Zweistufige tag-freie Isolierung von Mitochondrien für eine verbesserte Proteinentdeckung und -quantifizierung

Summary

Wir präsentieren ein zweistufiges Protokoll für die qualitativ hochwertige Isolierung von Mitochondrien, das mit der Entdeckung und Quantifizierung von Proteinen auf Proteomebene kompatibel ist. Unser Protokoll kommt ohne Gentechnik aus und eignet sich daher für die Untersuchung von Mitochondrien aus allen primären Zellen und Geweben.

Abstract

An den meisten physiologischen und krankheitsbezogenen Prozessen, vom zentralen Stoffwechsel über die Immunantwort bis hin zur Neurodegeneration, sind Mitochondrien beteiligt. Das mitochondriale Proteom besteht aus mehr als 1.000 Proteinen, deren Häufigkeit dynamisch als Reaktion auf äußere Reize oder während des Fortschreitens der Krankheit variieren kann. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung hochwertiger Mitochondrien aus primären Zellen und Geweben. Das zweistufige Verfahren umfasst (1) mechanische Homogenisierung und differentielle Zentrifugation zur Isolierung roher Mitochondrien und (2) Tag-freies Immuneinfangen von Mitochondrien, um reine Organellen zu isolieren und Verunreinigungen zu eliminieren. Mitochondriale Proteine aus jeder Aufreinigungsstufe werden mittels quantitativer Massenspektrometrie analysiert und Anreicherungsausbeuten berechnet, was die Entdeckung neuer mitochondrialer Proteine durch subtraktive Proteomik ermöglicht. Unser Protokoll bietet einen sensitiven und umfassenden Ansatz zur Untersuchung des mitochondrialen Inhalts in Zelllinien, Primärzellen und Geweben.

Introduction

Mitochondrien sind komplexe und dynamische Organellen, die in der Lage sind, die Stoffwechselbedürfnisse der Zelle zu erkennen und sich an sie anzupassen. Mitochondrien sind für die Komplexität des Zellstoffwechsels von zentraler Bedeutung und fungieren als Stoffwechselknotenpunkte, an denen Kohlenhydrat-, Protein-, Lipid-, Nukleinsäure- und Co-Faktor-Stoffwechselreaktionen zusammenlaufen¹. Sie dienen auch als Signalorganellen für Signalwege der angeborenen Immunantwort und als Reaktion auf Veränderungen von Ionen und reaktiven Sauerstoffspezies ^2,3. Bis heute wurden etwa 1.100 Proteine den Mitochondrien ^4,5,6 zugeordnet, aber wir können davon ausgehen, dass noch viele weitere entdeckt werden müssen, insbesondere solche^, die nur in bestimmten Zelltypen oder vorübergehend unter bestimmten Umweltbedingungen exprimiert werden. Die Entwicklung neuer Ansätze zur Quantifizierung von Veränderungen in der mitochondrialen Zusammensetzung in Stoffwechselzuständen von Interesse wird unser Wissen über diese Organellen erweitern und neue therapeutische Wege für die durch mitochondriale Dysfunktion gekennzeichneten Erkrankungen aufzeigen⁷.

Derzeit sind verschiedene Protokolle zur Isolierung von Mitochondrien mit unterschiedlichen Ausbeuten und Reinheitsgraden verfügbar⁸. Zentrifugationsbasierte Ansätze sind aufgrund ihrer Einfachheit und geringen Kosten am beliebtesten. Obwohl die Differenzzentrifugation für die meisten Anwendungen geeignet ist, hat sie den Nachteil, dass sie eine geringere mitochondriale Reinheit erzielt und große Mengen an Ausgangsmaterial erfordert, wenn komplexere Anwendungen auf der Grundlage von Dichtegradienten verwendet werden. In den letzten Jahren sind neue Methoden zur Isolierung von Mitochondrien entstanden, wie z. B. die tag-basierte Immunerfassung ("MITO-IP")⁹ und die fluoreszenzaktivierte Organellensortierung¹⁰. Obwohl beide Verfahren Proben mit hoher Reinheit erzeugen können, erfordert ersteres Gentechnik, um Mitochondrien für die Affinitätsreinigung zu markieren, wodurch die Protokolle mit Primärmaterial von unveränderten Organismen oder menschlichen Spendern inkompatibel sind. Letzteres ist auf den Zugang zu Durchflusszytometrie- und Sortierinstrumenten angewiesen. Die Kombination verschiedener Isolationsmethoden verspricht robustere Protokolle und eine höhere Reinheit.

In dieser Arbeit stellen wir ein neues Protokoll für die Isolierung von Mitochondrien vor, das auf der Kombination zweier bestehender Methoden basiert: (1) differentielle Zentrifugation zur Isolierung einer rohen mitochondrialen Fraktion und (2) tag-freier Immuneinfang von Mitochondrien mit superparamagnetischen Kügelchen, die kovalent an Antikörper gegen die Translokase der äußeren mitochondrialen Membran 22 (Tomm22)¹¹, einem ubiquitären mitochondrialen Protein der äußeren Membran, gebunden sind (Abbildung 1). Das von uns beschriebene Verfahren ist mit der quantitativen Protein-Massenspektrometrie kompatibel, und da es tag-frei ist und keine genetische Manipulation erfordert, kann es auf eine Vielzahl von Forschungsmodellen angewendet werden, von Zelllinien über Körperflüssigkeiten bis hin zu ganzen tierischen Geweben. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von zwei Schritten im Protokoll den Einsatz der subtraktiven Proteomik ^6,12 für die Entdeckung neuer mitochondrialer Proteine und die Untersuchung ihrer Expression.

