Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل شبه آلي للجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام مفكك الأنسجة

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65265
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 2, 2
1Division for Health Service Promotion, The University of Tokyo, 2Department of Diabetes and Metabolic Diseases, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 3The University of Tokyo Excellent Young Researcher Program, The University of Tokyo

Summary

يصف هذا البروتوكول العزل شبه الآلي للجزء الوعائي اللحمي (SVF) من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا الدهنية وتحقيق تمايز الخلايا الشحمية في المختبر. استخدام مفكك الأنسجة لهضم كولاجيناز يقلل من التباين التجريبي ويزيد من التكاثر.

Abstract

تتيح الدراسة المختبرية لتمايز الخلايا الشحمية ذات اللون الأبيض والبني والبيج التحقيق في وظائف الخلايا الشحمية المستقلة للخلايا الشحمية وآلياتها. خطوط خلايا preadipocyte البيضاء الخالدة متاحة للجمهور وتستخدم على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن ظهور الخلايا الشحمية البيج في الأنسجة الدهنية البيضاء استجابة للإشارات الخارجية يصعب تلخيصه إلى أقصى حد باستخدام خطوط خلايا الخلايا الشحمية البيضاء المتاحة للجمهور. عادة ما يتم تنفيذ عزل الجزء الوعائي اللحمي (SVF) من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا الأولية الأولية وإجراء تمايز الخلايا الشحمية. ومع ذلك ، فإن فرم وهضم كولاجيناز الأنسجة الدهنية باليد يمكن أن يؤدي إلى تباين تجريبي ويكون عرضة للتلوث. هنا ، نقدم بروتوكولا شبه آلي معدل يستخدم مفكك الأنسجة لهضم الكولاجيناز لتحقيق عزل أسهل ل SVF ، بهدف تقليل التباين التجريبي وتقليل التلوث وزيادة قابلية التكاثر. يمكن استخدام الخلايا الشحمية التي تم الحصول عليها والخلايا الشحمية المتمايزة للتحليلات الوظيفية والآلية.

Introduction

تجذب بيولوجيا الأنسجة الدهنية اهتماما متزايدا بسبب الانتشار المتزايد للسمنة ومرض السكري من النوع 2 على مستوىالعالم 1. تخزن الخلايا الشحمية الطاقة الزائدة في شكل قطرات دهنية ، يتم إطلاقها عند الجوع. علاوة على ذلك ، تحافظ الأنسجة الدهنية على توازن الطاقة الجهازية من خلال العمل كعضو في الغدد الصماء والتواصل مع الأنسجة الأخرى 2,3. ومن المثير للاهتمام أن كلا من الأنسجة الدهنية الزائدة (السمنة) وفقدان الدهون (الحثل الشحمي) مرتبطان بمقاومة الأنسولين ومرض السكري1. تنقسم الخلايا الشحمية إلى ثلاثة أنواع: الأبيض والبني والبيج1. تخزن الخلايا الشحمية البيضاء بشكل أساسي الطاقة الزائدة كدهون ، بينما تبدد الخلايا الشحمية البنية والبيج الطاقة في شكل حرارة عبر بروتين فصل الميتوكوندريا -1 (Ucp1) 1,4. والجدير بالذكر أن الخلايا الشحمية البيج (وتسمى أيضا الخلايا الشحمية البنية "المستحثة") تظهر في الأنسجة الدهنية البيضاء استجابة للتحفيز البارد أو الودي وتظهر أنماط التعبير الجيني التي تتداخل مع ولكن تختلف عن تلك الموجودة في الخلايا الشحمية البنية "الكلاسيكية"5. في الآونة الأخيرة ، تم توقع الخلايا الشحمية البنية والبيج كأهداف محتملة للعلاجات المضادة للسمنة ومكافحة مرض السكري التي تهدف إلى "تعزيز تبديد الطاقة" بدلا من "قمع استهلاك الطاقة"4. بشكل داعم ، تم الإبلاغ عن أن أليل الخطر لمتغير السمنة FTO rs1421085 في البشر ، والذي يظهر أقوى ارتباط مع ارتفاع مؤشر كتلة الجسم (BMI) بين المتغيرات الشائعة6,7 ويعرض تفاعلات مختلفة بين الجينات والبيئة 8,9 ، ينظم سلبا تمايز الخلايا الشحمية البيجووظيفتها 10. يعرف γ المستقبلات المنشط بتكاثر البيروكسيسوم (PPARγ) بأنه منظم النسخ الرئيسي لتكوين الدهون وهو ضروري وكاف لتمايز الخلايا الشحمية11. تعتبر منظمات النسخ ، مثل المجال المتماثل PRD1-BF1-RIZ1 الذي يحتوي على 16 (PRDM16) ، وعامل الخلية البائية المبكر 2 (EBF2) ، والعامل النووي I-A (NFIA) ، ضرورية لتمايز الخلايا الدهنية البنية والبيج ووظيفتها12،13،14،15،16،17،18. من ناحية أخرى ، تتطلب برمجة جينات الخلايا الشحمية البيضاء منظمات نسخية ، مثل بروتين محسن يشبه محول الطاقة 3 (TLE3) وبروتين إصبع الزنك 423 (ZFP423) 19،20،21.

