Summary
この原稿は、黄龍峰柑橘類病に関連する細菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)またはその昆虫ベクター(Diaphorina citri、Kuwayama)に対する分子の有効性をスクリーニングするための新しい直接植物注入装置について説明しています。
Abstract
植物における治療用化合物の機能をテストすることは、農業研究の重要な要素です。葉面および土壌浸しの方法は日常的ですが、さまざまな取り込みやテストされた分子の環境破壊などの欠点があります。木の幹注入は十分に確立されていますが、このためのほとんどの方法は高価な独自の機器を必要とします。黄龍峰の様々な治療法をスクリーニングするためには、師部限定細菌 Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas)に感染した、または師部摂食CLas昆虫 ベクターDiaphorina citri Kuwayama(D. citri)に感染した小さな温室栽培の柑橘類の血管組織にこれらの化合物を送達するための簡単で低コストな方法が必要です。
これらのスクリーニング要件を満たすために、植物の幹に接続する直接植物注入(DPI)装置が設計されました。このデバイスは、ナイロンベースの3D印刷システムと簡単に入手できる補助コンポーネントを使用して作られています。この装置の化合物取り込み有効性を、蛍光マーカー5,6−カルボキシフルオレセイン−ジアセテートを用いて柑橘類植物において試験した。植物全体にわたるマーカーの均一な化合物分布が日常的に観察された。
さらに、この装置は、抗菌分子と殺虫分子を送達するために使用され、それぞれCLasおよび D.citri に対するそれらの効果を測定しました。アミノグリコシド系抗生物質ストレプトマイシンは、この装置を使用してCLasに感染した柑橘類植物に送達され、その結果、処理後2週間から4週間にCLas力価が低下しました。ネオニコチノイド系殺虫剤イミダクロプリドを D. citriが蔓延した柑橘類植物に送達すると、7日後にオオバコの死亡率が大幅に増加しました。.これらの結果は、このDPIデバイスが、試験のために植物に分子を送達するための有用なシステムを表し、研究およびスクリーニング目的を容易にすることを示唆している。
Introduction
商業および景観環境での植物の管理では、植物の成長と健康を最適化するために化合物の使用が必要になることがよくあります。これらの分子がどのように送達されるかは、分子の種類、分子の機能、植物の種類、および実施されている管理システムによって異なります。葉面散布と土壌施用が最も簡単な送達戦略ですが、一部の分子の取り込みには制限があるため、直接送達が必要です。これらの分子の例は、植物内で全身的に移動するときに最もよく機能するが、単純な局所適用では効果的に送達できない治療分子です1。これは、柑橘類の緑化病とも呼ばれる黄龍峰(HLB)の場合です。HLBは師部限定菌である カンディダトゥス ・リベリバクター・アジアティカス(CLas)(植物外では培養できない)やその昆虫媒介動物である桑山ディア フォリナ (D. citri)2に関連する病気です。
推定治療分子が遺伝子産物である場合、それらはこれらの化合物を発現するトランスジェニック植物を作成することによって試験することができる。しかし、トランスジェニック植物の生産は時間と資源を大量に消費する可能性があり、遺伝子型に大きく依存し、遺伝子サイレンシングによって阻害される可能性があります3。さらに、これらのトランスジェニックが有望な結果を示したとしても、規制および一般の認識の制約により、商業的に受け入れられる可能性が低下します4,5。しかし、化合物の外因性適用は、安定または一過性発現のトランスジェニック植物の生産を必要としないため、生物学的および合成分子の試験を簡素化し、分子の効果を試験するための時間とリソースを削減します。外因性化合物の効果的かつ効率的な全身性植物送達のための方法は、多種多様な研究およびスクリーニング目的に使用することができる。
これらのアプリケーションの1つは、植物の血管系内の全身分子の動きの分析であり、蛍光、可視、または固有の化学同位体であるかどうかにかかわらず、追跡可能なマーカーを使用して行うことができます6,7,8,9。一般的に使用される蛍光マーカーの1つは5,6-カルボキシフルオレセインジアセテート(CFDA)であり、これは膜透過性の色素であり、細胞内エステラーゼによって5,6-カルボキシフルオレセイン(CF)に分解され、その後蛍光および膜不透過性になります10。CFDAは、師部輸送、シンクとソースの関係、および植物組織における血管系のパターン形成を監視するために広く使用されています11,12。
これらのマーカーに加えて、特定の化合物は植物の生理機能を直接変化させて生産性を高めたり、除草剤の場合は植物を殺したりする可能性があります。殺虫剤および抗菌化合物はどちらも、特にHLBの存在下で、植物の生産性を高める手段である。CLasを制御するために使用される抗菌分子の例は、ストレプトマイシンである。ストレプトマイシンは、もともと ストレプトマイセス・グリセウス から単離されたアミノグリコシド系抗生物質であり、タンパク質生合成の阻害を通じて細菌の増殖を阻害することが示されています13。殺虫剤に関しては、HLB研究の主な標的は、CLasを樹木から樹木に伝達する D.シトリです14。この目的のために、イミダクロプリドなどのネオニコチノイドは、害虫を防除するためのゴールドスタンダードであるため、一般的に利用されています15。これらの多様な用途はすべて、現在のプラント管理戦略の重要な側面であり、新規製品の開発は効率的なスクリーニングアッセイに依存しています。
