Summary
Denne protokollen beskriver en metode for synkron oppkjøp og samregistrering av intracellulære signalhendelser og utskillelse av insulin og glukagon ved primære humane pseudoisleter ved bruk av adenoviral levering av en syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) biosensor, en cAMP-differansedetektor in situ (cADDis) og et mikroperifusjonssystem.
Abstract
De pankreatiske øyene Langerhans, som er små 3D-samlinger av spesialiserte endokrine og støttende celler spredt over hele bukspyttkjertelen, har en sentral rolle i kontrollen av glukosehomeostase gjennom utskillelse av insulin av beta-celler, noe som senker blodsukkeret og glukagon av alfa-celler, noe som øker blodsukkeret. Intracellulære signalveier, inkludert de som medieres av cAMP, er nøkkelen til regulert alfa- og betacellehormonsekresjon. Selv om 3D-holmestrukturen er essensiell for koordinert holmefunksjon, presenterer den eksperimentelle utfordringer for mekanistiske studier av de intracellulære signalveiene i primære menneskelige øyceller. For å overvinne disse utfordringene og begrensningene, beskriver denne protokollen en integrert levende celleavbildning og mikrofluidisk plattform ved bruk av primære humane pseudoislets generert fra givere uten diabetes som ligner innfødte øyer i deres morfologi, sammensetning og funksjon. Disse pseudoislets er størrelseskontrollert gjennom dispersjons- og reaggregeringsprosessen av primære menneskelige øyceller. I dispergert tilstand kan øycellegenuttrykk manipuleres; for eksempel kan biosensorer som den genetisk kodede cAMP-biosensoren, cADDis, introduseres. Når de er dannet, tillater pseudoisleter som uttrykker en genetisk kodet biosensor, i kombinasjon med konfokal mikroskopi og en mikroperifusjonsplattform, synkron vurdering av fluorescerende biosensordynamikk og alfa- og betacellehormonsekretoriske profiler for å gi mer innsikt i cellulære prosesser og funksjon.
Introduction
De Langerhanske øyer er miniorganer spredt over hele bukspyttkjertelen, hvis funksjon er avgjørende for vedlikehold av glukosehomeostase. Insulin utskilles fra betaceller etter metabolismen av glukose, en økning i ATP / ADP-forholdet, lukningen av ATP-sensitive kaliumkanaler, depolarisering av plasmamembranen og tilstrømningen av ekstracellulært kalsium1. Glukagon sekresjon fra alfa celler er mindre forstått, men det har blitt postulert at intracellulære og parakrine veier bidrar til glukagon granul eksocytose 2,3,4. Både type 1 og type 2 diabetes er assosiert med øycelledysfunksjon 5,6,7. Derfor er det viktig å belyse de intracellulære signalveiene som medierer øyhormonsekresjon for å forstå fysiologiske og patologiske mekanismer i bukspyttkjerteløyer.
Den sfæriske arkitekturen av holmer presenterer visse hindringer for eksperimentering. Disse utfordringene inkluderer variasjon i holmestørrelse og 3D-naturen til holmer, noe som reduserer viral transduksjon i holmekjernen 8,9. For å overvinne disse utfordringene ble det utviklet et pseudoislet-system, hvor primære menneskelige øyer blir spredt i enkeltceller, adenoviralt transducert med konstruksjoner som koder for mål av interesse, og reaggregert for å danne størrelseskontrollerte, holmelignende strukturer kalt pseudoislets7. Sammenlignet med innfødte øyer fra samme donor som har blitt dyrket parallelt, er disse pseudoislets like i morfologi, endokrin cellesammensetning og hormonsekresjon7. Denne metoden tillater uttrykk for konstruksjoner gjennom pseudoiletten, noe som betyr at den overvinner en tidligere barriere for ensartet genetisk manipulering av primære menneskelige øyer 7,8,9.
I denne protokollen er pseudoisletsystemet integrert med en mikrofluidisk enhet for å uttrykke biosensorer i primære menneskelige øyceller og få tidsmessig oppløsning av pseudoislet hormonsekresjon under dynamisk perifusjon10,11,12. Pseudoislets er plassert i en mikrochip og utsatt for en jevn strøm av forskjellige sekretagoger via en peristaltisk pumpe12. Mikrochippen har en gjennomsiktig glassbunn og er montert på et konfokalmikroskop for å registrere den intracellulære signaldynamikken via endringer i biosensorens fluorescensintensitet. Biosensoravbildning synkroniseres med samlingen av mikroperifusjonsavløp for den påfølgende analysen av insulin- og glukagonsekresjon7. Sammenlignet med makroperifusjon tillater denne mikroperifusjonsmetoden at færre pseudoisleter kan brukes på grunn av det mindre volumet av den mikrofluidiske enheten sammenlignet med makroperifusjonskammeret7.
For å utnytte nytten av dette systemet ble den sykliske adenosinmonofosfat (cAMP) differansedetektoren in situ (cADDis) biosensor uttrykt i humane pseudoislets for å vurdere cAMP-dynamikk og hormonsekresjon. cADDis-biosensoren består av et sirkulært permutert grønt fluorescerende protein (cpGFP) plassert i hengselområdet til et utvekslingsprotein aktivert av cAMP 2 (EPAC2), som forbinder dets regulatoriske og katalytiske regioner. Bindingen av cAMP til reguleringsregionen EPAC2 fremkaller en konformasjonsendring i hengselområdet som øker fluorescensen fra cpGFP13. Intracellulære budbringere som cAMP fremkaller insulin og glukagonsekresjon etter oppstrøms aktivering av G-proteinkoblede reseptorer14. Levende celleavbildning kombinert med mikroperifusjon bidrar til å koble den intracellulære cAMP-dynamikken med øyhormonsekresjon. Spesielt i denne protokollen genereres cADDis-uttrykkende pseudoisleter for å overvåke cAMP-responser i alfa- og beta-celler til forskjellige stimuli: lav glukose (2 mM glukose; G 2), høy glukose pluss isobutylmetylxanthin (IBMX; 20 mM glukose + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX), og lav glukose pluss adrenalin (Epi; 2 mM glukose + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Denne behandlingsarbeidsflyten gjør det mulig å vurdere den intracellulære cAMP-dynamikken direkte via 1) IBMX-mediert fosfodiesteraseinhibering, som forbedrer intracellulære cAMP-nivåer ved å forhindre nedbrytning, og 2) adrenalin, en kjent cAMP-avhengig stimulator for alfacelleglukagonsekresjon mediert av β-adrenerg reseptoraktivering. Trinnene for å sette opp mikroperifusjonsapparatet for levende cellebildeeksperimenter, lasting av pseudoislets i mikrochip, synkron levende celleavbildning og mikroperifusjon, og analysen av biosensorsporene og hormonsekresjonen ved mikroplatebaserte hormonanalyser er beskrevet nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelige øyer (N = 4 preparater) ble oppnådd gjennom partnerskap med Integrated Islet Distribution Program, Human Pancreas Analysis Program, Prodo Laboratories, Inc. og Imagine Pharma. Vanderbilt University Institutional Review Board anser ikke avidentifiserte humane bukspyttkjertelprøver som forskning på mennesker. Dette arbeidet ville ikke vært mulig uten organdonorer, deres familier og organinnkjøpsorganisasjoner. Se tabell 1 for demografisk informasjon om donorer. Menneskelige øyer fra bukspyttkjerteldonorer uten diabetes ble isolert med mindre enn 15 timers kald iskemitid.