تتيح أنظمة النماذج في المختبر إجراء الدراسات الجزيئية التي تهدف إلى تحسين فهم الآلية (الآليات) الكامنة وراء وظائف واختلالات الخلايا الشحمية. على الرغم من وجود خطوط خلايا preadipocyte المتاحة للجمهور والخالدة مثل 3T3-L1 و 3T3-F442A22،23،24 ، فإن ثقافة الخلايا الأولية الأولية والتمايز إلى الخلايا الشحمية ستكون نموذجا أكثر ملاءمة للدراسة في تكوين الدهون في الجسم الحي. يعد عزل الجزء الوعائي اللحمي (SVF) من الأنسجة الدهنية للفئران طريقة معروفة للحصول على الخلايا الأولية25,26. ومع ذلك ، فإن هضم كولاجيناز للأنسجة الدهنية ، والذي يتم إجراؤه عادة باستخدام شاكر بكتيري مع رف أنبوبي ، يمكن أن يؤدي إلى تباين تجريبي ويكون عرضة للتلوث27,28. هنا ، نصف بروتوكولا بديلا يستخدم جهاز فك أنسجة فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) اللطيف لهضم كولاجيناز لتحقيق عزل أسهل ل SVF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC) بجامعة طوكيو وتم إجراؤها وفقا للإرشادات المؤسسية لجامعة طوكيو.

1. إعداد محلول الانزيم والمتوسطة

  1. ضع جانبي الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (الجانب الأيمن والأيسر ، حوالي 150 ملغ) من فأر عمره 7-8 أسابيع و 2.5 مل من محلول الإنزيم في الأنبوب C من المنفصل.
  2. إعادة تكوين الإنزيم D مع 3 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) / F12 بدون مصل بقري جنيني (FBS) أو مضادات حيوية ، والإنزيم R مع 2.7 مل من DMEM / F12 بدون FBS أو المضادات الحيوية ، والإنزيم A مع 1 مل من المخزن المؤقت A.
  3. تحضير 2.5 مل من محلول الإنزيم بإضافة 100 ميكرولتر من الإنزيم D ، و 50 ميكرولتر من الإنزيم R ، و 12.5 ميكرولتر من الإنزيم A ، و 2.35 مل من DMEM / F12 بدون FBS أو المضادات الحيوية في الأنبوب C. ضع الأنبوب C بمحلول الإنزيم على الجليد.

2. عزل الأنسجة الدهنية

  1. القتل الرحيم لذكور الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 7-8 أسابيع (حوالي 20 جم) عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. على مقعد نظيف ، لعزل الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية ، قم بقص الجلد بمقص حاد / حاد في البطن ونحو الأطراف السفلية. عزل الأنسجة الدهنية من داخل الفخذين باستخدام مقص حاد / حاد. جانب واحد من الأنسجة الدهنية الأربية يزن ~ 75 ملغ.
  3. ضع الأنسجة الدهنية المعزولة في الأنبوب C مع محلول الإنزيم على الثلج ، واحتفظ بالأنبوب داخل المقعد النظيف للحفاظ على العقم.