木本植物への化合物の導入に使用される1つの方法は、幹への直接注入である。事前に掘削された注入サイトのニーズが異なるさまざまなシステムが設計されており、これらのシステムは圧力ベースの注入またはパッシブフローのいずれかを利用します16。圧力ベースのシステムは所与の化合物の迅速な導入を可能にするが、閉塞または塞栓された血管系を通して液体を強制することによって引き起こされる潜在的な物理的損傷は考慮される必要がある17。化合物の葉面散布またはびしょ濡れ施用は実施するのにそれほど時間がかからないが、直接植物注入は、空気または土壌への損失による目的の化合物の無駄を減少させ、また、外部環境への曝露を減少させることによって化合物が活性状態にある時間を長くすることができる18。これらの側面は両方とも、高価な試薬を保存し、研究環境で反復間の一貫性を確保するために重要です。
この研究では、目的の化合物が宿主植物にどのように影響するかを評価するために使用できる革新的な直接植物注入(DPI)デバイスの設計、構築、および使用について説明します。標準の3Dプリンターを使用して、デバイス自体とその構造に関連するいくつかのコンポーネントの両方を製造しました。この社内構築方法により、研究者は特定の実験ニーズに基づいてデバイスとデバイスコンポーネントを変更することができ、市販の植物注入デバイスへの依存を減らすことができます。デバイスのセットアップはシンプルで効率的であり、すべての補助コンポーネントはすぐに入手でき、安価です。このシステムはさまざまな植物種で使用するように設計されていますが、ここで紹介する例は鉢植えの柑橘類に関するものです。さらに、この研究は、このデバイスが致死性を引き起こすことなく、若い柑橘類植物に複数の種類の化合物を全身的に効率的に送達できることを示しています。テストされた化合物には、植物内の化合物分布を評価するために使用されたCFDA、およびDPI を介して 送達されたときにこれらの化合物の抗菌効果と殺虫効果が観察されることを確認するために使用されたストレプトマイシンとイミダクロプリドが含まれていました。
Protocol
1. 実験用化合物注入用カンキツ植物の生産
- 根付いた栄養挿し木または種子のいずれかから小さな鉢植えの柑橘類の木を繁殖させます。鉢植えの柑橘類のラインを16時間/ 8時間の明暗日の長さで28°Cで育てます。
- 実験に適したサイズの柑橘類の植物を選択してください。記載された用途では、植物の高さは12cm〜100cm、幹の直径は4〜14mmである必要がありました。新しいフラッシュ成長が必要な場合は、実験の前に植物を切り落とします。
2. DPIデバイスと金型コンポーネントの3次元印刷
- ポリ酢酸ビニルベースの接着剤の薄層をプリントベッドに塗布します。
- ナイロンフィラメントを3Dプリンターにロードし、製造元の指示に従ってプリンターを準備します。目的の .STLファイル(補足ファイル1、補足ファイル2、補足ファイル3、補足ファイル4、補足ファイル5、補足ファイル6、補足ファイル7、補足ファイル8、補足ファイル9、補足ファイル10、補足ファイル11、補足ファイル12、補足ファイル13、補足ファイル14)を設定し、印刷を開始します。
- プリントベッドからピースを取り出します。印刷されたコンポーネントのベースからポリ酢酸ビニルベースの接着剤を水で洗い流し、サポート構造をすべて取り除きます。
- DPIコンポーネントに透明な光沢スプレー塗料を2回スプレーします。
3. プラスチゾルリングモールドの製作
- ベースにスナップされたプラスチックブロックを使用して長方形のエンクロージャを構築することにより、パターンピースを保持するのに十分な大きさの金型フォームを組み立てます(補足図S1A)。
- RTVシリコーンモノマーと触媒を10:1の比率で混合し、気泡を導入せずに1分間攪拌します。食品着色料(3滴/ 25 mLのシリコーン混合物)とハンドソープ(石鹸1 mL/ 25 mLのシリコーン混合物)を追加して着色します(補足図S1B)。
- 底を完全に覆うのに十分なシリコーンの薄層を型の形に注ぎます。タンピングして表面を平らにし、シリコンが固まるまで24時間待ちます(補足図S1C)。
- 上記のように、パターン上の中央の穴コアプリントを覆うのに十分な深さのシリコーンの第2の層を注ぎます( 補足図S1Dのパターンの上部に表示されます)。中央の穴のコアプリントを下に向けて、パターンを液体シリコンに挿入します。気泡が閉じ込められていないこと、パターンが十分に分離されていて接触していないことを確認してください(補足図S1E)。
- 重いものやテープでパターンを固定して、固まっている間にシリコンから浮き出さないようにします。新しく注がれたレイヤーが固まるまで24時間待ちます(補足図S1F)。
- レベルがパターンの上部と同じ高さになるまで、シリコンの追加層を注ぎます。治癒するまで24時間待ちます(補足図S1G)。
- スナップ一体プラスチックブロックを分解して、金型を解放します。パターンを削除します(補足図S1H)。金型に裂け目や変形がないか調べます(補足図S1I)。
4.プラスチゾルリングの鋳造
- 金型の内部、すべてのコアコンポーネント、およびOリングを食用油でコーティングします(補足図S2A、B)。センターポストコアの中央にある切り欠きの周りにOリングを配置し、プラスチゾルリングモールドの中央の穴にコアを配置します(補足図S2C)。
- 送達チャネルコアをプラスチゾルリングモールドの側面の穴に挿入します。配信チャネルコアの端にあるV字型の先端を、センターポストコアのOリングに合わせるように向けます(補足図S2D、E)。
- プラスチゾルを電子レンジで10秒間短時間加熱します(補足図S2F、G)。泡を避けるためにプラスチゾルを穏やかにかき混ぜます(補足図S2H)。溶液が160°Cと170°Cの間の温度に達するまで加熱攪拌を繰り返す(補足図S2I)。