Protocol

Es müssen immer Handschuhe getragen und die Zellkulturschritte unter einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden. Die Zellen werden in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5% CO₂ gehalten. Die in diesem Protokoll vorgestellten Forschungsarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Universität Lausanne und der Schweiz für die Verwendung von Tieren genehmigt und durchgeführt.

1. Kultivierung der Makrophagenzelllinie RAW264.7

1. Züchten Sie die MAW264.7-Zellen der Mäuse in Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit hohem Glukose- und Glutamingehalt, ergänzt mit 5 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (HI-FBS) und 100 I.E./ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin (P/S).
   HINWEIS: Um Mitochondrien zu isolieren, reicht eine einzelne konfluente 15-cm-Platte (ca. 70 x 10 7 RAW264.7-Zellen) aus.
2. Bewahren Sie die RAW264.7-Zellen in Gewebekulturplatten auf. Eine anfängliche Aussaatdichte von 1 x 10⁵ Zellen/ml führt in 3 Tagen zu einer konfluierenden Platte. Verwenden Sie 25 ml Zellsuspension in Medien für eine 15-cm-Platte. RAW264.7-Zellen haben eine hohe Zellteilungsrate und müssen häufiger geteilt werden als die meisten Zelllinien.
3. Ablösen von RAW264.7-Zellen
   1. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
   2. Für eine 15-cm-Platte werden 8 ml warmer RAW-Dissoziationspuffer (270 mM Kaliumchlorid, 30 mM Natriumcitrat-Dihydrat in_H2O, steril filtriert) hinzugefügt und die Zellen bei 37 °C für 5 min inkubiert.
   3. Geben Sie ein äquivalentes Medienvolumen auf die Platten (1:1-Verdünnung des Dissoziationspuffers) und pipettieren, um die Zellen abzulösen und zu homogenisieren.
   4. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches Röhrchen und zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 x g für 3 min bei Raumtemperatur.
   5. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in einem geeigneten Medienvolumen (beschrieben in Schritt 1.1) für die Zellzählung.
      HINWEIS: Es können auch andere Methoden zum Abtrennen von RAW264.7-Zellen verwendet werden, z. B. Trypsin oder ein Zellschaber. Diese Methoden sind jedoch härter für die Zellen und können dazu führen, dass sie in den Tagen nach dem Ablösen in M1-ähnliche Makrophagen polarisiert werden.

2. Isolierung und Kultivierung von aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen (BMDMs)

HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll gilt für eine einzelne Maus und kann für mehrere Mäuse hochskaliert werden. Detaillierte Protokolle für die Isolierung und Kultur von BMDM wurden an anderer Stelle beschrieben^13,14.