1. Pseudoisletdannelse (beskrevet i Walker et al.7)
- Skaff og håndplukk primære menneskelige øyer ved hjelp av en P200-pipette og stasjonær mikroskop, og vær nøye med å ikke forurense pipettespissen på overflater utenfor holmekulturmediet (10% FBS, 100 μg / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin, 2 mM L-glutamin i CMRL 1066).
- Overfør primære øyer til et 15 ml rør, og utfør alle de følgende pseudoisletformasjonstrinnene under en vevskulturhette for å forhindre forurensning. Desosiere de primære øyene sakte i 7 minutter ved romtemperatur med en P1000-pipette i 0,025% trypsin. Løsningen vil bli ugjennomsiktig når holmene begynner å bryte fra hverandre.
- For disse studiene gir 200-300 håndplukkede primære øyer med diametre på ca. 200 μm spredt i 500 μL 0,025% trypsin en til to 96-brønnsplater av pseudoislets; Det nøyaktige antallet kan variere avhengig av gjennomsnittlig holmestørrelse og levedyktighet. For >500 primære øyer, skaler opp volumet av 0,025% trypsin som brukes i forholdet 1: 1 (f.eks. 600 μL 0,025% trypsin for 600 håndplukkede øyer).
- Slukk spredningen ved å legge til et volum Vanderbilt Pseudoislet Media (VPM) tilsvarende volumet av trypsin som brukes. Vask deretter to ganger med 1 ml VPM. For vaskene, sentrifuge de dispergerte cellene ved 485 x g i 2-3 minutter ved 4 ° C i en benkesentrifuge. Resuspender cellene i et definert volum av VPM (vanligvis 1 ml) for telling.
MERK: Pseudoisletgenereringen og VPM-sammensetningen er beskrevet i en tidligere publikasjon7. Kort fortalt inneholder VPM like store volumer av berikede CMRL-medier (20 % FBS, 100 μg/ml streptomycin, 100 U/ml penicillin, 1 mM natriumpyruvat, 2 mM glutamax, 2 mM HEPES i CMRL 1066) og iEC-media (VEGF Medium Complete Kit minus FBS + 1 flaske endotelceller Medium Supplement). Et sammendragsskjema over pseudoisletgenerering er inkludert i figur 1A. - Bestem celleantall og levedyktighet ved hjelp av en automatisert celleteller ved å kombinere 10 μL Trypan Blue med 10 μL av cellesuspensjonen. Bland cellesuspensjonen godt for å sikre et nøyaktig celletall.
- Beregn volumet av cellesuspensjon, virus og VPM som kreves for ønsket antall pseudoislet. Baser alle beregningene på antall levende celler oppnådd i trinn 1.4.
- For disse studiene transducerer dispergerte humane øyceller ved MOI 500 (N = 1) eller 1000 (N = 2) med Ad-CMV-cADDis i et totalt volum på 500 μL. En plate med transduserte pseudoisleter (2000 celler/pseudoislet) gir tre tekniske replikater per donor (32 pseudoislets/eksperiment). Adenoviruset ble kommersielt oppnådd i dette arbeidet.
- Kombiner de beregnede mengdene cellesuspensjon, virus og VPM til et 1,5 ml rør. Bland innholdet forsiktig ved å pipettere opp og ned.
- Under transduksjon, inkuber rørene med åpne hetter, og dekk dem med en steril petriskål i 2 timer i en vevskulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2 / 95% luft.
- Tilsett 500 μL VPM i hvert rør, og vask cellene ved å sentrifugere dem ved 500 x g i 3 minutter ved 4 °C. Fullfør to vasker til for totalt tre vasker. Aspirer av supernatant, og resuspender cellene i 1 ml VPM.
- Beregn det totale cellesåvolumet (200 μL/pseudoislet). Legg til VPM (det beregnede cellesåvolumet minus 2 ml) til et konisk rør av passende størrelse. Legg til den transduserte cellesuspensjonen fra trinn 1.7 til det koniske røret. Hold det koniske røret litt lukket, men ikke tett lukket for å tillate luftutveksling for cellene.
- Skyll 1,5 ml røret (fra trinn 1,7) med 1 ml VPM, og overfør innholdet til det koniske røret, og da skal det koniske røret inneholde det totale cellesåvolumet.
- Bland innholdet i konisk rørbrønn ved å pipettere opp og ned med en motorisert serologisk pipette, og overfør deretter innholdet til et sterilt reagensreservoar. Hvis reservoaret ikke holder hele cellesåvolumet, må du utføre serieoverføringer og sørge for at suspensjonen er godt blandet ved hvert trinn.
- Bruk en flerkanals P200-pipette, pipett cellesuspensjonen i reagensbeholderen opp og ned 3-4 ganger for å sikre homogenitet, og rør deretter 200 μL av cellesuspensjonen inn i hver brønn på mikrobrønnplatene.
- Inkuber pseudoislets i en vevskulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2 / 95% luft i 6 dager uten middels endringer. Innen dag 6 skal pseudoisletene være fullt dannet og klare for eksperimenter (figur 1B-D).