3. فرم وهضم الأنسجة الدهنية

  1. في المقعد النظيف ، أضف 2.5 مل من محلول الإنزيم إلى الأنبوب C.
  2. فرم الأنسجة الدهنية إلى قطع صغيرة عن طريق قصها بمقص حاد / حاد 50 مرة. قطع الأنسجة الدهنية إلى ~ 2 مم2 قطعة.
  3. أغلق غطاء الأنبوب C بإحكام ، واقلب الأنبوب رأسا على عقب ، وقم بإرفاقه بأكمام مفكك الأنسجةمع الغطاء. ثم ، هضم العينة لمدة ~ 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: استخدمت هذه الدراسة جهاز فصل OCTO Octo اللطيف مع السخانات (Miltenyi Biotec 130-096-427) ، وتم اتباع البرنامج المثبت مسبقا "37C_mr_ATDK_1".

4. ترشيح تعليق الخلية

  1. قبل التسخين DMEM/F12 يحتوي على 10٪ FBS و1٪ بنسلين-ستربتومايسين إلى 37 درجة مئوية.
  2. افصل الأنبوب C عن مفكك الأنسجة وأوقف الهضم بإضافة 5 مل من DMEM / F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين وسحب الإصبع بلطف أربع مرات.
  3. جهاز طرد مركزي عند 700 × جم لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية.
  4. استنشاق بعناية طاف دون إزعاج بيليه الخلية.
  5. أعد تعليق الحبيبات بإضافة 10 مل من DMEM / F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين وسحب الإصبع بلطف خمس مرات.
  6. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية قطرها 70 ميكرومتر موضوعة على أنبوب جديد سعة 50 مل.
  7. أجهزة الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق الحبيبات في 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).

5. طلاء الخلية

  1. أجهزة الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق.
  2. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات بإضافة 10 مل من DMEM / F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين وسحب الحبيبات عشر مرات.
  3. ضع معلق الخلية على طبق مغطى بالكولاجين مقاس 10 سم وضع الأطباق في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ CO 2) لمدة1-2 ساعة.
    ملاحظة: الأطباق المطلية بالكولاجين ليست مطلوبة تماما. ومع ذلك ، بناء على الخبرة ، تساعد الأطباق المطلية بالكولاجين على التصاق الخلايا السابقة وبالتالي زيادة بقاء الخلايا.
  4. نضح الوسط وغسل الخلايا مرتين مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لكل غسلة.
  5. أضف 10 مل من DMEM / F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين وأعد الأطباق إلى حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).

6. مرور الخلايا السابقة للدم

  1. في اليوم التالي ، قم بنضح الوسط (ستكون الخلايا ملتصقة ، وبالتالي يمكن استنشاق الوسط) ، واغسل الخلايا مرتين باستخدام 3 مل من PBS لكل غسلة ، وأضف 10 مل من DMEM / F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
  2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80٪ (عادة بعد 4 أيام من عزل SVF) ، قسم الخلايا إلى أربعة أطباق مغلفة بالكولاجين مقاس 10 سم.
    1. على وجه التحديد ، قم بنضح الوسط ، واغسل الخلايا باستخدام PBS (درجة حرارة الغرفة [RT]) ، وأضف 1 مل من التربسين بنسبة 0.05٪ قبل التسخين ، واحتضان لمدة 5 دقائق في حاضنة زراعة الخلايا.
    2. أضف 10 مل من DMEM / F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين لإخماد نشاط التربسين. بعد سحب العينات ، أجهزة الطرد المركزي عند 440 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. نضح المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا بإضافة 40 مل من DMEM / F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين ، وقم بطلاء الخلايا في أربعة أطباق مغلفة بالكولاجين مقاس 10 سم.
  3. قم بتمرير الخلايا مرة أخرى عندما تصل إلى التقاء 80٪.