1. Opfern Sie eine 8-12 Wochen alte C57BL/6-Maus mit einer hohen Dosis CO₂.
   HINWEIS: Es können sowohl männliche als auch weibliche Mäuse verwendet werden.
2. Besprühen Sie die Maus mit 75% Ethanol, um sie zu sterilisieren.
3. Sezieren und entnehmen Sie die Hüften, Oberschenkelknochen und Schienbeine der Maus¹⁵.
4. Um das Knochenmark aus Oberschenkelknochen und Schienbeinen zu entnehmen, entfernen Sie das Kniegelenksende beider Knochen¹⁵. Gewinnen Sie das Knochenmark aus den Hüften, indem Sie die Hüftpfanne entfernen.
5. Übertragen Sie die Knochen in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 4 ml BMDM-Medien, die auf Eis aufbewahrt werden (DMEM mit hohem Glukose- und Glutamingehalt, ergänzt mit 5 % HI-FBS, P/S und 10 mM HEPES).
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Knochen in den Medien zu halten, um ein Austrocknen des Knochenmarks während der Dissektion zu vermeiden.
6. Fügen Sie 4 ml PBS und 4 ml warmes BMDM-Medium in zwei verschiedene Vertiefungen einer 6-Well-Platte hinzu.
7. Übertragen Sie die Knochen und das Medium aus dem konischen 50-ml-Röhrchen in eine leere Vertiefung der 6-Well-Platte.
8. Übertragen Sie die Knochen mit einer Pinzette in den PBS-Brunnen, um sie zu waschen.
9. Übertragen Sie die Knochen in die Vertiefung mit warmem BMDM-Medium.
10. Bohren Sie mit der Pinzette ein Loch von 1-2 mm Durchmesser in den Boden von zwei 0,5-ml-Röhrchen und legen Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen.
    Anmerkungen: Für diesen schnellen Schritt ist es nicht erforderlich, Medien in das Röhrchen einzufüllen.
11. Legen Sie in jedes 0,5-ml-Röhrchen einen Oberschenkelknochen, ein Schienbein und eine Hüfte so, dass das Knochenmark der freiliegenden Knochen zum Boden der Röhrchen zeigt.
12. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 13.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur, um das Knochenmark und die übrig gebliebenen Medien durch das Loch des 0,5-ml-Röhrchens in das 1,5-ml-Röhrchen zu sammeln. Entsorgen Sie die 0,5-ml-Röhrchen mit den Knochen.
13. Resuspendieren Sie die Knochenmarkpellets in BMDM-Medien und übertragen Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
14. Fügen Sie BMDM-Medien mit bis zu 10 ml hinzu.
15. Legen Sie ein 40-μm-Zellsieb auf ein konisches 50-ml-Röhrchen und filtern Sie die Knochenmarksuspension hindurch.
16. Zentrifugieren Sie die filtrierte Suspension bei 300 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die intakten Zellen zurückzugewinnen und kleine Ablagerungen aus der Zellsuspension zu entfernen.
17. Bereiten Sie 70 ml BMDM-Medien zu, die mit 50 ng/ml Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF) ergänzt werden.
18. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml M-CSF-supplementiertem BMDM-Medium.
19. Geben Sie 9 ml M-CSF-supplementiertes BMDM-Medium in jede der sieben 10-cm-Petrischale.
20. Legen Sie 1 ml Zellen (ca. 1 x 10,⁷ Zellen) in jede der sieben 10-cm-Petrischale.
21. Homogenisieren Sie die Zellsuspension in jeder Platte, indem Sie vorsichtig auf der Platte auf und ab pipettieren, und übertragen Sie die Platten in den Inkubator.
22. Geben Sie nach 3 Tagen 5 ml warmes BMDM-Medium, ergänzt mit 50 ng/ml m-CSF, zu jeder Platte.
23. Nach 3 Tagen (Tag 6, nach Knochenmarkisolierung) wird die Adhäsion und Differenzierung des BMDM mikroskopisch überprüft.
    HINWEIS: An dieser Stelle ist es möglich, direkt mit der Isolierung der Mitochondrien fortzufahren (Schritt 3). Alternativ kann man das BMDM neu plattieren, was die Behandlung mit Zytokinen und kleinen Molekülen ermöglicht.
24. Abnehmen der BMDMs
    1. Saugen Sie das Medium von jeder Platte ab und fügen Sie 7 ml kaltes PBS hinzu, das mit 5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ergänzt wird.
    2. Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C für 7-8 min.
    3. Lösen Sie die BMDMs, indem Sie vorsichtig mit einer 10-ml-Pipette auf und ab pipettieren.
    4. Die resuspendierten BMDMs aus allen sieben Platten werden in einem einzigen konischen 50-ml-Röhrchen zusammengefasst und bei 300 x g 3 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
    5. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 40 ml warmem BMDM-Medium zur Zellzählung.
       HINWEIS: Zwischen 7-9 x 10⁷ BMDMs werden pro Maus erhalten. Für die Proteomik wird ein Minimum von 6 x 10⁷ BMDMs für die Mitochondrienisolierung empfohlen.
    6. Falls gewünscht, werden die BMDMs entsprechend dem Versuchsziel beschichtet und behandelt. Wenn nicht, fahren Sie direkt mit Schritt 3.3 fort.

3. Herstellung einer rohen mitochondrialen Fraktion durch Differentialzentrifugation

HINWEIS: Führen Sie alle Zentrifugationsschritte bei 4 °C durch. Es werden zwei Zentrifugen benötigt, eine mit Ausschwingrotor und Adaptern für konische Röhrchen mit einer relativen Zentrifugalkraft von mindestens 300 x g, die andere mit einer relativen Zentrifugalkraft von mindestens 21.000 x g, geeignet für 1,5-ml-Röhrchen. Wenn Sie anhaftende Zellen verwenden, verwenden Sie einen Zellschaber.