2. Forberedelse til levende celleavbildning og mikroperifusjon (1 dag før forsøket)
MERK: Informasjon om klargjøring av mikroperifusjonsmediet er tilgjengelig gjennom den protocols.io ressursen (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).
- Høst pseudoislets ved hjelp av en flerkanals pipette ved å overføre dem fra 96-brønnplaten til en steril petriskål. Deretter håndplukker du pseudoisletene, og overfører dem til en annen steril petriskål som inneholder fersk VPM. La pseudoislets inkubere i en vevskulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2 / 95% luft over natten.
- Forbered 1 liter DMEM ved å tilsette 1 g BSA (radioimmunoassay-grade), 0,11 g natriumpyruvat, 0,58 g L-glutamin, 3,2 g natriumbikarbonat, 1,11 g HEPES og 1 flaske DMEM til 1 liter ultrarenset vann. Forbered en 1 M glukoseoppløsning i DMEM. Oppbevar begge oppløsningene ved 4 °C over natten.
- Kontroller strømmen av mikroperifusjonssystemet dagen før forsøket. Koble alle slangene til en chipholder som inneholder en tom mikrochip, som beskrevet i figur 2A-B. Bruk ultrarenset vann som avløpsvann for å bekrefte en strømningshastighet på 100 μL/min ved fraksjonskollektoren.
3. Tillegg av sekretagoger til DMEM (dag for forsøket)
- Tilsett 0,07 mg / ml askorbat til DMEM, og klargjør sekretagogene i DMEM + askorbatbuffer ved å bruke en 1 M glukosebeholdning for glukoseholdige buffere.
MERK: Askorbat brukes til å stabilisere adrenalin ved å forhindre oksidasjon. Hvis adrenalin ikke brukes, kan askorbat utelates fra DMEM. - Filtrer sekretagogene to ganger gjennom et 0,22 μm porefilter, ved hjelp av et nytt filter hver gang. Varm oppløsningene til 37 °C, og mål glukosen via et glukometer for å bekrefte ønsket konsentrasjon.
4. Oppsett av mikroperifusjonsapparat
- Varm miljøkammeret til et konfokal laserskanningsmikroskop til 37 °C, og sørg for at alle dørene er lukket og kammeret opprettholder en stabil temperatur. Plasser chipholderen som inneholder mikrochip i kammeret for å varme opp. Kontroller chiptemperaturen med en infrarød pistol.
MERK: I dette tilfellet er miljøkammeret satt til 38,5 °C, noe som gjør at brikken kan nå 37 °C. - Koble alle slangene til sponholderen (som beskrevet i figur 2A-B). Flush-line med baseline sekretagog i 5 min. I denne studien ble streken skyllet med 2 mM glukose (G 2). Bytt boblefellemembranen til de-bobleren hvert 8-10 forsøk.
5. Lasting av pseudoislets i mikrochip
- Før du laster inn mikrobrikken, ta et lysfelt- og mørkefeltbilde (10x forstørrelse) av pseudoislets som vil bli brukt i eksperimentet for den påfølgende kvantifiseringen av holmekvivalenter (IEQ).
MERK: IEQ brukes til å normalisere hormonsekresjonen til variasjoner i øynummeret på tvers av forsøkene. Dette trinnet kan også gjøres dagen før eksperimentet. - Aspirer ekstra væske fra bunnen og øvre halvdel av mikrochippen. Den øverste halvdelen av mikrochipet inneholder pakninger som sikrer en tilstrekkelig tetning av hver brønn, mens den nederste halvdelen av mikrochipet inneholder brønnene med et glassdeksel festet. Forvåt en brønn i mikrochipet med 5 μL DMEM. Sørg for å pipe rundt ytterkantene av brønnen for å fukte sprekkene.
- Bruk en forfuktet pipette til å samle 30-32 pseudoislets i et 23 μL volum, og dispenser sakte pseudoislets inn i midten av brønnen i bunnstykket av mikrochipet. Kontroller pipettespissen for eventuelle pseudoisleter som kan ha blitt festet.
- Bruk en gellastespiss for å manøvrere pseudoisletene forsiktig inn i midten av brønnen. Dette sikrer at maksimalt antall pseudoislets blir fanget opp i et synsfelt.
- Ta et bilde av pseudoislets i mikrochip på stereoskopet. Denne tellingen vil bli brukt til å justere den beregnede IEQ for eventuelle pseudoislet tap under denne prosessen.
- Hvis alle pseudoislets fra trinn 5.3 ikke er lastet inn i mikrochipet, juster IEQ tilsvarende. Hvis for eksempel 30 pseudoister visualiseres nå, men 32 ble visualisert i trinn 5.1, beregner du IEQ på bildene fra trinn 5.1 og multipliserer deretter med 30/32.
- Plasser bunnen av mikrobrikken i mikrobrikkeholderen. Sett toppen av mikrobrikken forsiktig på med den grønne pakningssiden ned.
- Mens du holder mikrobrikken på plass, lukker du forsiktig mikrobrikkeholderen for å klemme mikrobrikken sammen. Prøv å ikke legge for høyt trykk på mikrochipet under denne prosessen, da dette vil fortrenge væsken i brønnen og kan føre til pseudoislettap. Unngå å introdusere luftbobler i brønnen.
6. Synkron levende celleavbildning og mikroperifusjon
- Overfør sekretagoger, pumpe og mikrochip i holderen inn i miljøkammeret montert på konfokalmikroskopet. Styr effluksslangen ut av kammeret til fraksjonssamleren.
- Plasser bufferne i 15 ml koniske rør med åpninger boret inn i lokkene. Disse hullene forhindrer at oppsamlingsslangen driver ut av røret.
- Når du skrur slangen inn i de-bobleren, skiller du mutteren og ferrulen, og skru deretter inn i de-bobleren. Dette forhindrer vridning av linjen.
- Sett brøkoppsamleren til å rotere hvert 2. minutt. Legg riktig antall rør inn i fraksjonssamleren, regnskap for vask og eksperimentelle fraksjoner. For disse forsøkene ble 15 vaskerør (30 min total vask) og 28 rør for fraksjonsoppsamling benyttet.
- Start pumpen for å levere basismediet (som inneholder baseline glukosekonsentrasjon) ved 100 μL/min (en oppsamling på 2 minutter ved en strømningshastighet på 100 μL/min resulterer i 200 mikroliter avløpsvann per hvert fraksjonsrør). Denne strømningshastigheten ble valgt for å begrense den store belastningen på pseudoisletene og forhindre betydelig pseudoisletbevegelse under live-avbildningen.