7. إعداد الفيروس القهقري الذي يعبر عن مستضد SV40 T الكبير لتخليد الخلايا السابقة للحرارة (اختياري)

  1. قبل 3 أيام على الأقل من الخلود ، تقوم لوحة Platinum-E (Plat-E) بتعبئة الخلايا29 بكثافة 3.0 × 105 خلايا / مل في 2 مل من DMEM مع 10٪ FBS بدون مضادات حيوية. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا.
  2. في اليوم التالي ، قم بنقل 4 ميكروغرام من pBABE-neo largeTcDNA (أضف جين البلازميد # 1780) باستخدام Lipofectamine 2000 ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. بعد 24 ساعة ، نضح الوسط وإضافة 2 مل من DMEM مع 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
  4. في اليوم التالي ، احصد طاف الفيروس القهقري. يمكن استخدام الفيروس القهقري للتخليد على الفور أو تخزينه عند -80 درجة مئوية.

8. تخليد الخلايا preadipocytes مع مستضد T كبير SV40 (اختياري)

  1. مرور وتوسيع الخلايا preadipocytes مرتين بعد عزل SVF.
  2. صفيحة الخلايا في 6 ألواح جيدة بكثافة 0.5-1.0 × 104 خلايا / مل في 2 مل من DMEM / F12 مع 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا.
  3. في اليوم التالي ، قم بإعداد 250 ميكرولتر من الفيروس القهقري الطازج أو المذاب الذي يعبر عن مستضد SV40 T كبير لكل بئر من الألواح المكونة من 6 آبار. جهاز طرد مركزي عند 440 × جم لمدة 5 دقائق ووضع المادة الطافية في أنبوب جديد.
  4. أضف 750 ميكرولتر من DMEM / F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 1 ميكرولتر من البولي برين لكل 250 ميكرولتر من طاف الفيروس القهقري لصنع الفيروس العامل.
  5. نضح الوسط وإضافة 1000 ميكرولتر من الفيروس القهقري العامل إلى كل بئر يحتوي على الخلايا preadipocytes.
  6. أضف 1 مل من DMEM / F12 مع 10٪ FBS و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين بعد 4 ساعات.
  7. في اليوم التالي ، افصل الخلايا المصابة في طبق 10 سم وحدد الخلايا المصابة ب DMEM / F12 التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 500 ميكروغرام / مل نيومايسين. لمراقبة اختيار المضادات الحيوية ، قم بإعداد طبق من الخلايا غير المصابة بالنيومايسين.
  8. استمر في تمرير الخلايا المصابة بالنيومايسين حتى تموت جميع الخلايا غير المصابة في طبق الشاشة.

