Summary
Dieses Protokoll beschreibt die halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro zu erreichen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau reduziert die experimentelle Variation und erhöht die Reproduzierbarkeit.
Abstract
Die in vitro Untersuchung der Differenzierung von weißen, braunen und beigen Adipozyten ermöglicht die Untersuchung zellautonomer Funktionen von Adipozyten und ihrer Mechanismen. Immortalisierte weiße Präadipozyten-Zelllinien sind öffentlich zugänglich und weit verbreitet. Die Entstehung von beigen Adipozyten im weißen Fettgewebe als Reaktion auf äußere Signale lässt sich jedoch nur schwer in vollem Umfang mit öffentlich zugänglichen weißen Adipozytenzelllinien rekapitulieren. Die Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe wird üblicherweise durchgeführt, um primäre Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung durchzuführen. Das Zerkleinern und die Kollagenase-Verdauung von Fettgewebe von Hand kann jedoch zu experimentellen Variationen führen und ist anfällig für Verunreinigungen. Hier stellen wir ein modifiziertes halbautomatisches Protokoll vor, das einen Gewebedissoziator für den Kollagenaseverdau verwendet, um eine einfachere Isolierung des SVF zu erreichen, mit dem Ziel, die experimentelle Variation zu reduzieren, die Kontamination zu reduzieren und die Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Die gewonnenen Präadipozyten und differenzierten Adipozyten können für funktionelle und mechanistische Analysen verwendet werden.
Introduction
Die Biologie des Fettgewebes hat aufgrund der weltweit zunehmenden Prävalenz von Fettleibigkeit und Typ-2-Diabetes immer mehr Aufmerksamkeit auf sich gezogen1. Adipozyten speichern überschüssige Energie in Form von Lipidtröpfchen, die beim Verhungern freigesetzt werden. Darüber hinaus hält das Fettgewebe die systemische Energiehomöostase aufrecht, indem es als endokrines Organ dient und mit anderen Geweben kommuniziert 2,3. Interessanterweise werden sowohl überschüssiges Fettgewebe (Fettleibigkeit) als auch Fettabbau (Lipodystrophie) mit Insulinresistenz und Diabetes in Verbindung gebracht1. Adipozyten werden in drei Typen unterteilt: weiß, braun und beige1. Weiße Adipozyten speichern überschüssige Energie hauptsächlich als Lipide, während braune und beige Adipozyten Energie in Form von Wärme über das mitochondriale Entkopplungsprotein-1 (Ucp1)1,4 abführen. Bemerkenswert ist, dass beige Adipozyten (auch als "induzierbare" braune Adipozyten bezeichnet) im weißen Fettgewebe als Reaktion auf Kälte oder sympathische Stimulation auftreten und Genexpressionsmuster aufweisen, die sich mit denen von "klassischen" braunen Adipozyten überlappen, sich aber von ihnen unterscheiden5. In jüngster Zeit wurden braune und beige Adipozyten als potenzielle Ziele für Anti-Adipositas- und Anti-Diabetes-Behandlungen angesehen, die darauf abzielen, "die Energieableitung zu verbessern" und nicht "die Energieaufnahme zu unterdrücken"4. Unterstützend wird berichtet, dass das Risikoallel der FTO-Adipositasvariante rs1421085 beim Menschen, das unter den häufigen Varianten die stärkste Assoziation mit einem höheren Body-Mass-Index (BMI) aufweist 6,7 und verschiedene Gen-Umwelt-Interaktionen8,9 aufweist, die Differenzierung und Funktion der beigen Adipozyten negativ reguliert 10. Der Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptor γ (PPARγ) ist als Master-Transkriptionsregulator der Adipogenese bekannt und ist für die Adipozytendifferenzierung notwendig und ausreichend11. Transkriptionsregulatoren, wie die homologiste Domäne PRD1-BF1-RIZ1, die 16 (PRDM16), den frühen B-Zell-Faktor 2 (EBF2) und den Kernfaktor I-A (NFIA) enthält, sind entscheidend für die Differenzierung und Funktion der braunen und beigen Adipozyten 12,13,14,15,16,17,18 . Auf der anderen Seite erfordert die Genprogrammierung weißer Adipozyten transkriptionelle Regulatoren, wie das Transducin-ähnliche Enhancer-Protein 3 (TLE3) und das Zinkfingerprotein 423 (ZFP423)19,20,21.
