Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

Tiffany M. Richardson; Yasminye D. Pettway; John T. Walker; Heather A. Nelson; Matthew Ishahak; Gregory Poffenberger; Radhika Aramandla; Conrad Reihsmann; Ashutosh Agarwal; Alvin C. Powers; Marcela Brissova

doi:10.3791/65259

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Methodenartikel

Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

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DOI:

10.3791/65259

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3. November 2023

Tiffany M. Richardson^*¹ , Yasminye D. Pettway^*¹ , John T. Walker¹ , Heather A. Nelson² , Matthew Ishahak³ , Gregory Poffenberger² , Radhika Aramandla² , Conrad Reihsmann² , Ashutosh Agarwal³ , Alvin C. Powers¹^,²^,⁴ , Marcela Brissova²

¹Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine, ²Division of Diabetes, Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, ³Department of Biomedical Engineering, University of Miami, ⁴VA Tennessee Valley Healthcare System

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur synchronen Erfassung und Co-Registrierung von intrazellulären Signalereignissen und der Sekretion von Insulin und Glukagon durch primäre humane Pseudoinseln unter Verwendung der adenoviralen Verabreichung eines zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Biosensors, eines cAMP-Differenzdetektors in situ (cADDis) und eines Mikroperifusionssystems.

Zusammenfassung

Die Langerhans-Inseln der Bauchspeicheldrüse, bei denen es sich um kleine 3D-Ansammlungen spezialisierter endokriner und unterstützender Zellen handelt, die in der gesamten Bauchspeicheldrüse verstreut sind, spielen eine zentrale Rolle bei der Kontrolle der Glukosehomöostase durch die Sekretion von Insulin durch Betazellen, was den Blutzucker senkt, und von Glukagon durch Alphazellen, das den Blutzucker erhöht. Intrazelluläre Signalwege, einschließlich derer, die durch cAMP vermittelt werden, sind der Schlüssel für die regulierte Alpha- und Betazell-Hormonsekretion. Die 3D-Inselstruktur ist zwar essentiell für die koordinierte Inselfunktion, stellt aber experimentelle Herausforderungen für mechanistische Studien der intrazellulären Signalwege in primären menschlichen Inselzellen dar. Um diese Herausforderungen und Einschränkungen zu überwinden, beschreibt dieses Protokoll eine integrierte Live-Cell-Imaging- und Mikrofluidik-Plattform, die primäre menschliche Pseudoinseln verwendet, die von Spendern ohne Diabetes erzeugt wurden und in ihrer Morphologie, Zusammensetzung und Funktion nativen Inseln ähneln. Diese Pseudoinseln werden durch den Dispersions- und Reaggregationsprozess primärer humaner Inselzellen größengesteuert. Im dispergierten Zustand kann die Genexpression von Inselzellen manipuliert werden; So können beispielsweise Biosensoren wie der genetisch kodierte cAMP-Biosensor, cADDis, eingeführt werden. Nach ihrer Bildung ermöglichen Pseudoinseln, die einen genetisch kodierten Biosensor exprimieren, in Kombination mit konfokaler Mikroskopie und einer Mikroperifusionsplattform die synchrone Bewertung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und der sekretorischen Profile von Alpha- und Betazellhormonen, um einen besseren Einblick in zelluläre Prozesse und Funktionen zu erhalten.

Einleitung

Die Langerhans-Inseln sind Mini-Organe, die über die gesamte Bauchspeicheldrüse verstreut sind und deren Funktion für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase entscheidend ist. Insulin wird aus Betazellen nach dem Metabolismus von Glukose, einem Anstieg des ATP/ADP-Verhältnisses, dem Verschluss von ATP-empfindlichen Kaliumkanälen, der Depolarisation der Plasmamembran und dem Einstrom von extrazellulärem Kalzium¹ sezerniert. Die Glucagon-Sekretion aus Alpha-Zellen ist weniger verstanden, aber es wurde postuliert, dass intrazelluläre und parakrine Signalwege zur Exozytose des Glucagon-Granula-Granulats beitragen