注意: プラスチゾルを過熱すると、有毒ガスが放出される可能性があります。換気の良い場所またはドラフトで手順を実行してください。プラスチゾルを170°C以上に加熱しないでください。 - 溶融プラスチゾルを気泡を導入せずに金型の外縁近くのプラスチゾルリング型に流し込む(補足図S2J)。プラスチゾルリングが冷えるまで1時間待ちます(補足図S2K)。金型からリングを取り外します。実験アッセイで使用する前に、DPIデバイスとの適切な適合を確認してください(補足図S2L)。
5.DPIデバイスのプラントへの取り付け
- デバイス接続用のトランク上のスムーズで正常なサイトを見つけます。バンプや結び目はデバイスの漏れの原因となる可能性があるため、避けてください。
- 直径2mmのドリルビットを使用して、ステムの中心を胴体の表面に対して90°の角度で水平に穴を開けます(補足図S3A)。ドリルビットを穴に数回通して清掃および滑らかにし、遮るもののない穴を作成します(補足図S3B)。
- 化合物送達チャネルの反対側のプラスチゾルリングに垂直スライスを作成します(補足図S3C)。リングをプラントの周りに取り付け、以前に開けた穴にデリバリーチャネルを合わせます(補足図S3D)。
注意: 漏れを防ぐために、リングはトランクにぴったりとフィットする必要があります。さまざまな直径のコアアセンブリを使用して、さまざまなサイズの植物茎用のプラスチゾルリングを作成できます。 - DPIデバイスをプラスチゾルリングに追加し、ぴったりと収まるようにします。DPIデバイスの注ぎ口をプラスチゾルリング配信チャネルとドリルで開けた穴に合わせます(補足図S3E)。
注意: ドリルビットを使用して穴とDPIデバイスの注ぎ口を揃えると役立つ場合があります。 - シリコンテープでしっかりと包み、装置を所定の位置に保持します(補足図S3F)。完全に組み立てられ、取り付けられたデバイスを検査して、プラントの適切な位置合わせと向きを確認します。
6.DPIデバイスを使用して目的の化合物を適用する
- シリンジまたはピペットを使用して、DPIデバイスに目的の溶液を充填します(補足図S3G)。シリンジを使用してDPIデバイスの反対側にあるシリコンテープとプラスチゾルリングを貫通し、内部チャネルから空気を引き出し、植物の血管系への気泡の導入を防ぎます(補足図S3H)。抽出したコンパウンドをDPIデバイスに交換します。
- シリンジによって作成された穴の上にシリコンテープの小さなパッチを追加して、領域を補強し、裂け目を防ぎます。取り付けポイントで目に見える漏れがないか装置を検査し、装置リザーバーに安定した液面がないか検査します。
注意: 水は、テスト溶液の無駄を避けるために、漏れをテストするために最初に使用できます。 - DPIデバイスの開放端をワックスシーリングフィルムで覆い、引き下げてシールを形成し、実験化合物の蒸発を減らします。真空の発生を防ぐためにシリンジチップでワックスフィルムに単一の穴を突いて、その後デバイスを補充します(補足図S3I)。
- 装置を毎日チェックして、コンポーネントの適切な位置合わせを確認し(補足図S3J)、リザーバーが乾くのを防ぐためにシリンジを使用して液体を補充します。所望の量の実験溶液が導入されるまで、このプロセスを繰り返します。
注:化合物は、特定のデバイスから最大1か月間正常に導入できます。この時間枠を超える溶液の取り込み期間は、実験のセットアップの前に経験的にテストする必要があります。
7. CFDAを用いた柑橘類の血管の動き観察
- DPIデバイスを高さ25cmのシトロン(シトラスメディカL.)植物に取り付け、H2OコントロールまたはCFDAの20%DMSOのいずれかの2.0mL処理をDPIデバイスに1回適用し、24時間取り込みます。このプロトコルに従うには、400 μLのCFDAストック溶液(ストック溶液には100%ジメチルスルホキシド[DMSO]に溶解した10 mM CFDAが含まれています)に1.6 mLのH2Oを加えて作業CFDA溶液を調製し、2 mMおよび20%DMSOの最終CFDA濃度を生成します。
- 植物のさまざまな組織の断面を作成し、498 nmの波長を含む蛍光フィルターを備えたステレオスコープまたは複合顕微鏡を使用して、植物組織のCFDAを視覚化します。画像をH2Oコントロールの20%DMSOと比較して、組織内の自家蛍光を説明します。
8. ストレプトマイシン処理後の葉サンプル中のCLas力価の変化の測定
- 高さ0.75mの温室栽培CLas感染バレンシア(Citrus sinensis (L.)オスベック「バレンシア」)植物を使用し、各植物から2つのHLB症状の葉柄と中肋骨を収集し、それらを小さな切片に切り刻み、各組織タイプをプールし、直径6.35mmの鋼球を含む2mLの耐衝撃性サンプルチューブに別々に保管します。
- 3.4 m/sで2つの15秒サイクルにプログラムされたホモジナイザーを使用してサンプルを粉砕します。前述のように全核酸を抽出する19。
- 表 1 に定義されているqPCRミックスと 表2に定義されている反応条件を使用して、CLas感染葉サンプルに対してqPCRを実行します。さらなる分析のために、頑健なCLas感染を示す植物(頑健な感染は一般に、CLas 16S LasLong(LL)プライマーセットのqPCRベースのCt値<30として定義されます)を使用してください。
注:細菌力価は、CLas 16S Las Long(LL)および柑橘類デヒドリンDNAプライマーを使用して推定され、前述のように相対ゲノム等価を推定します20。 - 上記で概説した最小感染力価を満たす柑橘類の植物にDPIデバイスを装着し、所望の濃度のH2O溶液またはストレプトマイシン溶液のいずれかを2.0mLの1回限りの処理にかけます。この研究に従うには、H2Oに溶解した9.5 mg / mL(合計19 mg)のストレプトマイシンの2.0 mLの単回処理を使用します。