In-vitro-Modellsysteme ermöglichen die Durchführung molekularer Studien, die darauf abzielen, das Verständnis der Mechanismen zu verbessern, die den Funktionen und Funktionsstörungen von Adipozyten zugrunde liegen. Obwohl öffentlich zugängliche und immortalisierte Präadipozytenzelllinien wie 3T3-L1 und 3T3-F442A existieren22,23,24, wäre die Kultur primärer Präadipozyten und die Differenzierung in Adipozyten ein geeigneteres Modell für die Untersuchung der in vivo Adipogenese. Die Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe ist eine bekannte Methode zur Gewinnung primärer Präadipozyten25,26. Die Kollagenaseverdauung von Fettgewebe, die üblicherweise mit einem Bakterienschüttler mit einem Röhrchengestell durchgeführt wird, kann jedoch zu experimentellen Variationen führen und ist anfällig für Kontaminationen27,28. Hier beschreiben wir ein alternatives Protokoll, das einen sanften magnetisch aktivierten Zellsortierer (MACS) Gewebedissoziator für den Kollagenaseverdau verwendet, um eine einfachere Isolierung des SVF zu erreichen.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Tokio genehmigt und nach den institutionellen Richtlinien der Universität Tokio durchgeführt.
1. Herstellung von Enzymlösung und Medium
- Geben Sie beide Seiten des weißen Leistenfettgewebes (rechte und linke Seite, ca. 150 mg) einer 7-8 Wochen alten Maus und 2,5 ml Enzymlösung in das Röhrchen C des Dissoziators.
- Rekonstituieren Sie Enzym D mit 3 ml Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM)/F12 ohne fötales Kälberserum (FBS) oder Antibiotika, Enzym R mit 2,7 ml DMEM/F12 ohne FBS oder Antibiotika und Enzym A mit 1 ml Puffer A.
- Bereiten Sie 2,5 ml Enzymlösung vor, indem Sie 100 μl Enzym D, 50 μl Enzym R, 12,5 μl Enzym A und 2,35 ml DMEM/F12 ohne FBS oder Antibiotika in Röhrchen C geben.
2. Isolierung von Fettgewebe
- 7-8 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse (ca. 20 g) durch Zervixluxation einschläfern.
- Um das weiße Fettgewebe der Leisten zu isolieren, schneiden Sie die Haut an einer sauberen Bank mit einer stumpfen/scharfen Schere am Bauch und in Richtung der unteren Extremitäten. Isolieren Sie das Fettgewebe von der Innenseite der Oberschenkel mit einer scharfen/scharfen Schere. Eine Seite des Leistenfettgewebes wiegt ~75 mg.
- Geben Sie das isolierte Fettgewebe mit Enzymlösung auf Eis in Röhrchen C und bewahren Sie das Röhrchen in der Reinbank auf, um die Sterilität aufrechtzuerhalten.
3. Zerkleinern und Verdauen von Fettgewebe
- Geben Sie am Reintisch 2,5 ml Enzymlösung in Röhrchen C.
- Hacken Sie das Fettgewebe in kleine Stücke, indem Sie es 50 Mal mit einer scharfen/scharfen Schere schneiden. Schneiden Sie das Fettgewebe in ~2 mm2 Stücke.
- Schließen Sie die Kappe von Schlauch C fest, drehen Sie den Schlauch auf den Kopf und befestigen Sie ihn mit aufgesetzter Kappe an der Hülse des Gewebedissoziators. Anschließend wird die Probe ~40 min bei 37 °C aufgeschlossen.