1. Bei adhärenten Zellen aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 10 ml PBS pro 15-cm-Platte hinzu.
   Anmerkungen: Das Abkratzen von Zellen in PBS ermöglicht es, sie gleichzeitig zu waschen. Wenn sich die Zellen bereits in der Suspension befinden, fahren Sie direkt mit Schritt 3.3 fort.
2. Trennen Sie die Zellen mit einem Zellschaber und fassen Sie sie in einem einzigen konischen 50-ml-Röhrchen zusammen. Homogenisieren Sie die Zellsuspension durch Auf- und Abpipettieren.
   HINWEIS: Zellen können mit einem Zellschaber abgelöst werden, da dies schneller ist und sie kurz darauf lysiert werden.
3. Für jede Versuchsbedingung werden 5 % des Zellsuspensionsvolumens in ein 1,5-ml-Röhrchen überführt und bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
   Anmerkungen: Wenn Sie Suspensionszellen verwenden, achten Sie darauf, die Zellen vorher einmal mit PBS zu waschen, um mögliche Verunreinigungen aus den Medien wie FBS zu entfernen.
4. Entsorgen Sie den Überstand und bewahren Sie das Pellet auf Eis auf.
   HINWEIS: Dies stellt den Anteil der "Gesamtzelle" für die Proteomik dar.
5. Die restlichen Proben aus Schritt 3.1 oder 3.2 bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
6. Führen Sie alle folgenden Schritte auf Eis und mit eiskalten Puffern durch.
7. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml eiskaltem Mitochondrienpuffer (MB) (210 mM Mannitol, 70 mM Saccharose, 10 mM HEPES/NaOH [pH 7,4] und 1 mM EDTA).
8. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min bei 4 °C gewonnen.
9. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 ml kaltem MB und überführen Sie es in ein 1,5-ml-Röhrchen.
   HINWEIS: Dieses Verfahren ergibt eine ungefähre Zellkonzentration von 1,5 x 10 8 BMDM-Zellen/ml oder 3 x 10⁸ RAW264,7 Zellen/ml.
10. Homogenisieren Sie die Zellsuspension mit einer 1-ml-Spritze mit einer 25-G-Nadel um 30 Durchgänge durch die Nadel (Abbildung 1A).
11. Geben Sie 1 ml kaltes MB in das Röhrchen und mischen Sie es durch Inversion. Zentrifugieren Sie die homogenisierte Zellsuspension bei 2.000 x g für 5 min bei 4 °C.
12. Übertragen Sie 1 ml des Überstands in ein frisches 1,5-ml-Röhrchen auf Eis, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie das Zellpellet und homogenisieren Sie es erneut, wie in Schritt 3.7 beschrieben.
13. Das homogenisierte Zellpellet und der Überstand aus den beiden vorherigen Schritten werden in einem einzigen 1,5-ml-Röhrchen zusammengefasst und bei 2.000 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt enthält das Pellet hauptsächlich Kerne und ungebrochene Zellen und wird verworfen. Der Überstand enthält Zelltrümmer, Zytosol und Organellen, einschließlich Mitochondrien (Abbildung 1B).
14. Teilen Sie den Überstand auf vier 1,5-ml-Röhrchen auf.
    Anmerkungen: Die Aufteilung des Überstands auf mehrere Röhrchen in dieser Phase verbessert die Entfernung von Verunreinigungen in den folgenden Schritten.
15. Fügen Sie MB hinzu, um ein endgültiges Volumen von 1 ml in jedem der vier Röhrchen zu erhalten. Durch Inversion mischen und die Röhrchen bei 13.000 x g 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
    Anmerkungen: Nach diesem Schritt ist ein Pellet mit zwei Schichten sichtbar. Das untere, feste, braune Pellet enthält Mitochondrien und wird zur weiteren Reinigung aufbewahrt (Abbildung 1C). Das obere, lockere, weiße Pellet enthält andere zelluläre Strukturen und kann verworfen werden.
16. Führen Sie diesen Schritt sorgfältig aus. Entfernen Sie den Überstand mit so viel weißem Oberkorn wie möglich. Durch vorsichtiges Pipettieren ist es möglich, das weiße Pellet zu resuspendieren und dann zu verwerfen, wobei das braune mitochondriale Pellet intakt bleibt.
17. Bewahren Sie eine der vier Röhren mit dem mitochondrialen Pellet auf Eis auf. Dies stellt die "rohe Mitochondrien"-Fraktion für die Proteomik dar.
18. Die anderen drei Pellets werden in einem 1,5-ml-Röhrchen in einem Endvolumen von 1 ml MB zusammengefasst.

4. Superparamagnetische Antikörper-basierte Aufreinigung von Mitochondrien

Anmerkungen: Führen Sie alle folgenden Schritte in einem Kühlraum bei 4 °C durch.

1. Übertragen Sie 1 ml des rohen mitochondrialen Präparats aus Schritt 3.18 in ein konisches 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 7 ml MB hinzu, das mit 150 mM NaCl (MB + NaCl) ergänzt wird.
   HINWEIS: Die Zugabe von NaCl verbessert die Antikörperbindung und verringert die unspezifische Bindung der Schadstoffe an die Beads und an die Mitochondrien.
2. Geben Sie 50 μl Tomm22-Kügelchen in die 8-ml-Rohmitochondriensuspension (Abbildung 1D) und inkubieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei 4 °C auf einem rotierenden Rad bei niedriger Geschwindigkeit.
   HINWEIS: Tomm22-Beads sind kovalent an monoklonale Tomm22-Antikörper gebunden, die in Mäusen gezüchtet und an superparamagnetische Beads gekoppelt sind.
3. Platzieren Sie in der Zwischenzeit eine Säule auf dem Magneten.
4. Äquilibrieren Sie die Säule mit 8 ml MB + NaCl und verwerfen Sie den Durchfluss.
5. Nach der 15-minütigen Inkubation der Probe bei 4 °C mit den Tomm22-Kügelchen wird die Probe in die Säule überführt. Verwerfen Sie den Durchfluss.
   HINWEIS: Die Mitochondrien bleiben an den magnetischen Kügelchen in der Säule befestigt (Abbildung 1E).
6. Waschen Sie die Säule dreimal mit 8 ml MB + NaCl.
7. Entfernen Sie die Säule vom Magneten und legen Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
8. Elute die Mitochondrien, indem du 1,5 ml MB + NaCl in die Säule gibst und sofort einen Kolben anbringst, um die gereinigten Mitochondrien in das Röhrchen zu eluieren.
9. Übertragen Sie die eluierten Mitochondrien in ein 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 21.000 x g für 10 min bei 4 °C.
   Anmerkungen: Es bildet sich ein braunes Pellet. Diese enthält die isolierten Mitochondrien und einen Teil der Antikörper-gekoppelten Beads (Abbildung 1F).
10. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig vom Pellet. Das Pellet stellt die Fraktion der "reinen Mitochondrien" für die Proteomik dar. Dieses Pellet kann zusammen mit den Pellets aus den Schritten 3.4 und 3.17 bei -20 °C gelagert werden und ist für nachgelagerte Anwendungen vorbereitet.