- 処理後7日、14日、および28日後に葉のサンプルを収集します。サンプリングした葉を上記と同じプロトコルを用いてCLas力価についてアッセイする。
- 処理後60日目に、H2Oまたはストレプトマイシンで処理した植物の写真を取得します。CLas感染の目視観察を使用して、感染の重症度をスコアリングします。軽度の感染の兆候として葉フラッシュの成長とともに静脈間クロロシスと静脈コルキングを示す葉の<50%、およびより重度の感染症の兆候として、静脈間クロロシスと静脈コルキング、葉の脱落と植物の成長の阻害を示す葉の50%以上を探します。
9.イミダクロプリド治療後のD.シトリ の死亡率の測定
- 高さ0.5mのシトロン(シトラスメディカ L.)植物を12cmの高さに剪定して、新しいフラッシュの成長を促進します。
注:フラッシュ成長の速度は、植物の健康状態と時期に依存する可能性があります。したがって、実験計画ではこれを考慮に入れてください。 - 長さ1〜2cmの>6フラッシュが発育した後、成虫の D. citri を含むケージに植物を導入する。卵の堆積を可能にするために、植物をケージに24時間放置します。
- 産卵後1〜2日で3つのフラッシュシュートで代表的な卵数を行い、その後DPIデバイスを適用します。これらのデバイスに、2.0 mLの水制御または希望濃度のイミダクロプリド(21.8%有効成分)を満たします。.このプロトコルに従うには、528 μL/L、52.8 μL/L、および5.28 μL/Lのイミダクロプリドを使用します。
注:卵数は破壊的な尺度であるため、この段階でのカウントは、同じ植物のカウントされていないフラッシュの卵の数を推定し、実験の最後に行われるその後のニンフの出現カウントのベースラインを提供するために使用されます。 - 残りのフラッシュシュートのうち少なくとも3つで D.シトリ の出現率を収集します。化合物導入後7日目に代表的な植物写真を入手。
Representative Results
直接注入装置コンポーネント
直接注入装置の基本バージョンは、前面と側面の高さ8 cm、幅3.3 cmです(図1A)。注ぎ口に隣接する単一の中央リザーバーが含まれており、これらのコンポーネントに含めることができる総容量は2.0mLです(図1D)。プラスチゾルリングの高さは1.8 cm、直径は2.7 cmです(図1C)。このリングには、DPIデバイスの注ぎ口に対応するチャンネルと、処理される木の幹の周りに収まる可変直径のチャンネルの2つのチャンネルも含まれています。さらに、垂直チャネルの周りに溝があり、過剰な処理を木を囲むように指示するため、樹皮からの追加の化合物の取り込みが可能になります(図1F)。適切に組み立てられたら、プラスチゾルリングがDPIデバイスと同じ高さになり、注ぎ口がツリーに開けられた穴と揃う必要があります(図1Bおよび図1E)。
ティッカー
柑橘類植物に外因性化学物質を導入するためのDPIデバイスの有効性を調べるために、デバイスを使用して2.0 mLの2 mM CFDAを浸潤させました。処理された植物の血管系では蛍光シグナルが検出されましたが(図2A)、H2O中の20%DMSOで処理された対照植物では存在しませんでした(図2B)。このシグナルは、葉肉、葉柄血管系、茎血管系、および根血管系を含む、解剖されたすべての植物組織タイプで観察されました(図2C)。このシグナルは、処理後24時間以内に植物で観察され、組織全体に比較的均等に分布していました。
ストレプトマイシン
導入化合物がHLB病に治療効果を有するかどうかを試験するために、2.0mLの殺菌性化合物であるストレプトマイシンをCLas陽性バレンシア(シトラスシネンシス)スイートオレンジ植物に9.5 mg / mLの濃度(合計19 mg)で導入しました。これらの植物を温室ポットで維持し、CLas力価(柑橘類ゲノム当量当たりCLasゲノム当量で測定)をqPCRを用いて経時的にモニターした(図3A)。ストレプトマイシンおよびH2O処理植物の初期平均DNA CLas力価は、それぞれ0.562 CLasゲノム/柑橘類ゲノムおよび0.49 CLasゲノム/柑橘類ゲノムであった。平均細菌力価の低下は、同じ時点でH2O対照と比較した場合、ストレプトマイシン処理の7〜28日後にqPCRによって検出された。また、時間0と28日目の平均細菌力価との差は、ストレプトマイシン処理植物およびH2O処理植物でそれぞれ0.314および0.117であった。
この実験は、さまざまな期間にわたるさまざまな処理に対する植物の反応を測定するように設計されました。2因子二次応答曲面計画を用い、時間は4つの水準(0日、7日、14日、および28日)の量的離散因子として扱われ、2つの水準(H2Oおよびストレプトマイシン)を有するカテゴリー因子として扱われた。8つの治療の組み合わせのそれぞれに5回の反復を使用し、CLas力価を応答変数として測定しました。データは、Box-Coxプロット分析に基づいてlog10を使用して変換されました。赤池の情報量規準(AICc)21を用いた前方選択によりモデル削減を行い、時間効果と交互作用効果の両方を除去した。残りの因子である処理は有意であり(p = 0.0252)、ストレプトマイシン処理植物は、すべての時点にわたってH2O処理植物(0.496)よりも低い平均CLas力価(0.349)を示した(図3B)。このCLas力価の低下は、ストレプトマイシン19 mg(図3D)に対してH2Oで処理された代表的な樹木の写真(図3C)によって証明されるように、ストレプトマイシン処理植物の60日後に新しい健康なフラッシュ成長の時折の増加に対応していました。