HINWEIS: In dieser Studie wurde der gentleMACS Octo Dissociator mit Heizungen (Miltenyi Biotec 130-096-427) verwendet, und das vorinstallierte Programm "37C_mr_ATDK_1" wurde befolgt.
4. Filtration der Zellsuspension
- DMEM/F12 mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin auf 37 °C vorwärmen.
- Trennen Sie das Röhrchen C vom Gewebedissoziator und stoppen Sie die Verdauung, indem Sie 5 ml DMEM/F12 mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin hinzufügen und viermal vorsichtig pipettieren.
- Bei 700 x g für 10 min bei 20 °C zentrifugieren.
- Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, ohne das Zellpellet zu stören.
- Resuspendieren Sie das Pellet durch Zugabe von 10 ml DMEM/F12, das 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, und pipettieren Sie es fünfmal vorsichtig.
- Filtern Sie die Zellsuspension durch ein Zellsieb mit einem Durchmesser von 70 μm, das auf einem neuen 50-ml-Röhrchen platziert ist.
- Bei 250 x g für 5 min zentrifugieren und das Pellet in 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendieren.
5. Beschichtung der Zellen
- Bei 500 x g für 5 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie 10 ml DMEM/F12 mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin zugeben und zehnmal pipettieren.
- Die Zellsuspension auf einer 10 cm dicken, kollagenbeschichteten Schale anrichten und für 1-2 h in einen Zellkulturinkubator (37 °C, 5%CO2) stellen.
HINWEIS: Mit Kollagen beschichtetes Geschirr ist nicht unbedingt erforderlich. Erfahrungsgemäß helfen kollagenbeschichtete Schalen jedoch bei der Adhärenz von Präadipozyten und erhöhen so das Überleben der Zellen. - Saugen Sie das Medium ab und waschen Sie die Zellen zweimal mit 3 ml PBS pro Waschgang.
- Fügen Sie 10 ml DMEM/F12 hinzu, das 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, und geben Sie die Schalen wieder in den Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 %CO 2).
6. Passage von Präadipozyten
- Am nächsten Tag saugen Sie das Medium ab (die Zellen sind haftend und somit kann das Medium abgesaugt werden), waschen Sie die Zellen zweimal mit 3 ml PBS pro Waschgang und fügen Sie 10 ml DMEM/F12 hinzu, das 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält.
- Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben (in der Regel 4 Tage nach der SVF-Isolierung), teilen Sie die Zellen in vier 10-cm-kollagenbeschichtete Schalen auf.
- Konkret wird das Medium abgesaugt, die Zellen mit PBS (Raumtemperatur [RT]) gewaschen, 1 ml vorgewärmtes 0,05%iges Trypsin hinzugefügt und 5 Minuten im Zellkultur-Inkubator inkubiert.
- Fügen Sie 10 ml DMEM/F12 hinzu, das 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, um die Trypsinaktivität zu unterdrücken. Nach dem Pipettieren 5 min bei 440 x g zentrifugieren.
- Saugen Sie den Überstand ab, resuspendieren Sie die Zellen durch Zugabe von 40 ml DMEM/F12, das 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, und legen Sie die Zellen in vier 10-cm-kollagenbeschichtete Schalen.
- Passieren Sie die Zellen erneut, wenn sie eine Konfluenz von 80 % erreicht haben.
7. Herstellung eines Retrovirus, das das SV40 large T-Antigen exprimiert, zur Immortalisierung von Präadipozyten (optional)
- Mindestens 3 Tage vor der Immortalisierung werden die Platinum-E (Plat-E)-Verpackungszellen29 mit einer Dichte von 3,0 x 105 Zellen/ml in 2 mL DMEM mit 10 % FBS ohne Antibiotika auf eine Platte aufgetragen. Verwenden Sie ein Hämazytometer, um die Zellen zu zählen.