9. تمايز الخلايا الشحمية

  1. لوحة الخلايا. بالنسبة لألواح 12 بئرا ، قم بطلاء الخلايا بكثافة 4.0 × 104 خلايا / مل في 1 مل من DMEM / F12 تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
  2. عندما تصبح الخلايا preadipocytes متقاربة (48-72 ساعة بعد الطلاء) ، قم باستنشاق الوسط واستبداله بوسط تمايز (انظر الجدول 1 للتكوين).
  3. في اليوم 2 من التمايز (أي 48 ساعة بعد إحداث التمايز) ، استبدل الوسيط بوسط الصيانة (انظر الجدول 1 للتكوين). بعد ذلك ، قم بتغيير وسيط الصيانة كل 2 أيام. يتم تحقيق التمايز النهائي في اليوم 7 من التمايز.
  4. زيت أحمر o تلطيخ
    1. لتلطيخ الزيت الأحمر ، قم بنضح الوسط وشطف الخلايا ب 1 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من 4 ٪ الفورمالديهايد لكل بئر ، واحتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في RT.
    2. أثناء الحضانة ، قم بتخفيف محلول مخزون الزيت الأحمر بنسبة 0.5٪ (في كحول الأيزوبروبيل) إلى 0.3٪ باستخدام ddH2O وقم بتصفية محلول العمل باستخدام ورق ترشيح.
    3. بعد 15 دقيقة من الحضانة ، قم بإزالة الفورمالديهايد ، وشطف الخلايا بنسبة 60 ٪ من كحول الأيزوبروبيل ، وإضافة 1 مل من محلول العمل الأحمر المصفى ، واحتضان لمدة 1 ساعة في RT.
    4. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا بالماء الجاري. بعد ذلك ، راقب الخلايا الشحمية المحملة بالدهون تحت المجهر المقلوب (التكبير: هدف 20x و 10x عين).
  5. تحليل تعبير الحمض النووي الريبوزي المرسال
    ملاحظة: راجع الجدول 2 للحصول على قائمة البادئات المستخدمة في هذه الدراسة.
    1. نضح الوسط وإضافة 1 مل / بئر من التريزول إلى البئر.
    2. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT ، وفصل الخلايا عن طريق ماصة ، وجمع العينات في أنابيب 1.5 مل. يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي.
    3. قم بإذابة العينة المجمدة إلى RT ، وأضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى العينة ، ورجها بقوة لمدة 15 ثانية.
    4. احتضان العينة في RT لمدة 3 دقائق ثم قم بتدويرها عند 20000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    5. قم بإزالة المرحلة المائية بعناية (أعلى ، عديم اللون) وانقلها إلى أنابيب جديدة. لا تقم أبدا بنقل مرحلة البروتين (متوسطة ، بيضاء) أو مرحلة الفينول / الكلوروفورم (أسفل ، وردي).
    6. أضف ببطء حجما متساويا من 70٪ EtOH واخلطه برفق. لا دوامة.
    7. قم بتحميل العينة (حتى 700 ميكرولتر) في عمود دوران الحمض النووي الريبي الموجود في أنبوب التجميع. تأكد من تضمين أي راسب قد يكون قد تكون.
    8. قم بالدوران عند 9000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من التدفق.
    9. أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت RW1 ، وقم بالدوران عند 9000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من التدفق.
    10. انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد وأضف 500 ميكرولتر من RPE المخزن المؤقت.
    11. قم بالدوران عند 9000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية ثم تخلص من التدفق.
    12. أضف 500 ميكرولتر من RPE المخزن المؤقت ، وقم بتدويره عند 9000 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من التدفق.
    13. انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد ، وقم بتدويره (أعمدة بدون عازلة) عند 9000 × جم لمدة 1-2 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    14. انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد سعة 1.5 مل وأضف 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase مباشرة إلى غشاء العمود.
    15. احتضان العينة في RT لمدة 1-2 دقيقة. ثم ، تدور في 9000 × غرام لمدة 1 دقيقة عند 4 درجة مئوية لاستئصال الحمض النووي الريبي.
    16. تحقق من تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الفلوري.
      ملاحظة: يوصى بمحاذاة التركيز هنا.
    17. قم بإجراء النسخ العكسي باستخدام ~ 200 نانوغرام من قالب الحمض النووي الريبي. استخدم مجموعة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR-RT) واتبع بروتوكول الشركة المصنعة. بعد التفاعل ، قم بتخفيف cDNA 20 مرة إلى 200 ميكرولتر.
    18. أضف 2.0 ميكرولتر من cDNA ، و 3.0 ميكرولتر من Power Sybr Green Master Mix ، و 0.018 ميكرولتر من 100 ميكرومتر qPCR التمهيدي الأمامي ، و 0.018 ميكرولتر من التمهيدي العكسي qPCR 100 ميكرومتر ، و 0.96 ميكرولتر من ddH2O إلى كل بئر من لوحة 384 بئر.
    19. قم بتشغيل qPCR (مرحلة الانتظار: 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ؛ مرحلة PCR: 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ؛ مرحلة منحنى الذوبان: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، و 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية). استخدم طريقة المنحنى القياسي للقياس الكمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ينتج عن هذا البروتوكول خلايا دهنية متمايزة تماما ومحملة بالدهون بعد 7 أيام من إحداث تمايز الخلايا الشحمية. يمكن تقييم درجة تمايز الخلايا الشحمية عن طريق تلطيخ الزيت الأحمر للدهون الثلاثية والدهون (الشكل 1 أ) ، أو تحليل تعبير mRNA باستخدام qPCR-RT لجينات الخلايا الشحمية ، مثل المنظم الرئيسي لتكوين الدهون Pparg وهدفه Fabp4 (الشكل 1 ب). للحث على تمايز الخلايا الدهنية البيج في المختبر ، يمكن استخدام فئة ثيازوليدينيديون من ناهض PPARγ ، مثل روزيجليتازون. في الواقع ، في التجارب مع rosiglitazone ، نلاحظ تأثيرا يعتمد على الجرعة لتركيزات تصل إلى 1 ميكرومتر على مستويات التعبير عن الجينات الخاصة بالدهون البنية ، مثل Ucp1 و Ppargc1a. من ناحية أخرى ، فإن تأثير rosiglitazone على Fabp4 مشبع بتركيز 0.1 ميكرومتر (الشكل 1C).