イミダクロプリド
イミダクロプリドは、DPIデバイスを使用してアジアの柑橘類の幼若オオバコ(ACP)に感染した柚子植物に導入され、D.citri殺虫スクリーニングアッセイとしての可能性をテストしました。市販のイミダクロプリド殺虫剤溶液の単回2.0 mL処理を、水制御とともに3つの異なる濃度(5.28 μL / L、52.8 μL / L、および528 μL / L)でテストしました。処理前の3回のフラッシュシュートあたりの平均総卵数は280.5〜321の範囲であり、各処理グループに使用する植物間に有意差はありませんでした(図4A)。処理後7日目の3回のフラッシュシュートで生き残ったニンフの平均総数は、水コントロールで293.75、268、97.5、および2、およびイミダクロプリド溶液でそれぞれ5.28 μL / L、52.8 μL / L、および528 μL / Lでした(図4B)。これは、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後分析による水制御と比較した場合、52.8 μL/L(p = 0.029)および528 μL/L(p = 0.002)のイミダクロプリド溶液レベルでのオオバコニンフの出現の有意な減少を表しています。さらに、最高のイミダクロプリド溶液レベルでのオオバコニンフ死亡率のこの増加は、水コントロール(図4C)と比較した場合、イミダクロプリド処理ライン(図4D)でのニンフ甘露産生の減少によって視覚的に明らかでした。
図1:直接植物注入装置およびプラスチゾルリング 。 (A)無傷の直接植物注入装置および(C)プラスチゾルリングをそれらの寸法と共に。(B)柑橘類の木に接続および取り付けられた直接植物注入装置およびプラスチゾルリング。(D)直接植物注入装置の垂直断面、(F)プラスチゾル環、および(E)これら2つの構成要素は、柑橘類の木に接続および取り付けられている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:25cmの柑橘類の葉中央肋骨の断面。 直接植物注入装置を用いて(A)2mM CFDAまたは(B)H2O中の20%DMSOで処理した後の24時間を示す画像。(C)2mM CFDA処理後24時間後の各種植物組織の断面で、植物直接注入装置上5cm上の幹(左上)、植物直接注入装置5cm下の幹(左中)、根(左下)、葉の中肋骨(右上)、葉柄(右中央)、葉葉肉(右下)を含む。スケールバー= 1 mm。略語:CFDA = 5,6-カルボキシフルオレセインジアセテート;DMSO = ジメチルスルホキシド。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:qPCRを使用して経時的にCLas力価(柑橘類ゲノム当量あたりのCLasゲノム当量で測定)をモニタリングします。 (a)19mgのストレプトマイシンで処理した5つの植物とH2Oコントロールで処理した5つの植物を比較したCLas DNA力価の変化を示す経時的変化。ポイントは、特定の時点での特定の治療の平均を表します。エラーバーは平均の標準誤差を表します。(b)全ての時点にわたるH2O-およびストレプトマイシン処理植物の平均CLas力価を示す棒グラフ。エラーバーは95%信頼区間を表し、アスタリスクは一元配置ANOVAによるストレプトマイシン処理植物とH2O処理植物の平均CLas力価の有意差(*=p<0.05)を示します。(C)(C)H2Oまたは(D)ストレプトマイシンのいずれかによる直接植物注入処理の0ヶ月後および2ヶ月後の柑橘類植物の代表画像。ストレプトマイシンで処理された植物は、2か月後に新しい薄緑色の葉のフラッシュ成長を示し、これはCLas力価の低下を示唆しています。略称:CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ACPに寄生した幼若柚子植物のオオバコニンフ死亡率のモニタリング。(A)推定初期卵数および(B)生き残ったD.シトリニンフを、水コントロールおよびイミダクロプリドの様々な希釈液で処理してから7日後に3つの柑橘類フラッシュで示す棒グラフ。エラーバーは平均の標準誤差を表し、アスタリスクは、一元配置分散分析とそれに続くテューキーの事後分析による、特定の処理 レベルと水制御の間の有意差(*= p < 0.05、** = p < 0.01)を示します。(C)水コントロールまたは(D)528μL / Lイミダクロプリドのいずれかで直接植物注入装置を使用して処理してから7日後に、D.シトリニンフが蔓延した柑橘類フラッシュの画像。略語:ACP =アジアの柑橘類のオオバコ;D.シトリ=ダイアフォリナシトリ桑山。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| サンプルあたりの容量(μL) | コンポーネント | |||||
| 12.5 | 2x GoTaq qPCR と BRYT グリーンダイマスターミックス | |||||
| 5 | DNAテンプレート (20 ng/μL) | |||||
| 0.5 | CLas用の10 μMプライマーFおよびR | Clas: CTTACCAGCCTTGACATGTATAGG (Forward); TCCCTATAAAGTCCAACATCTAGGTAAA (リバース) |
||||
| 0.5 | 10 μM シトラスハウスキーピング用プライマー F および R | 柑橘類のデヒドリン:TGAGTACGAGCCGAGTGTTG(フォワード); AAAACTTCACCGATCCACCAG (リバース) |
||||
| 6.5 | H2O | |||||