Results

Im vorliegenden Protokoll werden drei Proben mit zunehmender mitochondrialer Reinheit erzeugt: Gesamtzellen, rohe Mitochondrien ("mito-crude") und reine Mitochondrien ("mito-pure") (Abbildung 1). Wir validierten die Aufreinigung von Mitochondrien aus der RAW264.7-Makrophagenzelllinie, indem wir gleiche Proteinmengen jeder Fraktion auf ein Gel luden und Immunblot durchführten, und stellten fest, dass die mitochondriale Citratsynthase (Cs) bei jedem Reinigungsschritt angereichert war. Währenddessen verschwanden Proteine aus dem Zytosol (GAPDH), der Plasmamembran (Na/K ATPase), dem Zellkern (Lamin B), den Lysosomen (Lamp1) und dem endoplasmatischen Retikulum (ER) (Pdi) nach und nach (Abbildung 2A). Ähnliche Ergebnisse wurden mit BMDMs erzielt. Zur weiteren Validierung der Reinheit und Integrität der isolierten Mitochondrien wurde eine Elektronenmikroskopie an der reinen mitochondrialen Fraktion durchgeführt. Wir beobachteten Mitochondrien mit einer klassischen ovalen Form und intakten Cristae, die von elektronendichten Partikeln umgeben waren, die den Antikörper-beschichteten Kügelchen entsprachen (Abbildung 2B). Daraus kann geschlossen werden, dass unser Protokoll die Mitochondrien anreichert, andere zelluläre Komponenten erschöpft und die strukturelle Integrität der Mitochondrien aufrechterhält.

Als nächstes wurde eine Proteomanalyse jeder Fraktion mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (LC/MS) durchgeführt. Insgesamt wurden 6.248 Proteine im Extrakt aus Gesamtzellen identifiziert, von denen 907 zuvor im MitoCarta3.0-Inventar⁵ als mitochondrial annotiert waren. Nachdem wir nach Proteinen mit einem Schwellenwert von mindestens zwei einzigartigen Peptiden gefiltert hatten, berechneten wir für jedes Protein in jeder Probe einen Anreicherungswert basierend auf seiner Intensität im Vergleich zur Gesamtzelle. Anschließend ordneten wir die Proteine sieben großen subzellulären Kompartimenten zu: Mitochondrien, ER, Lysosomen, Golgi-Apparat, Zytoskelett, Zellkern und Zytosol, wobei wir Gene Ontology (GO)^16,17 und MitoCarta3.0⁵ als Referenzen verwendeten. Wichtig ist, dass eine durchschnittliche Anreicherung der mitochondrialen Proteine um mehr als das 10-fache bzw. mehr als das 20-fache in den rohen bzw. reinen Mitochondrienfraktionen beobachtet wurde (Abbildung 2C). Im Gegensatz dazu waren die Bestandteile der anderen sechs analysierten zellulären Kompartimente während des Aufreinigungsprozesses erschöpft. Besonders bemerkenswert ist, dass wir in der rohen Mitochondrienfraktion eine vorübergehende Anreicherung von ER- und lysosomalen Proteinen beobachteten, zwei Klassen von kontaminierenden Proteinen, die häufig nach differentiellen Zentrifugationsprotokollen vorhanden sind¹⁸. Dies war möglicherweise auf Organellen-Organellen-Wechselwirkungen und ähnliche Sedimentationskoeffizienten zurückzuführen, insbesondere für Lysosomen, die in Makrophagen sehr häufig vorkommen¹⁹. Während beide nach Immuneinfang größtenteils depletiert waren, konnten wir in der mito-reinen Fraktion ein kleines Signal für Proteine aus den ER-Mitochondrien-Kontaktstellen nachweisen.