- Mens væsken løper gjennom apparatet, se etter følgende:
- Se etter dråper på slutten av fraksjonskollektortuten, som indikerer strømning gjennom systemet.
- Se etter reduksjoner i utstrømningen fra systemet; hvis det er <200 μL i oppsamlingsrørene, indikerer dette at det kan være en blokkering eller lekkasje i systemet. Se tabell 2 for en liste over potensielle årsaker til redusert avløpsvannvolum, løsninger og forebyggende tips.
- Mens væsken løper gjennom apparatet, se etter følgende:
- Når det er en jevn middelstrøm fra effluksrøret, roterer du fraksjonskollektorhodet for å dispensere inn i rørene, og starter fraksjonssamleren. Samle de første 15 fraksjonene (30 min) som vask for å la pseudoisletene balansere. Bruk disse første 15 fraksjonene for å sikre kontinuerlig og nøyaktig mediumstrøm gjennom systemet. Kast disse fraksjonene etterpå.
- I løpet av 30 minutters vask, sett opp mikroskopet for levende celleavbildning i henhold til disse parametrene: objektivlinse: U Plan Fluorite 20x med 1x zoom; fluorescenskanaler: EGFP (utslipp = 510 nm, laserbølgelengde = 488, deteksjonsbølgelengde = 500-600 nm); tidsserier: bilde oppnådd hver 2 s for hele eksperimentet (dvs. 56 min); Samplingshastighet: 2 μs/piksel.
- Identifiser bunnen av pseudoislets i synsfeltet og juster fokalplanet til 15 μm over denne posisjonen. Dette er rammen som vil bli brukt gjennom hele bildeeksperimentet.
- Når 30 min vask er fullført, begynner fraksjonsinnsamling og bildeinnsamling.
MERK: Alle anstrengelser bør gjøres for å identifisere og rette opp eventuelle problemer før dette trinnet. Når datainnsamlingen begynner, kan eventuelle pauser i eksperimentet eller overdreven eksponering for sekretagoger påvirke resultatene negativt. - Fortsett perifusing av pseudoislets med baseline medium i løpet av den første baseline samlingen, samle avløpsvannet i 1,5 ml rør. Bytt slangen fra baselinebufferen for hånd til det nye stimulusbufferrøret når tidspunktet passer for eksperimentet.
- En standard mikroperifusjonssekvens er vist i tabell 3.
- Etter å ha samlet ~ 10 fraksjoner, legg alle fraksjonene i et kjøleskap på 4 ° C til slutten av forsøket for å forhindre nedbrytning av hormonene, spesielt glukagon.
- Fortsett å overvåke systemflyten gjennom hele eksperimentet ved å kontrollere avløpsvannvolumet i hvert rør.
- Når eksperimentet er fullført, bytt tilbake til basismediet og la pumpen fortsette å gå i 5 minutter for å vaske ut stimulansen med baseline medium (i dette tilfellet 2 ml glukose).
- Stopp pumpen, og koble fra holderslangen til mikrobrikken ved de-bobleren og fraksjonssamleren for å fjerne mikrochipholderen fra miljøkammeret. Lukk alle dørene etter at du har fjernet mikrochippen for å opprettholde temperaturen.
- Oppbevar perifusatene ved -80 °C for påfølgende hormonanalyse.
7. Ekstraksjon av pseudoislet syreetanol
- Åpne forsiktig mikrochipholderen og løft av toppen av mikrobrikken. Bruk pipette og stasjonær mikroskop til å plukke pseudoislets ut av brønnen og overføre dem til et 1,5 ml rør. Sørg for innsamling av alle pseudoislets ved hjelp av et stasjonært mikroskop om nødvendig.
- Ta et siste bilde av pseudoøyene i mikrobrikken før du tar det ut av brønnen for å justere holmeekstraktet IEQ, tilsvarende i trinn 5.5.
- Vask to ganger med 500 μL PBS. Spinn ned pseudoisletene i 1 min ved 94 x g mellom hver vask, og aspirer av supernatanten.
- Etter å ha fjernet den siste vasken, tilsett 200 μL syreetanol (5,5 ml 95% etanol + 50 μL 12 N HCl). Oppbevares ved 4 °C over natten.
- Neste dag, spinn ned ekstraktene i 10 minutter ved 15 989 x g og 4 ° C. Aliquot 45 μL i tre nye rør. Oppbevares ved -80 °C for analyse av hormoninnhold. Som et alternativ til å normalisere hormonsekresjonen til IEQ, kan hormonsekresjonen også normaliseres til pseudoislethormoninnholdet målt fra ekstraktene.
8. Ytterligere eksperimenter og opprydding
- Gjenta trinn 5–7 med påfølgende grupper av pseudoister for å få flere tekniske replikater.
- Etter å ha fullført alle mikroperifusjonseksperimentene, kjør 10% blekemiddel gjennom mikrochip og slange i 5 minutter og deretter ultrarenset vann i 30 minutter for å rense slangen.
9. Analyse av data
MERK: Levende celleavbildning ble utført ved hjelp av et laserskanning konfokalmikroskop. Bildene ble analysert ved hjelp av mikroskop-assosiert bildebehandling programvarepakke. Følgende er generelle retningslinjer, men kan variere avhengig av mikroskopprodusenten og programvaren for bildeopptak.
- Bestemme de totale øyekvivalenter (IEQ) for datanormalisering
- Åpne programvaren, og klikk på Oppkjøp-fanen øverst til høyre i vinduet. Batchbrenn i alle mørke feltbilder ved å velge Batch burn in-funksjonen i Macro Manager (View > Tool Windows > Macro Manager).
- For å brenne flere bilder samtidig, klikk på Bytt batchmodus-knappen før du klikker på Kjør-knappen i makrobehandleren. Følg instruksjonene på skjermen for å velge kildebildeplassering og destinasjonssted for de brente bildene. For bildefiltypen velger du Tagged Imagine File Format (*.tif).
- For IEQ-målingen åpner du den brente versjonen av 10x mørkefeltbildet tatt i trinn 5.1. Klikk på fanen Tell og mål øverst, og velg knappen Manuell HSV-terskel til venstre.