يمكن استخدام الخلايا الشحمية المتمايزة التي تم الحصول عليها بواسطة هذا البروتوكول في العديد من التحليلات الوظيفية والميكانيكية ، مثل تحليل معدل استهلاك الأكسجين (OCR)16,30 (الشكل 2A) والترسيب المناعي للكروماتين 31 (ChIP; الشكل 2 ب). يمكن تخزين الخلايا preadipocytes الخالدة في نظام تخزين خلايا النيتروجين السائل دون فقدان الصلاحية ويمكن إذابتها في أي وقت لاستخدامها في التجارب.

Figure 1
الشكل 1: تمايز الخلايا السابقة للحرارة إلى خلايا دهنية محملة بالدهون . (أ) تم تلطيخ SVFs من الأنسجة الدهنية البيضاء الأربية (iWAT) للفئران البرية باللون الأحمر الزيتي o في اليوم 0 أو 7 من تمايز الخلايا الشحمية. (ب) مستويات تعبير mRNA ل Pparg و Fabp4 في اليوم 0 واليوم 7 من تمايز الخلايا الشحمية (متوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط [S.E.M.] ؛ ن = 3). (ج) تعبير mRNA لعلامة الخلايا الشحمية العامة Fabp4 والجينات الخاصة بالدهون البنية Ucp1 و Ppargc1a في الخلايا الشحمية المشتقة من SVF المعالجة ب 0.1 و 0.2 و 0.5 و 1.0 ميكرومتر روزيجليتازون ، جنبا إلى جنب مع وسط التمايز والصيانة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: أمثلة على التحليلات الوظيفية والميكانيكية مع الخلايا الشحمية المتمايزة. (أ) تحليل التعرف الضوئي على الحروف للخلايا الشحمية المشتقة من iWAT SVF (N = 10). (ب) ChIP-qPCR ل H3K27Ac في الخلايا الشحمية المشتقة من Nfia flox / flox iWAT SVF في اليوم 0 و 7 من التمايز. يتم عرض موقع Ins-0.4 kb و Fabp4-13 kb كمواقع خلفية (يعني ± S.E.M. ؛ ن = 2). في كلتا التجربتين ، تمت إضافة 1.0 ميكرومتر روزيجليتازون جنبا إلى جنب مع وسيط التمايز والصيانة للحث على تمايز الخلايا الشحمية البيج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: تكوين وسط التمايز والصيانة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: قائمة الاشعال المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، وصفنا بروتوكولا لعزل SVF من الأنسجة الدهنية للفئران للحصول على الخلايا preadipocytes وإجراء تمايز الخلايا الشحمية في المختبر. أدى استخدام جهاز فصل الأنسجة لهضم الكولاجيناز إلى تقليل التباين التجريبي ، وتقليل خطر التلوث ، وزيادة قابلية التكاثر. في حين أن هذا الإجراء هو خطوة حاسمة ضمن البروتوكول المقدم ، إلا أن العملية مؤتمتة للغاية ولا حاجة إلى التحسين. ومع ذلك ، اعتمادا على عمر الفأر ومستودع الأنسجة الدهنية ، قد تكون هناك حاجة إلى تحسين الفرم ، على سبيل المثال حجم القطع أو وقت القطع.

يعرف SVF بأنه مجموعة غير متجانسة تتكون من خلايا preadipocytes وخلايا مناعية مثل الضامة والخلايا البطانية وخلايا أخرى. نظرا لأن الخلايا preadipocytes تلتصق بأطباق الثقافة وتتحمل الغسيل والتغيرات المتوسطة ، فإنها يتم تخصيبها في عدد الخلايا أثناء الممرات. ومع ذلك ، فمن المعقول أن نفترض أن "preadipocytes" التي حصل عليها هذا البروتوكول لا تزال غير متجانسة. سيكون فرز الخلايا المنشط بالفلورسنت (FACS) باستخدام الأجسام المضادة ضد العلامات السطحية المبلغ عنها سابقا للخلايا preadipocytes مثل PDGFRα32 مطلوبا للحصول على مجموعة خلايا preadipocyte أكثر نقاء.