Anschließend verglichen wir direkt die Proteinhäufigkeit aus den Gesamtzellen und aus mito-reinen Proben und beobachteten zwei unterschiedliche Populationen, die mitochondrialen und nicht-mitochondrialen Proteinen entsprechen (Abbildung 2D). Während sich die überwiegende Mehrheit der MitoCarta-Proteine zusammenschloss, fanden wir einige (<5%), die sich mit Nicht-MitoCarta-Proteinen anhäuften. Diese Proteine können (1) zytosolische Mitochondrien-interagierende Proteine (eine neue Kategorie, die in Version 3.0 von MitoCarta annotiert ist), (2) dual-lokalisierte Proteine oder (3) falsch annotierte Proteine darstellen. Umgekehrt fanden wir einige Fälle, in denen sich Nicht-MitoCarta-Proteine mit mitochondrialen Proteinen anhäuften. Während solche Proteine Verunreinigungen des Isolierungsverfahrens darstellen können, können sie auch Proteine darstellen, die bisher nicht als in Mitochondrien vorhanden klassifiziert wurden.

Um diese neue Klasse potenzieller mitochondrialer Proteine zu untersuchen, wurde die subtraktive Proteomik verwendet, ein Ansatz, der sich für die Entdeckung organellarer Proteome, einschließlich der Mitochondrien ^6,12, als nützlich erwiesen hat. Die subtraktive Proteomik geht davon aus, dass die Mitochondrien während der Reinigungsschritte angereichert und die Verunreinigungen erschöpft werden sollten⁶. Während sich beispielsweise Schadstoffe während der differentiellen Zentrifugation (z. B. aufgrund ähnlicher Sedimentationseigenschaften) oder während des Immuneinfangs (z. B. aufgrund unspezifischer Antikörperbindung) anreichern können, sollten sich in beiden nur echte mitochondriale Proteine signifikant anreichern. So ist es möglich, Proteine herauszufiltern, die in der reinen Mitochondrienfraktion gefunden wurden, aber inkonsistente Anreicherungsmuster aufwiesen. Im vorliegenden Beispiel mit RAW264.7-Zellen konnten wir durch die Festlegung eines Schwellenwerts für einzigartige Peptide von ≥1 für die mito-rohen und mito-reinen Proben und durch die Verwendung strenger Anreicherungsschwellen die Liste der gewonnenen mitochondrialen Proteome von 1.127 Proteinen, die ursprünglich in der rohen mitochondrialen Fraktion nach differentieller Zentrifugation gefunden wurden, auf 481 Proteine nach der zweiten Aufreinigungsrunde mittels Tomm22-Immunselektion verfeinern. Die reduzierte Anzahl von MitoCarta-annotierten Proteinen in der mito-reinen Fraktion spiegelt die hohe Stringenz wider, die bei der Selektion angewendet wird. Interessanterweise waren 70 der Proteine, die in der mito-reinen Fraktion vorhanden waren, im MitoCarta3.0-Inventar nicht vorhanden (Abbildung 3A, B). Diese letztgenannten Proteine könnten potentielle neue mitochondriale Kandidatenproteine darstellen, die möglicherweise nur in der Makrophagenzelllinie RAW264.7 und in verwandten Zellen exprimiert werden und weitere Untersuchungen verdienen.

Abbildung 1: Illustration des zweistufigen, tag-freien Mitochondrien-Isolationsprotokolls . (A) Eine Zellsuspension wird durch eine 25-G-Nadel aufgebrochen. (B) Zellkerne und ganze Zellen werden durch Zentrifugation bei 2.000 x g getrennt und der Überstand wird gerettet. (C) Rohe Mitochondrien werden durch differentielle Zentrifugation des Überstandes bei 13.000 x g (Mito-Rohöl) isoliert. (D) Rohe Mitochondrien werden dann mit Tomm22-Antikörpern (Ab) inkubiert, die kovalent an superparamagnetische Beads gebunden sind. (E) Die Mitochondrien-Tomm22-Antikörper-Beads-Komplexe werden mit Hilfe von Magnetsäulen von Kontaminanten getrennt und eluiert. (F) Reine Mitochondrien werden gesammelt und durch Zentrifugation konzentriert (mito-rein). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse der Mitochondrienisolierung aus zwei Makrophagenquellen. (A) Protein-Immunoblot-Analyse von RAW264.7 (oben) und BMDM-Zellen (unten) unter Verwendung von Antikörpern gegen die mitochondriale Citratsynthase (Cs - Mitochondrien), Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (Gapdh - Zytosol), Natrium-Kalium-Pumpe (Na/K ATPase - Plasmamembran), Lamin B (Lamin B - Zellkern), lysosomal-assoziiertes Membranprotein 1 (Lamp1 - Lysosom) und Proteindisulfid-Isomerase (Pdi - ER). (B) Elektronenmikroskopie von gereinigten Mitochondrien aus RAW264.7-Zellen. Partikel mit hoher Dichte, die Mitochondrien umgeben, entsprechen den Tomm22-Kügelchen, die nach der Elution aus den Säulen mit mito-reinen Proben weitergeführt werden. Maßstabsbalken: 80 nm. (C) Anreicherungswerte für Gesamtzellen, mito-roh und mito-rein aus sieben zellulären Kompartimenten in RAW264.7-Zellen. MitoCarta3.0 und GO wurden für die Proteinannotation verwendet und die durchschnittlichen Werte werden dargestellt. Abkürzung: ER = Endoplasmatisches Retikulum. (D) Proteinhäufigkeitswerte (riBAQ) für Proteine in Gesamtzellen und mito-reinen Proben aus RAW264.7-Zellen. MitoCarta3.0-Proteine sind orange dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3. Entdeckung neuer mitochondrialer Proteine mittels subtraktiver Proteomik. (A) Subtraktive Proteomik-Strategie zur Entdeckung neuer mitochondrialer Proteine. Es werden hohe Auswahlschwellen (4x und 2x) angewendet, um die Auswahl von Fehlalarmen zu minimieren. (B) Anreicherungsausbeute (Faltung der Gesamtzelle) neuer mitochondrialer Kandidatenproteine, die bisher nicht im MitoCarta3.0-Inventar annotiert waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Wir haben Differentialzentrifugation und Immuneinfang kombiniert, um eine verbesserte Reinheit für die Mitochondrienisolierung zu erreichen. Unser Verfahren ermöglicht den Zugang zu Primärmaterial für die Identifizierung und Charakterisierung neuartiger mitochondrialer Proteine. Das Protokoll ist unkompliziert und robust und kann auf Zelllinien, Primärzellen und Gewebe angewendet werden, ohne dass eine genetische Veränderung erforderlich ist. Wir haben unser Protokoll durch Immunoblotting- und Proteomik-Analysen an Proben validiert, die in verschiedenen Phasen des Aufreinigungsprozesses entnommen wurden.