- Bruk dropperfunksjonen til å legge til / fjerne det positive området (i rødt) til hver pseudoislet er uthevet i rødt, uten å strekke seg forbi pseudoisletgrensen. Klikk på Tell og mål.
- Bruk funksjonene for automatisk splitting eller manuell deling til å dele pseudosettene som ble sammenføyd.
- Hvis du vil dele pseudoisletene manuelt, velger du manuell delingsfunksjon, venstreklikker for å tegne en linje som skiller pseudoisletene, og høyreklikker deretter for å fullføre linjen. For å dele automatisk, velg auto-splitt-funksjonen, og klikk på de grupperte pseudoislets av interesse. Bekreft riktig automatisk splitt etterpå.
- I partibrennede bilder kan skalalinjen og forstørrelsesteksten være merket som positive. Slett disse objektene for en nøyaktig telling ved å markere tekst- og skaleringslinjen med musen og trykke på Slett tastaturtast.
- Slå filteret på og av for å bekrefte at alle pseudoisletene telles. Filen kan også åpnes utenfor programmet for kryssreferanse. Når du er ferdig, klikker du på Eksporter til Excel.
- Åpne regnearket, og endre det på følgende måte.
- Slett antalls-, gjennomsnitts- og sorteringsinformasjonen nederst. Sorter objektene basert på deres gjennomsnittlige diameter. Sett inn en kolonne etter middeldiameteren, og gi kolonnen navnet "Pseudoislet count".
- Holmetallet bestemmes av antall småøyer med middeldiameter som faller innenfor hver indeks under. Multipliser antall pseudoislets per indeks med den respektive IEQ-konverteringsfaktoren, og summer disse verdiene for å bestemme den totale IEQ. Utfør IEQ-beregningene på bildene som er oppnådd før hvert eksperiment. Bruk følgende indekser og IEQ-konverteringsfaktorer:
1-49 μm: × 0,167
50-100 μm: × 0,667
101-150 μm: × 1.685
151-200 μm: × 3.500
201-300 μm: × 6.315
301-350 μm: × 10.352 - Hvis du vil ha et eksempel på regneark for fastsettelse av IEQ-antall, kan du se Tilleggsfil 1.
- Åpne programvaren, og klikk på Oppkjøp-fanen øverst til høyre i vinduet. Batchbrenn i alle mørke feltbilder ved å velge Batch burn in-funksjonen i Macro Manager (View > Tool Windows > Macro Manager).
- Kvantifisering av levende celleavbildning i programvare
- Åpne ønsket fil (.oir) i cellSens.
- Angi interesseområdene (ROI) som følger.
- Bruk tegneverktøyene til å angi avkastningen (dvs. hver pseudoislet). Hvis du bruker alternativet for frihåndstegning, høyreklikker du for å lukke figuren.
- all avkastning ved å bruke pilhånden og dra den for å omfatte all avkastning i bildet. Med all avkastningen uthevet, høyreklikk og velg Konverter til dynamisk avkastning over tid
- Spill av XYT-filen for å bekrefte at avkastningen er nøyaktig over tid. Hvis avkastningen ikke er nøyaktig i en bestemt periode, må du korrigere størrelsen/plasseringen i den perioden. Programvaren vil gradvis justere avkastningens størrelse / plassering over tid for å matche disse endringene. Gjenta disse trinnene til avkastningen er nøyaktig gjennom hele bildeeksperimentet.
- Utfør intensitetsmålinger på hver avkastning som følger.
- I verktøylinjen klikker du på Mål intensitetsprofil. Fremhev avkastningen som skal analyseres; bruk Shift + klikk for å velge flere avkastninger.
MERK: Selv om flere filer kan være åpne om gangen i programvaren, analyserer du bare avkastningen fra én fil om gangen. - Hvis du vil ta hensyn til bakgrunnsstøy, velger du en konstant verdi som skal trekkes fra hver intensitetsverdi, eller angir én avkastning som bakgrunn. Klikk på Utfør.
- I verktøylinjen Intensitetsprofil klikker du på Eksporter til Excel for å eksportere dataene.
- Normaliser alle datapunktene til gjennomsnittet av intensitetene målt fra 7-8 min (dvs. det siste minuttet av den første baseline medium perifusjon). Disse normaliserte verdiene ved hvert tidspunkt er definert som den relative cADDis-intensiteten. Hvis du vil ha et eksempel på et regneark med analyse og normalisering av bildedata, kan du se tilleggsfil 2.
- I verktøylinjen klikker du på Mål intensitetsprofil. Fremhev avkastningen som skal analyseres; bruk Shift + klikk for å velge flere avkastninger.
- Mål hormonsekresjonen i hver fraksjon og holmeekstrakt. I disse forsøkene ble insulin- og glukagonkonsentrasjoner målt ved ELISA. Normaliser hormonsekresjonen i hver fraksjon til pseudoisletvolumet ved hjelp av IEQ-målingene bestemt i trinn 9.1 eller av ekstrakthormoninnholdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biosensor-uttrykkende humane pseudoislets ble opprettet via adenoviral levering av konstruksjoner som koder for cAMP biosensor cADDis (figur 1A). Figur 1B viser reaggregering av de transduserte humane øyceller over tid, med fullt dannede pseudoislets observert etter 6 dager med kultur. Cellene begynte å vise synlig cADDis-fluorescens innen 48 timer, og det var høyt biosensoruttrykk i transduserte celler ved slutten av kulturperioden. Ved hjelp av denne protokollen viste pseudoislets en gjennomsnittlig transduksjonseffektivitet på 60% i alfa-celler og 95% i beta-celler (figur 1C-D).
Den integrerte mikrofluidiske og levende cellebildeplattformen er uthevet i figur 2. Etter å ha høstet cADDis-uttrykkende pseudoislets og latt dem ruge i friskt medium over natten, ble pseudoislets lastet inn i midten av en forfuktet brønn på en mikrochip. Mikrochippen ble deretter klemt fast i en holder og plassert på et mikroskoptrinn. Inne i miljøkammeret festet til mikroskopet, som ble opprettholdt ved 37 ° C, ble pseudoislets perifused med medier som inneholder alfa- og betacellesekretagoger, som ble pumpet gjennom en de-bubbler for å forhindre innføring av luftbobler i systemet. Pseudoisletene i mikrobrikken ble perifundert med en strømningshastighet på 100 μL/min, og avløpsvannet ble samlet med 2 minutters mellomrom via en fraksjonskollektor (figur 2A-B). Glassbunnen av mikrochipbrønnen gjør det mulig å fange cADDis-fluorescensintensiteten til flere pseudoisleter i et synsfelt, noe som er avgjørende for senere analyse (figur 2C).