表1:ストレプトマイシン処理柑橘類株のCLas力価を定量するために使用したqPCRミックス。 CLas DNA定量およびシトラスDNA定量のための16S Las Longプライマーおよびシトラスデヒドリンプライマーの配列を示す。
| 歩 | 気温(°C) | 時間 | |
| 1 | 初期変性 | 95 | 2 ミン |
| 2 | 変性 | 95 | 15秒 |
| 3 | アニーリング | 60 | 20秒 |
| 4 | 延長 | 72 | 20秒 |
| 5 | ステップ2に進み、39回繰り返します | ||
| 6 | メルトカーブ | 0.2°C/sで60から95へのランプ | 3 ミン |
表2:ストレプトマイシン処理柑橘類系統のCLas力価を定量するために使用したqPCRの反応条件。
補足図S1:プラスチゾルリングを生成するための金型の組立工程を示す画像。 (a)スナップ一体プラスチックブロックを用いて、プラスチゾルリングモールドの第1層を生成した。(b)シリコーンRTVゴム、触媒、食品着色料、石鹸を含む均一混合溶液。(c)プラスチゾルリング型の最初の層を均等に流し込みます。(D)プラスチゾルリングパターンの写真で、中央ホールドコアプリントが上部にあります。(e)モールドの未硬化の第2層に挿入されたプラスチゾルリングパターン。(F)マスキングテープとゴム槌を使用して、2番目の層が硬化するときにパターンを固定します。(G)パターンの上部と同じ高さになるまで、金型の3番目の層を追加します。(H)金型からパターンを取り除きます。(I)完全に構築されたプラスチゾルリングモールド。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:直接植物注入装置に関連するプラスチゾル環の組み立て工程を示す画像。 (a)プラスチゾルリングアセンブリ部品、モールド、Oリング付きセンターコア、およびデリバリーチャネルコアを含む。(B)硬化後のプラスチゾルリングの除去を容易にするために、焦げ付き防止スプレー食用油でコアをコーティングします。(C)センターコアとOリングを金型に挿入します。(D)中心コアに垂直な送達チャネルコアの挿入。(E)プラスチゾルリングコアコンポーネントを金型キャビティ内に適切に組み立てます。(f)プラスチゾル環の生成に用いられるプラスチゾル。(g)プラスチゾルを電子レンジで加熱する。(h)加熱後のプラスチゾルを攪拌する。(i)プラスチゾル温度の確認。(j)加熱したプラスチゾルを組み立てたコアに流し込む。(K)組み立てられたコアの周りのプラスチゾルの冷却を可能にします。(L)直接植物注入装置に取り付けられた完全に組み立てられたプラスチゾルリング。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:直接植物注入装置の組立工程を示す画像。 (A)柑橘類植物の中心に穴を開けて、化合物送達用のチャネルを作成します。(B)掘削穴の正面図。(C)化合物送達チャネルの反対側のカミソリ刃でプラスチゾルリングをスライスする。(D)プラスチゾルリングを、以前に開けた穴の部位のステムの周りにしっかりと取り付けます。(e)直接植物注入装置をプラスチゾルリングに取り付け、装置上の化合物送達スピゴットをプラスチゾルリングのチャネルに挿入した状態。(F)シリコーンテープを使用して、直接植物注入装置をプラスチゾルリングに固定し、装置全体を所定の位置に保持する。(g)直接植物注入装置チャンバーに目的の化合物を充填する。(H)シリンジを使用して、プラントのドリル穴から空気を引き出し、コンパウンドの流れを開始します。(i)直接植物注入装置室の開口部にワックスシールフィルムを塗布し、真空を防ぐために穴を突く。(J)柑橘類植物に完全に組み立てられた直接植物注入装置。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:プラスチゾルリングセンターポストコア。4 mm ツリーの STL ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:プラスチゾルリングセンターポストコア。6 mm ツリーの STL ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル3:プラスチゾルリングセンターポストコア。8 mm ツリーの STL ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル4:プラスチゾルリングセンターポストコア。10 mm ツリーの STL ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル5:プラスチゾルリングセンターポストコア。12 mm ツリーの STL ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル6:プラスチゾルリングセンターポストコア。14 mm ツリーの STL ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル7:プラスチゾルリング送達チャネルコア。4 mm ツリーの STL ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル8:プラスチゾルリング送達チャネルコア。6 mm ツリーの STL ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル9:プラスチゾルリング送達チャネルコア。8 mm ツリーの STL ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル10:プラスチゾルリング送達チャネルコア。