- Transfizieren Sie am nächsten Tag 4 μg pBABE-neo largeTcDNA (Genplasmid #1780 hinzufügen) mit Lipofectamin 2000 gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Nach 24 h wird das Medium abgesaugt und 2 ml DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin zugegeben.
- Ernten Sie am nächsten Tag den retroviralen Überstand. Das Retrovirus kann sofort zur Immortalisierung verwendet oder bei -80 °C gelagert werden.
8. Immortalisierung von Präadipozyten mit SV40 large T Antigen (optional)
- Passage und Erweiterung der Präadipozyten nach SVF-Isolierung zweimal.
- Die Zellen werden in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 0,5-1,0 x 104 Zellen/ml in 2 ml DMEM/F12 mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin beschichtet. Verwenden Sie ein Hämazytometer, um die Zellen zu zählen.
- Am nächsten Tag bereiten Sie 250 μl frisches oder aufgetautes Retrovirus, das das SV40-Antigen exprimiert, pro Vertiefung der 6-Well-Platten vor. Bei 440 x g für 5 min zentrifugieren und den Überstand in ein neues Röhrchen geben.
- Fügen Sie 750 μl DMEM/F12 hinzu, das 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, und 1 μl Polybren pro 250 μl retroviralen Überstand, um das funktionierende Virus zu erhalten.
- Saugen Sie das Medium ab und geben Sie 1.000 μl des funktionierenden Retrovirus in jede Vertiefung, die Präadipozyten enthält.
- Fügen Sie 4 h später 1 ml DMEM/F12 mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin hinzu.
- Am nächsten Tag werden die infizierten Präadipozyten in eine 10 cm große Schale aufgeteilt und die infizierten Zellen mit DMEM/F12 ausgewählt, die 10 % FBS, 1 % Penicillin-Streptomycin und 500 μg/ml Neomycin enthalten. Um die Auswahl der Antibiotika zu überwachen, bereiten Sie eine Schale mit nicht infizierten Zellen mit Neomycin zu.
- Fahren Sie mit der Passage der infizierten Zellen mit Neomycin fort, bis alle nicht infizierten Zellen in der Monitorschale abgestorben sind.
9. Differenzierung der Adipozyten
- Platten Sie die Zellen. Bei 12-Well-Platten werden die Zellen mit einer Dichte von 4,0 x 104 Zellen/ml in 1 ml DMEM/F12 mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin beschichtet.
- Wenn die Präadipozyten konfluieren (48-72 h nach der Plattierung), saugen Sie das Medium ab und ersetzen Sie es durch Differenzierungsmedium (Zusammensetzung siehe Tabelle 1 ).
- Am Tag 2 der Differenzierung (d. h. 48 Stunden nach der Induktion der Differenzierung) wird das Medium durch ein Erhaltungsmedium ersetzt (Zusammensetzung siehe Tabelle 1 ). Wechseln Sie anschließend alle 2 Tage das Pflegemedium. Die terminale Differenzierung wird am Tag 7 der Differenzierung erreicht.
- Ölrot oder Färbung
- Für die ölrote Färbung saugen Sie das Medium an und spülen Sie die Zellen mit 1 ml PBS pro Well. Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml 4%igem Formaldehyd pro Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen 15 Minuten lang bei RT.
- Während der Inkubation wird die 0,5%ige ölrote O-Stammlösung (in Isopropylalkohol) mitddH2Oauf 0,3 % verdünnt und die Arbeitslösung mit einem Filterpapier filtriert.
- Entfernen Sie nach den 15 Minuten der Inkubation das Formaldehyd, spülen Sie die Zellen mit 60%igem Isopropylalkohol ab, fügen Sie 1 ml filtriertes Öl rot oder Arbeitslösung hinzu und inkubieren Sie es 1 Stunde lang bei RT.
- Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation unter fließendem Wasser. Anschließend werden lipidbeladene Adipozyten unter einem inversen Mikroskop (Vergrößerung: 20-faches Objektiv und 10-faches Okular) beobachtet.