Figur 3 viser representative resultater ved bruk av den beskrevne protokollen med cADDis-uttrykkende pseudoislets generert fra innfødte øyer isolert fra tre humane donorer uten diabetes. De cADDis-uttrykkende pseudoisletene ble perifundert med 2 mM glukose (G 2), 20 mM glukose pluss fosfodiesterasehemmeren isobutylmetylxanthin (IBMX; G 20 + IBMX), og 2 mM glukose pluss adrenalin (G 2 + Epi). Denne protokollen fremkaller kjente intracellulære veier som forbedrer cAMP i alfa- og beta-celler (figur 3A-B). Mikroperifusjonsoppsettet letter den synkrone samlingen av den intracellulære cAMP-dynamikken gjennom cADDis-fluorescens og hormonsekresjon (figur 3C-E). For å sikre eksperimentell strenghet ble eksperimenter på pseudoislets utført fra samme donor med to til tre replikater, og de samlede verdiene er plottet i figur 3C-E, D', E '. Ved eksponering for G 2 var den relative cADDis-intensiteten lav og stabil, og det samme var insulinsekresjonen (figur 3C-D). Når pseudoisletene ble eksponert for G 20 + IBMX, var det en robust økning i den intracellulære cAMP-konsentrasjonen, noe som fremgår av en økning i den relative cADDis-intensiteten (figur 3C). Denne økningen skyldtes mest sannsynlig både beta- og alfaceller, som demonstrert ved samtidig markerte økninger i både insulin- og glukagonsekresjon (figur 3D-E). Pseudoislets eksponering for G 2 + Epi økte den intracellulære cAMP-konsentrasjonen (figur 3C), og dette var assosiert med økt glukagonsekresjon (figur 3E). Observasjonen om at cAMP-responsen på G 2 + Epi var relativt mindre sammenlignet med IBMX-responsen, kan ha oppstått på grunn av en kombinasjon av den lavere transduksjonseffektiviteten til cADDis adenovirale konstruksjon i alfaceller versus betaceller (figur 1D) og alfacellespesifisiteten til dette signalet (figur 3E). Derfor, basert på kjente cAMP-medierte signalveier i primære humane beta- og alfaceller, demonstrerer denne protokollen vellykket nytten av denne integrerte plattformen for samtidig å undersøke den relative fluorescensintensiteten til cADDis-biosensoren og beta- og alfacellehormonsekretoriske profiler på tvers av tekniske og biologiske replikater.
Figur 1: Dannelse av biosensor-uttrykkende humane pseudoisleter. (A) Skjematisk visning som viser primær menneskelig holme dissosiasjon, transduksjon med biosensorkonstruksjonen i en enkeltcelletilstand og reaggregering. Etter reaggregering høstes pseudoisletene og gjennomgår synkron levende celleavbildning og mikroperifusjon. Protokolltrinnene er angitt gjennom hele skjemaet. (B) Representative bilder som fanger dannelsen av en cADDis-uttrykkende pseudoislet i løpet av en 6-dagers reaggregeringsperiode; Øverst: Brightfield med kontrast, nederst: cADDis fluorescens. Skalastangen er 100 μm. (C) Representative bilder av en cADDis-uttrykkende pseudoislet (grønn) med alfa- og betaceller visualisert ved henholdsvis C-peptid (CPEP, blå) og glukagon (GCG, rød) merking. DAPI (hvit) ble brukt som en kjernefysisk motflekk. De hvite pilene markerer de transduserte alfa- og betacellene. Den gule pilen peker på en utransdusert alfacelle. Skalastangen er 100 μm. (D) Kvantifisering av transduksjonseffektiviteten ved MOI 1000 i beta- og alfa-celler ved hjelp av en HALO cytonukleær algoritme (N = 2 donorer, med gjennomsnittlig 601 betaceller og 627 alfaceller analysert per donor på tvers av flere pseudoislets). Feilfeltene angir standardfeilen til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Integrert levende celleavbildning og mikroperifusjonssystem. (A) Oversikt over komponentene i levende celleavbildning og mikroperifusjonssystem. Pseudoislets i en mikrochip er plassert på scenen av et konfokal laserskanningsmikroskop innelukket i et miljøkammer. Denne konfigurasjonen tillater tidsmessig oppløsning angående de intracellulære endringene i biosensorfluorescens under den dynamiske responsen på en serie veldefinerte sekretagoger og samlingen av pseudoislet perifusatfraksjoner for synkron måling av hormonsekresjonen for videre integrasjon med intracellulære signaleringshendelser. (B) Komponentene i den mikrofluidiske plattformen utenfor miljøkammeret. Væskedireksjonaliteten er som følger: (1) sekretagogholdige rør til (2) 0,01 i rør til (3) peristaltisk pumperør (0,02 i indre diameter) til (4) 0,01 i rør til (5) de-bubbler til (6) mikrochipinntak (0,01 i rør) til (7) mikrochipholder / mikrochip til (8) mikrochiputtak (0,01 i rør). Merk: 0,01 i slangen er forbundet med det peristaltiske pumpeslangen med koniske adaptere (hvite pilspisser). Slangen er koblet til de-bubbler via en mutter og ferrule (grønn pilspiss). Den stiplede røde linjen viser tilkoblingen mellom komponentene. (C) Nærbilde av mikrochip og holder i miljøkammeret montert på konfokalmikroskopstadiet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Human pseudoislet cAMP og hormonsekresjonsdynamikk. (A) Skjemaer av sekretagogindusert cADDis-fluorescens og hormonsekresjon i beta- og alfaceller. I betaceller binder adrenalin (Epi) G i-koblede alfa 2-adrenerge reseptorer, noe som fører til inhibering av adenylylsyklase (AC), redusert cAMP og redusert insulinsekresjon. I alfa-celler stimulerer Epi G s-koblede beta 1-adrenerge reseptorer, noe som fører til aktivering av AC og en økning i intracellulær cAMP. I begge celletyper forhindrer IBMX, en fosfodiesterase (PDE) hemmer, nedbrytning av intracellulær