10 mm ツリーの STL ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル11:プラスチゾルリング送達チャネルコア。12 mm ツリーの STL ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル12:プラスチゾルリング送達チャネルコア。14 mm ツリーの STL ファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル13:直接植物注入装置。STL ファイルにエクスポートします。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 14: プラスチゾルリングの型を作成するために使用されるパターン。STL ファイルにエクスポートします。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
DPIデバイスが植物への外因性化合物送達のための実行可能な方法と見なされるためには、さまざまな組織タイプへの堅牢で一貫した化合物の取り込みに貢献する必要があります。CFDAを用いた実験では、葉の血管系と葉肉細胞の両方で、アクロペータル化合物と担子弁化合物の動きの両方を明確に示しました。さらに、おそらくこのDPIデバイスで使用される穴が化合物の取り込みに大量の表面積を提供するため、CFDAは、トランクインジェクションを使用した植物での以前の色素取り込み研究で見られたように、デバイスに隣接する血管系の小さなサブセットだけでなく、ステムのすべてのセクションに比較的等しい量で存在していました6.さらに、緑色蛍光タンパク質および花色素の送達をDPI装置を用いて試験したところ、CFDAに類似したこれらの化合物の分布が観察された(データ示さず)。これらのデータは、この装置が、サイズおよび分子構造が異なる様々な化合物を全身的に送達するために使用できることを示唆している。ただし、葉の発達段階に基づいて化合物の取り込みに違いがあり、若い発育葉は古い確立された葉よりも多くの化合物を取り込むことは注目に値します。これは、シンク組織とソース組織に存在する血管系特性の変化が原因である可能性があり、特定の実験用に最適化する必要があります。
DPIデバイスは、CFDA、GFP、およびフローラル染料の可視化に十分な化合物の取り込みを示し、ストレプトマイシンとイミダクロプリドの抗菌効果と殺虫効果をそれぞれ示すのに十分な量を占めました。これらの化合物は両方とも、2.0mLの単回処理の1週間後に標的生物の生存率に変化をもたらしました。これらのデータは、DPIデバイスが植物全体のアッセイで使用され、微生物および害虫の防除のための多種多様な化合物の生存率を試験できることを示唆しています。さらに、血管系との直接接触のために、この装置は根または表皮細胞によって効率的に取り込まれない化合物をテストする機会さえ提供するかもしれない。特に興味深いのはRNA干渉(RNAi)であり、これは宿主植物、病原体、または病原体ベクター内の遺伝子発現を調節するために使用できるためです。リンゴとブドウの幹に開けられた穴を通してヘアピンRNAを導入した以前の研究は、RNA分子が木部組織に限定されていることを示し、これらの分子が咀嚼および木部樹液摂食生物に対してのみ有効である可能性があることを示唆しています22。DPIデバイスが同様のドリル穴送達システムを使用することを考えると、この装置で送達されるヘアピンRNAも木部組織に限定される可能性があることは当然のことです。しかし、DPIデバイスからのストレプトマイシン処理後の師部制限CLasの力価の観察された低下は、この抗生物質が師部に存在していたことを強く示唆しています。したがって、DPIデバイスを使用して送達される化合物の血管分布は、それらのサイズおよび化学的性質に依存する可能性が高く、各分子は個別に評価されるべきである。
市販のDPIデバイスは多数市場に出回っていますが、ここで説明するデバイスは社内で製造でき、変更可能です。このように、使用されている植物種や実験計画に基づいてサイズの改良や変更を行うことができ、市販品に依存しません。さらに、この装置は植物に半永久的に取り付けられているため、複数の化合物注入で植物を傷つけることなく、特定の化合物の複数の処理を同時に実行できます。注意点として、正しくインストールされていないとデバイスが漏れる可能性があります。その結果、化合物はプラントに送達されるのではなく、環境に失われます。したがって、セットアップ中およびその後の最初の数日間は、漏れの兆候がないかデバイスを検査するように注意する必要があります。木に穴を開けることは潜在的に有害ですが、この方法は堅牢で一貫した化合物の取り込みを確実にするために選択されました。さらに、これらの実験では、DPIデバイスの取り付けによる植物の健康への悪影響は見られませんでした。ただし、特定の実験の過程で活力を失う可能性のある植物を置き換えるために、追加の植物を実験計画に含める必要があります。最後に、このデバイスはパッシブフローを使用して化合物を導入するため、異なる植物種または同じ種の発生段階にわたる取り込み速度を予測することは困難です。化合物の取り込み速度が制限要因である場合、これは実験を複雑にする可能性があります。最良の結果を得るには、植物が2.5 mLの化合物を完全に吸収するのに十分な時間が提供されるように実験を計画する必要がありますが、これには最大1週間かかる場合があります。結論として、このDPIデバイスは、CLasおよびそのベクターD.citriに対する抗菌性または殺虫性化合物のプランタ内活性を迅速に評価するための有効なツールであり、したがって、以前に提示された分離葉アッセイよりも全身の有効性および植物性能への影響に関するより多くの情報を提供する23。間違いなく、このシステムのさまざまなアプリケーションは、この調査で説明されている特定の用途をはるかに超えています。