- mRNA-Expressionsanalyse
HINWEIS: In Tabelle 2 finden Sie eine Liste der in dieser Studie verwendeten Primer.- Saugen Sie das Medium ab und geben Sie 1 ml/Well Trizol in die Well.
- Inkubieren Sie 15 Minuten lang bei RT, lösen Sie die Zellen durch Pipettieren und sammeln Sie die Proben in 1,5-ml-Röhrchen. Die Proben können bis zur RNA-Extraktion bei -80 °C gelagert werden.
- Tauen Sie die gefrorene Probe auf RT auf, geben Sie 200 μl Chloroform in die Probe und schütteln Sie sie 15 s lang kräftig.
- Die Probe wird 3 min bei RT inkubiert und dann bei 20.000 x g für 15 min bei 4 °C geschleudert.
- Entfernen Sie vorsichtig die wässrige Phase (oben, farblos) und füllen Sie sie in neue Röhrchen um. Übertragen Sie niemals die Proteinphase (Mitte, weiß) oder die Phenol-/Chloroformphase (unten, rosa).
- Fügen Sie langsam ein gleiches Volumen von 70% EtOH hinzu und mischen Sie vorsichtig. Wirbeln Sie nicht.
- Laden Sie die Probe (bis zu 700 μl) in eine RNA-Spinsäule, die in einem Sammelröhrchen sitzt. Stellen Sie sicher, dass Sie alle Ausfällungen einbeziehen, die sich möglicherweise gebildet haben.
- Schleudern Sie bei 9.000 x g für 30 s bei 4 °C und verwerfen Sie dann den Durchfluss.
- Fügen Sie 700 μl Puffer RW1 hinzu, schleudern Sie bei 9.000 x g für 30 s bei 4 °C und verwerfen Sie dann den Durchfluss.
- Übertragen Sie die Säule in ein neues Sammelröhrchen und fügen Sie 500 μl Puffer-RPE hinzu.
- Schleudern Sie bei 9.000 x g für 30 s bei 4 °C und verwerfen Sie dann den Durchfluss.
- Fügen Sie 500 μl Puffer-RPE hinzu, schleudern Sie bei 9.000 x g für 2 min bei 4 °C und verwerfen Sie dann den Durchfluss.
- Übertragen Sie die Säule in ein neues Sammelröhrchen und schleudern Sie sie (Säulen ohne Puffer) bei 9.000 x g für 1-2 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie die Säule in ein neues 1,5-ml-Sammelröhrchen und geben Sie 30 μl RNase-freies Wasser direkt auf die Säulenmembran.
- Inkubieren Sie die Probe bei RT für 1-2 min. Anschließend bei 9.000 x g für 1 min bei 4 °C schleudern, um die RNA zu eluieren.
- Überprüfen Sie die RNA-Konzentration mit einem Fluorspektrometer.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Konzentration hier auszurichten. - Führen Sie eine reverse Transkription mit ~200 ng RNA-Template durch. Verwenden Sie ein kommerzielles quantitatives Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionskit (qPCR-RT) und befolgen Sie das Protokoll des Herstellers. Nach der Reaktion wird die cDNA 20-mal auf 200 μl verdünnt.
- Fügen Sie 2,0 μl cDNA, 3,0 μl Power Sybr Green Master Mix, 0,018 μl 100 μM qPCR-Forward-Primer, 0,018 μl 100 μM qPCR-Reverse-Primer und 0,96 μl ddH2O zu jeder Vertiefung einer 384-Well-Platte hinzu.
- Führen Sie eine qPCR durch (Haltephase: 50 °C für 2 min und 95 °C für 2 min; PCR-Phase: 40 Zyklen bei 95 °C für 15 s und 60 °C für 1 min; Schmelzkurve: 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min und 95 °C für 15 s). Verwenden Sie zur Quantifizierung die Standardkurvenmethode.