cAMP og fremmer hormonsekresjon. Bindingen av fri intracellulær cAMP forårsaker konformasjonsendringer i cADDis-proteinet, og forårsaker dermed en økning i fluorescensintensiteten. (B) Representative bilder av cADDis-uttrykkende pseudoisleter under levende celleavbildning som respons på G 2 (2 mM glukose), G 20 + IBMX (20 mM glukose + IBMX) og G 2 + Epi (2 mM glukose + Epi). Pseudoislets er skissert i hvitt, og sekretagogtypen er angitt øverst til venstre. Skalastangen er 50 μm. (C) Relativ cADDis-fluorescens over tid gjennomsnittet over cADDis-uttrykkende pseudoislets laget av menneskelige øyer fra tre organdonorpreparater. (D) Samlet insulin og (E) glukagonsekresjon som respons på de angitte sekretagogene. Dataene normaliseres til holmevolumet, uttrykt i holmekvivalenter (IEQ). Pseudoisletene ble fremstilt fra tre menneskelige øydonorer og analysert ved hjelp av to til tre tekniske replikater/donor. Øycellene ble transdusert med cADDis adenoviral konstruksjon ved MOI 500 (N = 1) eller 1000 (N = 2). (D',E') Pseudoislet hormoninnhold. Feilfeltene angir standardfeilen til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Donordemografi. Sammendrag av demografisk informasjon om donorer for de menneskelige øyene som ble brukt under fremstillingen av pseudoislets med cADDis biosensoruttrykk og levende celleavbildning. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Feilsøkingsveiledning. Utfordringer som kan oppstå, fremheves, inkludert en liste over vanlige årsaker til problemer, løsninger og forebyggingsteknikker. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 3: Mikroperifusjonsprotokoll. Et eksempel på mikroperifusjonsprotokoll som brukes til forsøkene som er fremhevet i de representative resultatene. Denne protokollen er spesielt rettet mot samregistrering av intracellulær cAMP og øyhormonsekresjon; Alternative protokoller kan være mer hensiktsmessige avhengig av det intracellulære molekylet av interesse og/eller den valgte biosensordynamikken. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfil 1: Beregningen av holmekvivalenter (IEQ). Et eksempel på hvordan du beregner IEQ for pseudoislets som brukes i hvert eksperiment. Dataene i ark 1 (1. Objektmålinger) inkluderer objektdata eksportert direkte fra programvaren (se trinn 9.1). Den grønne uthevede kolonnen settes inn for å telle antall pseudoblader som faller innenfor hver indeks i trinn 9.1.6.2. Tellingene kopieres til ark 2 (2. IEQ-beregning) og konvertert til IEQ ved å bruke riktig omregningsfaktor per indeks. Ethvert pseudoislettap under chiplasting (In-chip pseudoislet #) og før fjerning av ekstrakter (Post-run pseudoislet #) kan regnskapsføres ved hjelp av bildene tatt i disse fasene (se henholdsvis trinn 5.5 og trinn 7.1.1). Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Dataanalyse. Et eksempel på hvordan man beregner den relative cADDis-intensiteten fra dataene oppnådd i trinn 9.2. Rådataene i kolonnene D-F eksporteres direkte fra programvaren. Råverdiene ved hvert tidspunkt normaliseres til gjennomsnittsintensiteten i siste minutt av baseline medium (G 2; 7-8 min i protokollen). Den gjennomsnittlige intensiteten over alle pseudoisletene over tid beregnes for å generere grafen i figur 2C. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Integrasjonen av et mikroperifusjonssystem, biosensoruttrykkende pseudoisleter og laserskanning konfokalmikroskopi muliggjør synkron vurdering av intracellulære signalhendelser og dynamiske hormonsekretoriske profiler. Det dynamiske mikroperifusjonssystemet kan levere en rekke veldefinerte stimuli til pseudoisletene og muliggjør oppsamling av avløpsvannet, der insulin- og glukagonkonsentrasjonene kan måles ved kommersielt tilgjengelig ELISA. Samtidig fanger levende celleavbildning av biosensoruttrykkende pseudoislets av en konfokal mikroskopiplattform sanntids biosensorfluorescensaktivitet, som gir informasjon om intracellulære signaleringshendelser. Samtidig måling av biosensorsignalet og hormonsekretorisk profil over tid gir mulighet til direkte å sammenligne påvirkningen av intracellulære signalhendelser på øyhormonsekresjon.
Flere hensyn er nøkkelen til suksessen til den presenterte protokollen. Disse inkluderer generering av biosensoruttrykkende pseudoislets og bruk av en konstant strømningshastighet under hvert eksperiment uten pseudoisletbevegelse. Ved en strømningshastighet på 100 μL/min og med 2 min fraksjonsoppsamling er perifusatvolumet for hver fraksjon 200 μL og bør ikke svinge med mer enn 10 μL/fraksjon. I tillegg, mens bildebehandlingsprogramvaren kan tilpasse seg mindre pseudoisletbevegelser i XY-planet innenfor synsfeltet, kan pseudoislets som beveger seg ut av synsfeltet i løpet av mikroperifusjonseksperimentet ikke analyseres. Det er derfor viktig å oppdage eventuelle lekkasjer og bevegelser tidlig i forsøket, slik at det kan gjøres forsøk på å løse problemet. Et sammendrag av de potensielle utfordringene, deres vanlige årsaker, løsninger og tips for å forhindre at de oppstår, er oppsummert i tabell 2. Likevel inneholder denne protokollen flere muligheter til å forutse problemer, for eksempel å utføre et testeksperiment før lasting av brikken (trinn 2.3) og overvåke pseudoislets for betydelig bevegelse via et mikroskop i løpet av 30 minutters vaskeperiode før bildeinnsamling og mikroperifusjonsfraksjonsinnsamling (trinn 6.4-6.5).