Disclosures
著者には利益相反はありません。この出版物での商号、会社名、または企業名の使用は、読者の情報と便宜のためです。このような使用は、米国農務省または農業研究サービスによる、適切な可能性のある他の製品またはサービスを排除するための公式の承認または承認を構成するものではありません。米国農務省(USDA)は、人種、肌の色、出身国、年齢、障害、および該当する場合は性別、婚姻状況、家族状況、親の地位、宗教、性的指向、遺伝情報、政治的信念、報復、または個人の収入の全部または一部が公的支援プログラムから得られているという理由で、すべてのプログラムおよび活動における差別を禁止しています。すべての禁止ベースがすべてのプログラムに適用されるわけではありません。プログラム情報(点字、大活字、オーディオテープなど)の通信に代替手段を必要とする障害者は、USDAのTARGETセンター((202)720-2600(音声およびTDD))に連絡する必要があります。差別の苦情を申し立てるには、USDA、公民権局長、1400インディペンデンスアベニュー、SW、ワシントンDC、20250-9410に手紙を書くか、(800)795-3272(音声)または(202)720-6382(TDD)に電話してください。USDAは機会均等の提供者および雇用者です。
Acknowledgments
著者らは、この研究で使用された植物についてMant Aconに感謝したいと思います。資金は、米国農務省(USDA)のCRISプロジェクト8062-22410-007-000-DおよびUSDA NIFA助成金2020-70029-33176によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
| 20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
| 2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
| 3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
| 3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
| 3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
| 3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
| 5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
| 5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
| 96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
| Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
| Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
| Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
| Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
| Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
| Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
| Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
| Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
| Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
| NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
| Parafilm | Bemis | HS234526A | |
| Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
| qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
| Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
| Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
| Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
| Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
| Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
| White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
| White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |
References
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