باختصار ، وصفنا هنا بروتوكولا لعزل SVF باستخدام مفكك الأنسجة لهضم الكولاجيناز. يوفر هذا البروتوكول عزلا أسهل ل SVF مقارنة بالبروتوكول التقليدي باستخدام شاكر بكتيري مع رف أنبوبي ، ويوفر تباينا تجريبيا أقل ، ويقلل التلوث ، ويزيد من قابلية التكاثر16،17،18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أي من المؤلفين مصلحة مالية منافسة تتعلق بهذا العمل.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا تاكاهيتو وادا وسايكو يوشيدا (جامعة طوكيو ، طوكيو ، اليابان) على مساعدتهم التجريبية. تم تمويل هذا العمل من خلال المنح التالية إلى Y.H.: منحة بحثية من برنامج الباحث الشاب الممتاز بجامعة طوكيو. الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) منحة KAKENHI للعلماء في بداية حياتهم المهنية ، رقم المنحة 19K17976 ؛ منحة للعداء الأول لأبحاث السكري المستقبلية (FFDR) من مؤسسة اليابان لعلم الإنزيمات التطبيقي ، رقم المنحة 17F005 ؛ منحة من مؤسسة البحوث الدوائية ؛ منحة من مؤسسة موتشيدا التذكارية للبحوث الطبية والصيدلانية ؛ منحة من مؤسسة MSD لعلوم الحياة ؛ منحة من مؤسسة دايوا للأوراق المالية الصحية ؛ منحة من مؤسسة طوكيو للبحوث الكيميائية الحيوية ؛ منحة أبحاث علوم الحياة من مؤسسة تاكيدا للعلوم؛ ومنحة من مؤسسة SENSHIN للبحوث الطبية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm dish Corning 430167
12 well plate Corning 3513
60 mm dish IWAKI 3010-060
Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat Miltenyi Biotec 130-105-808 contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A
Cell strainer 70 µm BD falcon #352350
Collagen coated dishes, 100 mm BD #356450
Collagen coated dishes, 60 mm BD #354401
Collagen I Coat Microplate 6 well IWAKI 4810-010
Dexamethasone Wako 041-18861
Dissecting Forceps N/A N/A autoclave before use
Dissecting Scissors, blunt/sharp N/A N/A autoclave before use
Dissecting Scissors, sharp/sharp N/A N/A autoclave before use
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Gibco 10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS) N/A N/A
gentleMACS C Tubes Milteny Biotec 130-093-237
gentleMACSOcto Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Humulin R Injection U-100 Eli Lilly 872492
Indomethacin Sigma I7378-5G
Isobutylmethylxanthine (IBMX) Sigma 17018-1G
Lipofectamine 2000 Life Technologies 11668-019
Neomycin Sulfate Fujifilm 146-08871 
Opti-MEM Invitrogen  31985-062
pBABE-neo largeTcDNA (SV40) Add gene #1780
PBS tablets Takara T900
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line cell biolab RV-101
Polybrene Nacalai Tesque 12996-81
Power Sybr Green Master Mix Applied Biosystems 4367659
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix TOYOBO #FSQ-201
RNeasy Mini Kit (250) QIAGEN 74106
Rosiglitazone Wako 180-02653
T3 Sigma T2877-100mg
Trypsin-EDTA (0.05%) Gibco 25200-056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
  3. Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
  4. Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
  5. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  6. Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
  7. Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
  8. Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
  9. Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
  10. Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
  11. Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
  12. Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
  13. Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
  14. Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
  15. Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
  16. Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
  17. Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
  18. Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
  19. Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
  20. Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
  21. Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
  22. Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
  23. Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
  24. Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
  25. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  26. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
  27. Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
  28. Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
  29. Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
  30. Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
  31. Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
  32. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).

Tags

علم الأحياء، العدد 195،
عزل شبه آلي للجزء الوعائي اللحمي من الأنسجة الدهنية البيضاء باستخدام مفكك الأنسجة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saito, K., Hiraike, Y., Oguchi, M.,… More

Saito, K., Hiraike, Y., Oguchi, M., Yamauchi, T. Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator. J. Vis. Exp. (195), e65265, doi:10.3791/65265 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter