Ein Verfahren zur Kryosektion von Spinalganglien der Maus

Zusammenfassung

Vorgestellt wird die Entwicklung zur konsequent hochwertigen Erfassung von Kryostatschnitten der Spinalganglien.

Zusammenfassung

Qualitativ hochwertige Kryostatschnitte des Spinalganglions (DRG) der Maus sind entscheidend für eine ordnungsgemäße immunchemische Färbung und RNAscope-Studien bei der Erforschung von entzündlichen und neuropathischen Schmerzen, Juckreiz sowie anderen peripheren neurologischen Erkrankungen. Aufgrund der winzigen Probengröße des DRG-Gewebes bleibt es jedoch eine Herausforderung, konsistent qualitativ hochwertige, intakte und flache Kryostatschnitte auf Glasobjektträgern zu erhalten. Bisher gibt es keinen Artikel, der ein optimales Protokoll für die DRG-Kryosektion beschreibt. Dieses Protokoll stellt eine Schritt-für-Schritt-Methode dar, um die häufig auftretenden Schwierigkeiten im Zusammenhang mit der DRG-Kryosektion zu lösen. Der vorgestellte Artikel erklärt, wie man die umgebende Flüssigkeit aus den DRG-Gewebeproben entfernt, die DRG-Schnitte auf dem Objektträger mit der gleichen Ausrichtung platziert und die Abschnitte auf dem Glasobjektträger abflacht, ohne sich nach oben zu krümmen. Obwohl dieses Protokoll für die Kryosektion der DRG-Proben entwickelt wurde, kann es auch für die Kryosektion vieler anderer Gewebe mit einer kleinen Probengröße angewendet werden.

Einleitung

Das Spinalganglion (DRG) enthält die primären sensorischen Neuronen, die Gewebemakrophagen und die Satellitenzellen, die die primären sensorischen Neuronen umgeben 1,2,3,4. Es ist eine wichtige anatomische Struktur bei der Verarbeitung harmloser und schädlicher Signale und spielt eine entscheidende Rolle bei Schmerzen, Juckreiz und verschiedenen peripheren Nervenerkrankungen 5,6,7,8,9,10,11,12,13.

Protokoll

Für die vorliegende Studie wurden die Tierversuche vom UCSF Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. Hier wurden erwachsene, 8-12 Wochen alte männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (selbst gezüchtet) verwendet.

1. DRG-Probenvorbereitung

1. Betäuben Sie die Mäuse mit 2,5% Avertin (siehe Materialtabelle). Sorgen Sie für eine ausreichende Anästhesie, indem Sie nicht auf schmerzhafte Stimulation reagieren. Die Tiere werden transkardial mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefolg....

Ergebnisse

In der aktuellen Studie wurden etwa 16 kontinuierliche, qualitativ hochwertige DRG-Schnitte von einem L4-DRG der Maus gesammelt. Die erhaltenen Schnitte waren ohne jegliche Verzerrung. Abbildung 1 zeigt die Schritt-für-Schritt-Vorgehensweise für die Kryoschnittung. Die Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit aus den Gewebeschnitten ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Prozess der OCT-Einbettung des Gewebes ist in Abbildung 3 darges.......

Diskussion

Dieses Protokoll bietet ein einfaches Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Kryostat-Sektion des Maus-DRG, um zuverlässig qualitativ hochwertige DRG-Schnitte auf Objektträgern zu erhalten. Dieses Protokoll besteht aus vier kritischen Schritten. Zuerst müssen die DRG-Probe und die Pinzette trocken sein, bevor die DRG-Probe auf das Basis-OCT gelegt wird. Jede Flüssigkeit, die die DRG-Probe umgibt, bildet eine Eishülle um sie herum, was dazu führt, dass sich DRG-Abschnitte vom OCT lösen und nach oben krümmen. Zweitens, wenn.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Avertin	Sigma-Aldrich	T48402-25G	Anästhesietier
Epredia  Kryotom Kryostat Kryokassetten, Ø 25 mm Schraffierte	Fisherbrand	1910	Halten Sie den OCT-Bereich nach unten
Ergo Pinzette	Fisherbrand	S95310	Mit dem Ende einer Pinzette den Boden sanft berühren (6 o' Uhr) des Abschnitts, so dass er an der Plattformoberfläche haftet, um zu verhindern, dass sich der Abschnitt in einer Rolle zurückkrümmt
Fisherbrand  Superfrost Plus Objektträger	Fisherbrand	1255015	Zum Sammeln des DRG-Abschnitts
Markierstifte		Fisherbrand 133794	Markieren Sie die Ausrichtung der Basis
OCT Scigen  Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisherbrand	23730571	Einbettmedium für gefrorene Gewebeproben, um eine optimale Schnitttemperatur (O.C.T.) zu gewährleisten.