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Representative Results
Dieses Protokoll liefert vollständig differenzierte, lipidbeladene Adipozyten 7 Tage nach Induktion der Adipozytendifferenzierung. Der Grad der Adipozytendifferenzierung kann durch die Ölrotfärbung von Triglyceriden und Lipiden (Abbildung 1A) oder durch eine mRNA-Expressionsanalyse mittels qPCR-RT von Adipozytengenen, wie dem Hauptregulator der Adipogenese Pparg und seinem Zielmolekül Fabp4 (Abbildung 1B), bewertet werden. Um eine Differenzierung der beigen Adipozyten in vitro zu induzieren, kann eine Thiazolidindione-Klasse von PPARγ-Agonisten, wie z. B. Rosiglitazon, verwendet werden. Tatsächlich beobachten wir in Experimenten mit Rosiglitazon einen dosisabhängigen Effekt von Konzentrationen bis zu 1 μM auf die Expressionsniveaus der braunfettspezifischen Gene, wie Ucp1 und Ppargc1a. Andererseits ist die Wirkung von Rosiglitazon auf Fabp4 bei einer Konzentration von 0,1 μM gesättigt (Abbildung 1C).
Differenzierte Adipozyten, die mit diesem Protokoll gewonnen werden, können für verschiedene funktionelle und mechanistische Analysen verwendet werden, wie z. B. die Analyse der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR)16,30 (Abbildung 2A) und die Chromatin-Immunpräzipitation 31 (ChIP; Abbildung 2B). Immortalisierte Präadipozyten können ohne Verlust der Lebensfähigkeit in einem Flüssigstickstoff-Zellspeichersystem gelagert und jederzeit für die Verwendung in Experimenten aufgetaut werden.
Abbildung 1: Differenzierung von Präadipozyten in lipidbeladene Adipozyten . (A) SVFs aus inguinalem weißem Fettgewebe (iWAT) von Wildtyp-Mäusen wurden am Tag 0 oder 7 der Adipozytendifferenzierung mit Ölrot O gefärbt. (B) mRNA-Expressionsniveaus von Pparg und Fabp4 an Tag 0 und Tag 7 der Adipozytendifferenzierung (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts [S.E.M.]; N = 3). (C) mRNA-Expression des allgemeinen Adipozytenmarkers Fabp4 und der braunen Fett-spezifischen Gene Ucp1 und Ppargc1a in SVF-abgeleiteten Adipozyten, die mit 0,1, 0,2, 0,5 und 1,0 μM Rosiglitazon behandelt wurden, zusammen mit dem Differenzierungs- und Erhaltungsmedium. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Beispiele für funktionelle und mechanistische Analysen mit differenzierten Adipozyten. (A) OCR-Analyse von iWAT SVF-abgeleiteten Adipozyten (N = 10). (B) ChIP-qPCR für H3K27Ac in Nfia flox/flox iWAT SVF-abgeleiteten Adipozyten an Tag 0 und 7 der Differenzierung. Die Sites Ins-0.4 kb und Fabp4-13 kb werden als Hintergrundsites angezeigt (Mittelwert ± S.E.M.; N = 2). Für beide Experimente wurde 1,0 μM Rosiglitazon zusammen mit dem Differenzierungs- und Erhaltungsmedium hinzugefügt, um eine beige Adipozytendifferenzierung zu induzieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Zusammensetzung des Differenzierungs- und Pflegemediums. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Die Liste der in dieser Studie verwendeten Primer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
In dieser Arbeit haben wir ein Protokoll zur Isolierung des SVF aus murinem Fettgewebe beschrieben, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro durchzuführen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau verringerte die experimentelle Variation, verringerte das Risiko einer Kontamination und erhöhte die Reproduzierbarkeit. Obwohl dieses Verfahren ein kritischer Schritt innerhalb des vorgestellten Protokolls ist, ist der Prozess hochgradig automatisiert und es ist keine Optimierung erforderlich. Abhängig vom Alter der Maus und dem Fettgewebsdepot kann jedoch eine Optimierung des Hackens, z. B. der Größe der Stücke oder der Schnittzeit, erforderlich sein.
