Hier wird ein effektives Protokoll zur schnellen Blutperfusion vorgestellt, um Gewebeproben von afrikanischen Krallenfröschen für Transkriptomik- und Proteomik-Studien vorzubereiten.
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Methodenartikel
Effektive schnelle Blutdurchblutung bei Xenopus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Xenopus sind seit über 100 Jahren leistungsfähige Modellorganismen für das Verständnis der Entwicklung und Krankheit von Wirbeltieren. Hier wird ein schnelles Blutdurchblutungsprotokoll bei Xenopus definiert, das auf eine konsistente und drastische Reduzierung des Blutes in allen Geweben abzielt. Die Perfusion erfolgt durch das Einführen einer Nadel direkt in die Herzkammer und das Pumpen von heparinisierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch das Gefäßsystem. Die Prozedur kann in ca. 10 Minuten pro Tier durchgeführt werden. Das Blut wird von einigen wenigen Proteinen und Zelltypen dominiert, die sehr häufig vorkommen, was zu zahlreichen Problemen führt, da diese Proteine die meisten anderen Moleküle und Zelltypen von Interesse maskieren. Die reproduzierbare Charakterisierung von adulten Xenopus-Geweben mit quantitativer Proteomik und Einzelzell-Transkriptomik wird von der Anwendung dieses Protokolls vor der Organentnahme profitieren. Die Protokolle für die Gewebeentnahme sind in Begleitpapieren definiert. Diese Verfahren zielen auf die Standardisierung von Praktiken bei Xenopus unterschiedlichen Geschlechts, Alters und Gesundheitszustands ab, insbesondere bei X. laevis und X. tropicalis.
Einleitung
Die Ganzkörperperfusion von Amphibien wird routinemäßig zum Zwecke der Konservierung und Fixierung durchgeführt 1,2,3,4,5,6. Diese Verfahren erfolgen jedoch in einem Tempo, das die Anzahl der frischen Proben, die pro Tier entnommen werden können, begrenzt. Das Ziel dieser Arbeit ist es, ein effektives Blutperfusionsprotokoll in Xenopus zu entwickeln, wobei die Geschwindigkeit der Technik im Vordergrund steht. Das Protokoll dauert weniger als 10 Minuten pro Tier fü....
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Protokoll
Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Regeln und Vorschriften der Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3) durchgeführt.
ANMERKUNG: Obwohl die beschriebene primäre Methode der Euthanasie von der American Veterinary Medical Association12 als akzeptable Technik für die Euthanasie angesehen wird, wurde nicht festgestellt, dass sie zum Stillstand eines Herzschlags führt13. Auch die häufig angewandte sekundäre Methode des doppelten Sagenmachens verhindert dies nicht, ebenso wenig wie die Entnahme des Herzens aus dem Tier. Die Ausblutung vo....
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Ergebnisse
Nach erfolgreicher Durchblutung sind alle Gewebe (mit Ausnahme der Leber bei pigmentiertem Xenopus) deutlich heller und weniger durchblutet. Die großen Blutgefäße werden weniger auffällig (Abbildung 10), und das Gewebe (mit Ausnahme der Leber) wird nach der Entnahme sauber im Puffer gespült. Während die erfolgreiche Durchführung des Protokolls letztlich nur durch die Qualität der Daten aus exbluteten Gewebeproben bestätigt werden kann, werden in der Tabelle zur Fehlerbehebung einige.......
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Diskussion
Dieses Protokoll beschreibt traditionelle Dissektionstechniken für den Zugang zur Zölomhöhle. Andere Techniken sind ebenfalls akzeptabel, vorausgesetzt, sie verursachen nur minimale Schäden am Gewebe, das Herz ist zugänglich und die Lunge und der Magen sind sichtbar. Ebenso können die meisten aufgeführten Sezierwerkzeuge leicht durch vergleichbare Gegenstände ersetzt werden.
Obwohl versucht wurde, die Wirksamkeit dieses Verfahrens zu optimieren, können die Ergebnisse je nach Erfahrung und Vari.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch den OD R24 Grant OD031956 und den NICHD R01 Grant HD073104 unterstützt. Wir danken Darcy Kelly für hilfreiche Diskussionen und erste Anregungen zu diesem Protokoll. Wir möchten uns auch bei Samantha Jalbert, Jill Ralston und Wil Ratzan für ihre Hilfe und Unterstützung sowie bei unseren drei anonymen Peer-Reviewern für ihr Feedback bedanken.
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Materialien
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| Sezierschale | Fisher Scinetific | 14-370-284 | Styroporplatten sind eine akzeptable Alternative |
| Euthanasiebehälter | US Plastic | Artikel 2860 | alternative undurchsichtige Behälter akzeptabel |
| Euthanasie-Behälterdeckel | US-Kunststoffartikel | 3047 | |
| Feindissektionsnadeln | Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| Injektionsnadeln für den allgemeinen Gebrauch, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | für X. laevis |
| Injektionsnadeln für den allgemeinen Gebrauch, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | für X. tropicalis |
| Heparin, Darmschleimhaut von Schweinen | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
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Referenzen
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B.
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Nachdrucke und Genehmigungen