Im Vergleich zu Einzelisolationsmethoden führt die Kombination von Anreicherungsschritten unterschiedlicher Art - hier Zentrifugation und Immunmarkierung - zu einem robusteren Protokoll zur Isolierung von Mitochondrien. Dies liegt daran, dass mitochondriale Proteine zwar in beiden Aufreinigungen angereichert werden, es jedoch unwahrscheinlich ist, dass nach beiden Anreicherungsschritten auch Verunreinigungen angereichert werden. Obwohl eine hohe mitochondriale Reinheit auch durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation erreicht werden kann, erfordert dieser Ansatz eine große Menge an Ausgangsmaterial und den Zugang zu einer Ultrazentrifuge. Im Gegensatz zu neueren Methoden, die auf der tag-basierten mitochondrialen Isolierung^{basieren 20}, erfordert unser Ansatz keine genetische Modifikation der Probe, so dass sie für Primärmaterial aus jeder Quelle geeignet ist.

Bei der Anwendung unseres Protokolls müssen einige technische und biologische Überlegungen bei der Versuchsplanung berücksichtigt werden. (1) Die Menge an Ausgangsmaterial ist entscheidend, um ausreichend Material zu erhalten. Es ist unvermeidlich, dass bei der Homogenisierung (Schritt 3.10), da nicht alle Zellen lysiert werden, oder bei den drei Säulenwäschen (Schritt 4.6) eine kleine Anzahl von Mitochondrien verloren geht. Während sich unser Protokoll auf Reinheit statt Ausbeute konzentriert, wurde die Effizienz der Mitochondrienisolierung und damit ihre Ausbeute nicht gemessen oder optimiert. Es wird erwartet, dass die Verwendung von mehr Tomm22-Kügelchen und mehr Säulen die Ausbeute bei der Rückgewinnung von Mitochondrien erhöht. Gleichzeitig kann eine gründliche Optimierung des Homogenisierungsschritts auch zu einer verbesserten mitochondrialen Ausbeute führen. Dieses Protokoll und die anfänglichen Zellzahlen, die wir hier für RAW264.7-Zellen und BMDMs angeben, sind für die Proteomik ausreichend und können für andere Anwendungen angepasst werden. Im Falle von primären BMDMs fanden wir heraus, dass eine einzelne Maus für ein Replikat ausreichte. Bei Bedarf kann das Verfahren skaliert werden, um BMDMs aus mehreren Tieren zu isolieren, die dann gepoolt werden können, um ausreichend Material zu erhalten. Die Zellzahl kann je nach Zelltyp, Größe und Mitochondriengehalt optimiert werden. (2) Tomm22 wird auf Mitochondrien aller Zelltypen und Gewebe exprimiert²¹, aber seine Expressionsstufe kann variieren. Daher ist es wichtig, bei der Planung eines Experiments zum Vergleich verschiedener Bedingungen sicherzustellen, dass die Expressionsniveaus von Tomm22 vergleichbar sind. Darüber hinaus ist es aufgrund der ubiquitären Expression von Tomm22 nicht möglich, zelltypspezifische mitochondriale Proteine in komplexen Geweben zu untersuchen. (3) Die Zeit, die benötigt wird, um reine Mitochondrien zu erzeugen (ca. 2,5 h), ist unvereinbar mit einer Untersuchung vorübergehender Ereignisse, wie z. B. Veränderungen der Stoffwechselprofile. In diesem Fall empfehlen wir die direkte Tag-basierte Immunerfassung⁹, die auch die Untersuchung zelltypspezifischer Mitochondrien ermöglicht in vivo²⁰. (4) Obwohl Studien an isolierten Mitochondrien, die mit Tomm22-Antikörper-markierten Beads allein gewonnen wurden, Aktivität in funktionellen Assays gezeigt haben¹¹muss noch festgestellt werden, ob Mitochondrien, die mit unserem Protokoll generiert wurden, mit nachgeschalteten aktivitätsbasierten Assays kompatibel sind. Die Färbung von MitoTracker oder Tetramethylrhodaminmethylesterperchlorat (TMRM) oder Respirometriemessungen sind mögliche Ansätze zur Quantifizierung der Funktionalität isolierter Mitochondrien²². (5) Nach der Eluation der "mito-reinen" Probe aus der Säule sind einige Tomm22-Beads in der reinen Mitochondrienfraktion (Abbildung 2B). Obwohl wir keine Interferenz mit dem Trypsinverdau und der Proteinmassenspektrometrie beobachtet haben, sollte das Vorhandensein dieser Beads und der Immunglobuline in anderen nachgelagerten Anwendungen berücksichtigt werden. Der Tomm22-Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper, der in Mäusen produziert wird²³Daher ist es wichtig zu bedenken, dass bei der Verwendung von Sekundärantikörpern gegen Mäuse beim Immunblotting unspezifische Banden in der Größe der Immunglobulinketten entstehen. (6) Die vollständige Homogenisierung der Zellsuspension ist der Schlüssel zur erfolgreichen Isolierung von Mitochondrien. Hier verwenden wir eine Spritze mit einer 25-G-Nadel, um sowohl RAW264.7-Zellen als auch BMDMs zu lysieren. Abhängig vom Zelltyp und seiner Größe können jedoch andere mechanische Homogenisierungsmethoden, wie z. B. die Verwendung eines Dounce-Homogenisators, oder kontrolliertere Ansätze wie Zellhomogenisatorgeräte besser geeignet sein. Auch nicht-mechanische Homogenisierungsmethoden, wie z. B. die sanfte Beschallung, können in Betracht gezogen werden. Ansätze zur Gewebehomogenisierung werden in anderen Studien weiter diskutiert^24,25. (7) Obwohl die Validierung durch Immunoblot die einfachste und kostengünstigste Methode ist, korrelieren die Ergebnisse möglicherweise nicht immer mit Veränderungen auf der gesamten Organellenebene. Aus diesem Grund empfehlen wir die Verwendung von Proteomik, um die Anreicherung bzw. Erschöpfung von Mitochondrien bzw. anderen Organellen vollständig zu validieren.