En begrensning er at synsfeltet på den nåværende konfokale mikroskopiplattformen ikke tillater at alle pseudoislets i mikrochipet fanges samtidig. Mens minst 30 pseudoisleter kreves for pålitelig påvisning av insulin og glukagon i mikroperifusatene, kan bare en delmengde avbildes ved 20x forstørrelse. Ved å laste pseudoislets inn i midten av brønnen maksimeres tallet som kan fanges i synsfeltet. I tillegg, mens mikrochip er utstyrt med tre brønner, begrenser integrasjonen med konfokalmikroskopi målingene til en brønn om gangen, noe som betyr at tekniske replikater må gjøres i serie i stedet for parallelt. Videre registrerer denne nåværende tilnærmingen hele pseudoisletfluorescensen med alfa- og betacellespesifikke sekretoriske utganger; Dette kan imidlertid modifiseres for direkte å måle endringer i alfa- eller betacelle intracellulære hendelser ved hjelp av cellespesifikk målretting av genetisk kodede biosensorer. Mens bare insulin og glukagonsekresjon ble vurdert i denne protokollen, kan fremtidige studier også måle sekresjonen av andre øyhormoner, for eksempel somatostatinsekresjon fra deltaceller. Merk at somatostatin på dette tidspunktet bare kan påvises med denne plattformen som svar på svært stimulerende sekretagoger som IBMX. Til slutt mangler isolerte øyer og pseudoislets den nevrovaskulære arkitekturen til øyer in vivo, noe som har vist seg å påvirke øyfunksjonen direkte.
Avslutningsvis gir den beskrevne plattformen en strategi for å synkronisere vurderingen av intracellulære signalhendelser ved bruk av biosensor og hormonsekresjon. Dette systemet kan tilpasses ytterligere for å undersøke funksjonelle forstyrrelser introdusert av RNA-interferens (siRNA eller shRNA) eller CRISPR-medierte genmålrettingsstrategier. Disse metodene kan brukes til å bestemme de biologiske effektene av veier av interesse på en rekke intracellulære eller ekstracellulære hendelser ved bruk av genetisk kodede biosensorer utenfor cADDis, som tidligere har blitt demonstrert for GCaMP6f7. I tillegg vil den selektive transduksjonen av en bestemt celletype og / eller eksponering for cellespesifikke stimuli tillate målrettet undersøkelse av intracellulære signalhendelser av en bestemt celletype innenfor rammen av den menneskelige øyen. For eksempel kan alfaceller fra humane bukspyttkjerteløyer renses ved hjelp av celleoverflatemarkører og deretter transduceres med den ofte brukte genetisk kodede kalsiumbiosensoren GCaMP for å vurdere den intracellulære kalsiumdynamikken. Disse viralt transducerte cellene kan deretter rekombineres med andre utransducerte øyceller for å danne pseudoislets eller overlates til å reaggregere på egen hånd for å generere alfacelleberikede pseudoislets som sammensetningsmessig ligner øyer i type 1 diabetes. Denne tilnærmingen er forskjellig fra mer konvensjonelle teknikker, der intracellulære molekyler som Ca 2+ måles ved hjelp av lastede Ca2+-sensitive fargestoffer og celleidentiteten bestemmes etter levende celleavbildning ved immunfarging eller andre midler15. Alternativt gjøres målinger i encelletilstand, hvor påvirkningen av parakrin signalering på øycellefunksjonen går tapt15. Dermed overvinner denne levende celleavbildningen integrert med et pseudoislet-system og mikroperifusjonsplattform tidligere utfordringer innen holmebiologi, samtidig som kunnskapen om integrerte cellulære prosesser utvides.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Organdonorer og deres familier er verdsatt for sine uvurderlige donasjoner, og International Institute for Organ Procurement Organizations, Advancement of Medicine (IIAM) og National Disease Research Exchange (NDRI) er anerkjent for deres partnerskap i å gjøre humant bukspyttkjertelvev tilgjengelig for forskning. Dette arbeidet ble støttet av Human Islet Research Network (RRID: SCR_014393), Human Pancreas Analysis Program (RRID: SCR_016202), DK106755, DK123716, DK123743, DK120456, DK104211, DK108120, DK112232, DK117147, DK112217, EY032442 og DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center), Leona M. og Harry B. Helmsley Charitable Trust, JDRF, US Department of Veterans Affairs (BX000666), NIGMS fra National Institutes of Health (T32GM007347), F30DK134041, F30DK118830 og National Science Foundation Graduate Research Fellowship (1937963).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
- Tokarz, V. L., MacDonald, P. E., Klip, A. The cell biology of systemic insulin function. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2273-2289 (2018).
- Yu, Q., Shuai, H., Ahooghalandari, P., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose controls glucagon secretion by directly modulating cAMP in alpha cells. Diabetologia. 62 (7), 1212-1224 (2019).
- Hughes, J. W., Ustione, A., Lavagnino, Z., Piston, D. W. Regulation of islet glucagon secretion: Beyond calcium. Diabetes, Obesity and Metabolism. 20, 127-136 (2018).
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Halban, P. A., et al. β-cell failure in type 2 diabetes: Postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 99 (6), 1983-1992 (2014).
- Brissova, M., et al. α cell function and gene expression are compromised in type 1 diabetes. Cell Reports. 22 (10), 2601-2614 (2018).
- Walker, J. T., et al. Integrated human pseudoislet system and microfluidic platform demonstrate differences in GPCR signaling in islet cells. JCI Insight. 5 (10), e06990 (2020).
- Giannoukakis, N., et al. Infection of intact human islets by a lentiviral vector. Gene Therapy. 6 (9), 1545-1551 (1999).
- Curran, M. A., et al. Efficient transduction of pancreatic islets by feline immunodeficiency virus vectors1. Transplantation. 74 (3), 299-306 (2002).
- Kayton, N. S., et al. Human islet preparations distributed for research exhibit a variety of insulin-secretory profiles. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 308 (7), E592-E602 (2015).
- Cabrera, O., et al. high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function. Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2007).
- Lenguito, G., et al. Resealable, optically accessible, PDMS-free fluidic platform for ex vivo interrogation of pancreatic islets. Lab on a Chip. 17 (5), 772-781 (2017).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New DAG and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. Journal of Biomolecular Screening. 21 (3), 298-305 (2015).
- Tengholm, A. Cyclic AMP dynamics in the pancreatic β-cell. Upsala Journal of Medical Sciences. 117 (4), 355-369 (2012).
- Klemen, M. S., Dolenšek, J., Rupnik, M. S., Stožer, A. The triggering pathway to insulin secretion: Functional similarities and differences between the human and the mouse β cells and their translational relevance. Islets. 9 (6), 109-139 (2017).