Die SVF ist als heterogene Population bekannt, die aus Präadipozyten, Immunzellen wie Makrophagen, Endothelzellen und anderen Zellen besteht. Da Präadipozyten an Kulturschalen haften und tolerant gegenüber Waschen und Medienwechseln sind, reichern sie sich während der Passagen in der Zellpopulation an. Es ist jedoch davon auszugehen, dass die durch dieses Protokoll erhaltenen "Präadipozyten" noch heterogen sind. Eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit Antikörpern gegen zuvor beschriebene Oberflächenmarker von Präadipozyten wie PDGFRα32 wäre erforderlich, um eine reinere Präadipozytenpopulation zu erhalten.
Zusammenfassend haben wir hier ein Protokoll zur SVF-Isolierung unter Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau beschrieben. Dieses Protokoll bietet eine einfachere Isolierung des SVF im Vergleich zum herkömmlichen Protokoll unter Verwendung eines Bakterienschüttlers mit einem Röhrchengestell und bietet eine geringere experimentelle Variation, eine geringere Kontamination und eine erhöhte Reproduzierbarkeit16,17,18.
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Disclosures
Keiner der Autoren hat ein konkurrierendes finanzielles Interesse im Zusammenhang mit dieser Arbeit.
Acknowledgments
Die Autoren danken Takahito Wada und Saiko Yoshida (The University of Tokyo, Tokyo, Japan) für ihre experimentelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die folgenden Stipendien an Y.H. finanziert: Forschungsstipendium des University of Tokyo Excellent Young Researcher Program; Japanische Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (JSPS) KAKENHI-Stipendium für Nachwuchswissenschaftler, Fördernummer 19K17976; Stipendium für den Front Runner of Future Diabetes Research (FFDR) der Japan Foundation for Applied Enzymology, Förderkennzeichen 17F005; Stipendium der Stiftung für Pharmakologische Forschung; Stipendium der Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research; Stipendium der MSD Life Science Foundation; Zuschuss der Daiwa Securities Health Foundation; Stipendium der Tokyo Biochemical Research Foundation; Life Science Research Stipendium der Takeda Science Foundation; und Stipendium der SENSHIN Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm dish | Corning | 430167 | |
| 12 well plate | Corning | 3513 | |
| 60 mm dish | IWAKI | 3010-060 | |
| Adipose Tissue Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-105-808 | contents: Enzyme D, Enzyme R, Enzyme A and Buffer A |
| Cell strainer 70 µm | BD falcon | #352350 | |
| Collagen coated dishes, 100 mm | BD | #356450 | |
| Collagen coated dishes, 60 mm | BD | #354401 | |
| Collagen I Coat Microplate 6 well | IWAKI | 4810-010 | |
| Dexamethasone | Wako | 041-18861 | |
| Dissecting Forceps | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, blunt/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| Dissecting Scissors, sharp/sharp | N/A | N/A | autoclave before use |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565-042 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | N/A | N/A | |
| gentleMACS C Tubes | Milteny Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACSOcto Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Humulin R Injection U-100 | Eli Lilly | 872492 | |
| Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
| Isobutylmethylxanthine (IBMX) | Sigma | 17018-1G | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | |
| Neomycin Sulfate | Fujifilm | 146-08871 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-062 | |
| pBABE-neo largeTcDNA (SV40) | Add gene | #1780 | |
| PBS tablets | Takara | T900 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | cell biolab | RV-101 | |
| Polybrene | Nacalai Tesque | 12996-81 | |
| Power Sybr Green Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| ReverTra Ace qPCR RT Master Mix | TOYOBO | #FSQ-201 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| Rosiglitazone | Wako | 180-02653 | |
| T3 | Sigma | T2877-100mg | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
- Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).
- Kajimura, S., Saito, M. A new era in brown adipose tissue biology: Molecular control of brown fat development and energy homeostasis. Annual Review of Physiology. 76, 225-249 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The genetics of obesity: from discovery to biology. Nature Reviews Genetics. 23 (2), 120-133 (2022).