Das hier beschriebene zweistufige Mitochondrien-Reinigungsprotokoll hat es uns ermöglicht, sequenzielle Proben mit zunehmender mitochondrialer Reinheit zu erzeugen, und dies hat es uns ermöglicht, durch subtraktive Proteomik neue mitochondriale Proteinkandidaten zu entdecken¹². Für unsere Analyse verwenden wir strenge Schwellenwerte, um signifikant angereicherte mitochondriale Proteine zu selektieren, und obwohl dies möglicherweise einige bekannte mitochondriale Proteine nicht identifiziert (Abbildung 3A), ist die Falsch-Positiv-Rate für die Entdeckung neuer mitochondrialer Proteine verringert. Nichtsdestotrotz ist es wichtig zu betonen, dass alle Kandidatenproteine, die durch unser Protokoll entdeckt werden, durch orthogonale Ansätze validiert werden müssen. Wir empfehlen das Carboxy-terminale GFP-Tagging oder die Verwendung von Antikörpern gegen das endogene Protein, um die Assoziation mit Mitochondrien entweder mikroskopisch oder durch Proteaseschutz-Assays zu validieren.

Die direkte Anwendung unserer Methode auf unveränderte Zellen und Gewebe bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um zu untersuchen, wie sich Mitochondrien unter gesunden und krankheitsbedingten Bedingungen verändern und an ihre Umgebung anpassen. Die Anwendung unseres Protokolls auf Zelllinien, Tierkrankheitsmodelle, menschliche Flüssigkeiten und sogar Biopsien aus chirurgischen Eingriffen könnte sich als besonders nützlich erweisen, um unser Verständnis der Mitochondrien und der damit verbundenen Erkrankungen zu verbessern.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Spritze	BD Plastipal	309628
25 G Nadel	BD Microlance	300400
40 & micro; m Zellsieb	Corning	352340
Anti-TOM22 Mikrokügelchen, Maus	Miltenyi Biotec	130-127-693
Zellschaber	FisherScientific	11577692
DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX	ThermoFisher	31966
Ethylendiamintetraessigsäure	FisherScientific	BP-120-1
Fötales Rinderserum	Gibco	10270
HEPES	BioConcept	5-31F00-H
LS Säulen und Kolben	Miltenyi Biotec	130-042-401
Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor	Immunotools	12343115
Mannitol	Sigma	M4125
Natriumchlorid	Sigma	71380
Saccharose	Sigma	S1888
Penicillin/Streptomycin	BioConcept	4-01F00-H
Petrischalen	Corning	BH93B-102
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 10X	Eurobio Scientific	CS3PBS01-01
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
Vi-CELL BLU Zellviabilitätsanalysator	Beckman Coulter	C19196