung, T. E. Chloronicotinyl insecticide imidacloprid: Agricultural relevance, pitfalls and emerging opportunities. Crop Protection. 131, 105097 (2020).
- Berger, C., Laurent, F. Trunk injection of plant protection products to protect trees from pests and diseases. Crop Protection. 124, 104831 (2019).
- Archer, L., Crane, J. H., Albrecht, U. Trunk injection as a tool to deliver plant protection materials-An overview of basic principles and practical considerations. Horticulturae. 6 (6), 552 (2022).
- Wise, J. C., et al. Trunk injection: A discriminating delivering system for horticulture crop IPM. Entomology, Ornithology & Herpetology: Current Research. 03 (2), (2014).
- Ammar, E. D., George, J., Sturgeon, K., Stelinski, L. L., Shatters, R. G. Asian citrus psyllid adults inoculate Huanglongbing bacterium more efficiently than nymphs when this bacterium is acquired by early instar nymphs. Scientific Reports. 10 (1), 18244 (2020).
- Stover, E., Mccollum, G., Ramos, J., Shatters, R. G. Growth, health and Liberibacter asiaticus titer in diverse citrus scions on mandarin versus trifoliate hybrid rootstocks in a field planting with severe Huanglongbing. Proceedings of the Florida State Horticultural Society. 127, 53-59 (2014).
- Akaike, H. A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control. 19 (6), 716-723 (1974).
- Dalakouras, A., Jarausch, W., Buchholz, G., Bassler, A., Braun, M., Manthey, T., Krczal, G., Wassenegger, M. Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woods and herbaceous plants by trunk injection and petiole absorption. Frontiers in Plant Science. 9, 1253 (2018).
- Ammar, E. D., Walter, A. J., Hall, D. G. New excised-leaf assay method to test inoculativity of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) with Candidatus Liberibacter asiaticus associated with citrus Huanglongbing disease. Journal of Economic Entomology. 106 (1), 25-35 (2013).