- Loos, R. J. F., Yeo, G. S. H. The bigger picture of FTO-the first GWAS-identified obesity gene. Nature Reviews Endocrinology. 10 (1), 51-61 (2014).
- Hiraike, Y., Yang, C. T., Liu, W. J., Yamada, T., Lee, C. L. FTO obesity variant-exercise interaction on changes in body weight and BMI: The Taiwan biobank study. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (9), e3673-e3681 (2021).
- Li, S., et al. Physical activity attenuates the genetic predisposition to obesity in 20,000 men and women from EPIC-Norfolk prospective population study. PLoS Medicine. 7 (8), e1000332 (2010).
- Claussnitzer, M., et al. FTO obesity variant circuitry and adipocyte browning in humans. The New England Journal of Medicine. 373 (10), 895-907 (2015).
- Tontonoz, P., Hu, E., Spiegelman, B. M. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by PPAR gamma 2, a lipid-activated transcription factor. Cell. 79 (7), 1147-1156 (1994).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454 (7207), 961-967 (2008).
- Rajakumari, S., et al. EBF2 determines and maintains brown adipocyte identity. Cell Metabolism. 17 (4), 562-574 (2013).
- Shapira, S. N., et al. EBF2 transcriptionally regulates brown adipogenesis via the histone reader DPF3 and the BAF chromatin remodeling complex. Genes and Development. 31 (7), 660-673 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA co-localizes with PPARγ and transcriptionally controls the brown fat gene program. Nature Cell Biology. 19 (9), 1081-1092 (2017).
- Hiraike, Y., et al. NFIA differentially controls adipogenic and myogenic gene program through distinct pathways to ensure brown and beige adipocyte differentiation. PLoS Genetics. 16 (9), e1009044 (2020).
- Hiraike, Y., et al. NFIA determines the cis-effect of genetic variation on Ucp1 expression in murine thermogenic adipocytes. iScience. 25 (8), 104729 (2022).
- Villanueva, C. J., et al. Adipose subtype-selective recruitment of TLE3 or Prdm16 by PPARγ specifies lipid storage versus thermogenic gene programs. Cell Metabolism. 17 (3), 423-435 (2013).
- Pearson, S., et al. Loss of TLE3 promotes the mitochondrial program in beige adipocytes and improves glucose metabolism. Genes and Development. 33 (13-14), 747-762 (2019).
- Shao, M., et al. Zfp423 maintains white adipocyte identity through suppression of the beige cell thermogenic gene program. Cell Metabolism. 23 (6), 1167-1184 (2016).
- Green, H., Kehinde, O. Sublines of mouse 3T3 cells that accumulate lipid. Cell. 1 (3), 113-116 (1974).
- Green, H., Kehinde, O. An established preadipose cell line and its differentiation in culture II. Factors affecting the adipose conversion. Cell. 5 (1), 19-27 (1975).
- Green, H., Kehinde, O. Spontaneous heritable changes leading to increased adipose conversion in 3T3 cells. Cell. 7 (1), 105-113 (1976).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. Journal of Visualized Experiments. (167), e62005 (2021).
- Priya, N., Sarcar, S., Majumdar, A. S., SundarRaj, S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 706-716 (2014).
- Lockhart, R. A., Aronowitz, J. A., Dos-Anjos Vilaboa, S. Use of freshly isolated human adipose stromal cells for clinical applications. Aesthetic Surgery Journal. 37, S4-S8 (2017).
- Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy. 7 (12), 1063-1066 (2000).
- Li, Y., Fromme, T., Klingenspor, M. Meaningful respirometric measurements of UCP1-mediated thermogenesis. Biochimie. 134, 56-61 (2017).
- Hiraike, Y. Chromatin immunoprecipitation with mouse adipocytes using hypotonic buffer to enrich nuclear fraction before fixation. STAR Protocols. 4 (1), 102093 (2023).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
