Ein effizientes Protokoll für die CUT&amp;RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

Kamar Ghaibour; Joe Rizk; Claudine Ebel; Tao Ye; Muriel Philipps; Valérie Schreiber; Daniel Metzger; Delphine Duteil

doi:10.3791/65215

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Methodenartikel

Ein effizientes Protokoll für die CUT&RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

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DOI:

10.3791/65215

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7. Juli 2023

Kamar Ghaibour^*¹ , Joe Rizk^*¹ , Claudine Ebel¹ , Tao Ye¹ , Muriel Philipps¹ , Valérie Schreiber¹ , Daniel Metzger¹ , Delphine Duteil¹

¹CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaße vorgestellt, das für die Untersuchung der Transkriptionsregulation in Muskelfasern durch Spaltung unter Targets und Freisetzung unter Verwendung von Nuklease (CUT&RUN) geeignet ist.

Zusammenfassung

Genomweite Analysen mit kleinen Zellpopulationen sind eine große Einschränkung für Studien, insbesondere im Stammzellbereich. Diese Arbeit beschreibt ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Isolierung von Satellitenzellen aus dem Gliedmaßenmuskel, einem Gewebe mit einem hohen Gehalt an Strukturproteinen. Die präparierten Gliedmaßenmuskeln von erwachsenen Mäusen wurden mechanisch durch Zerkleinern in Medium, das mit Dispase und Typ-I-Kollagenase ergänzt wurde, gestört. Nach dem Aufschluss wurde das Homogenat durch Zellsiebe filtriert und die Zellen wurden in FACS-Puffer suspendiert. Die Viabilität wurde mit fixierbarer Viabilitätsfärbung bestimmt, und immungefärbte Satellitenzellen wurden mittels FACS isoliert. Die Zellen wurden mit Triton X-100 lysiert und die freigesetzten Zellkerne wurden an Concanavalin-A-Magnetkügelchen gebunden. Die Zellkern-/Bead-Komplexe wurden mit Antikörpern gegen den Transkriptionsfaktor oder die interessierenden Histonmodifikationen inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellkern-/Kügelchenkomplexe mit der Protein-A-Mikrokokken-Nuklease inkubiert und die Chromatinspaltung mit CaCl₂ eingeleitet. Nach der DNA-Extraktion wurden Bibliotheken erstellt und sequenziert, und die Profile für die genomweite Transkriptionsfaktorbindung und kovalente Histonmodifikationen wurden durch bioinformatische Analyse erhalten. Die für die verschiedenen Histonmarkierungen erhaltenen Peaks zeigten, dass die Bindungsereignisse spezifisch für Satellitenzellen waren. Darüber hinaus ergab die Analyse bekannter Motive, dass der Transkriptionsfaktor über sein verwandtes Antwortelement an das Chromatin gebunden ist. Dieses Protokoll wurde daher angepasst, um die Genregulation in Satellitenzellen der Gliedmaßenmuskeln von erwachsenen Mäusen zu untersuchen.

Einleitung

Die quergestreifte Skelettmuskulatur macht durchschnittlich 40 % des Gewichts des gesamten menschlichen Körpers aus¹. Muskelfasern weisen eine bemerkenswerte Fähigkeit zur Regeneration nach Verletzungen auf, die durch die Fusion neu gebildeter Myozyten und die Bildung neuer Myofasern beschrieben wird, die die beschädigten ersetzen². Im Jahr 1961 berichtete Alexander Mauro über eine Population von mononukleären Zellen, die er als Satellitenzellen bezeichnete³. Diese Stammzellen exprimieren den Transkriptionsfaktor Pair Box 7 (PAX7) und befinden sich zwischen der Basallamina und dem Sarkolemma der M....