Methodenartikel

Ein katheterbezogenes Candida albicans-Infektionsmodell in der Maus

2.4K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/65307

⸱

22. März 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir etablieren ein Mausmodell der C.albicans-assoziierten katheterassoziierten Infektion (CRI), in dem sich Biofilm auf dem Katheter bildet und die Interaktion zwischen C.albicans und Wirt gut mit der klinischen CRI korreliert. Dieses Modell hilft beim Screening von Therapien für C.albicans-Biofilm-assoziierte CRI und legt damit den Grundstein für die klinische Transformation.

Zusammenfassung

Die katheterassoziierte Infektion (CRI) ist eine häufige nosokomiale Infektion, die durch Candida albicans während der Katheterimplantation verursacht wird. Typischerweise bilden sich Biofilme auf der Außenfläche des Katheters und führen zu disseminierten Infektionen, die für die Patienten tödlich verlaufen. In Kliniken gibt es kein effektives Präventions- und Behandlungsmanagement. Daher ist es dringend erforderlich, ein Tiermodell für CRI für das präklinische Screening neuer Strategien zur Prävention und Behandlung zu etablieren. In dieser Studie wurde ein Polyethylen-Katheter, ein weit verbreiteter medizinischer Katheter, nach der Haarentfernung in den Rücken der BALB/c-Mäuse eingeführt. Candida albicans ATCC MYA-2876 (SC5314), das ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein exprimiert, wurde anschließend entlang des Katheters auf der Hautoberfläche inokuliert. 3 Tage später wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop eine intensive Fluoreszenz auf der Oberfläche des Katheters beobachtet. Mittels Rasterelektronenmikroskopie wurden reife und dicke Biofilme auf der Oberfläche des Katheters gefunden. Diese Ergebnisse deuten auf die Adhäsion, Besiedlung und Biofilmbildung von Candida albicans auf der Katheteroberfläche hin. Die Hyperplasie der Epidermis und die Infiltration von Entzündungszellen in die Hautproben deuteten auf die histopathologischen Veränderungen der CRI-assoziierten Haut hin. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es gelungen ist, ein Maus-CRI-Modell zu etablieren. Es wird erwartet, dass dieses Modell bei der Erforschung und Entwicklung des therapeutischen Managements für Candida albicans-assoziierte CRI hilfreich sein wird.

Einleitung

In den letzten Jahren haben sich mit der Entwicklung und Anwendung biomedizinischer Materialien implantatbedingte Infektionen als schwierige klinische Probleme herauskristallisiert 1,2. Mit der breiten Anwendung von medizinischen Kathetern in Kliniken ist die Zahl der damit verbundenen Infektionen und Todesfälle jedes Jahr enorm 3,4. Zu den häufigsten Infektionswegen einer katheterbedingten Infektion (CRI) gehören: (1) Krankheitserreger auf der Hautoberfläche infiltrieren in den Körper und haften an der Außenfläche des Katheters 5,6,7; (2) unsachgemäße aseptische Krankheitserreger dringen in den Katheter ein, haften an ihm und besiedeln ihn; (3) Krankheitserreger im Blutkreislauf haften am Katheter und siedeln sich an; (4) Arzneimittel, die mit pathogenen Mikroorganismen kontaminiert sind.

Candida ist der dritthäufigste Grund für CRI 8,9. Es ist sehr wahrscheinlich, dass es zu einer Blutstrominfektion und anderen lebensbedrohlichen invasiven Candidiasis kommt, nachdem sich Biofilme auf der Oberfläche des Implantats gebildet haben. Die Prognose ist schlecht und die Sterblichkeitsrate hoch2. Es wird berichtet, dass sich innerhalb von 2 Wochen nach dem Einführen der Zentralvenen Biofilme auf der Oberfläche des Katheters und einige Wochen später im Lumen des Katheters bilden10,11.

Candida albicans (C. albicans) Biofilme, die auf medizinischen Kathetern gebildet werden, weisen ein doppelschichtiges Netzwerk aus Hefe, Stroma und Myzel auf12,13. Die Bildung von Biofilmen von C. albicans ist nicht nur ein Schlüssel für Arzneimittelresistenz und Immunevasion13, sondern auch entscheidend für die Produktion von disseminierten Sporen, was zu einer weiteren hämatogenen Infektionführt 2,12 und zu schwerwiegenderen und sogar lebensbedrohlichen Folgen führt. C. albicans-assoziierte CRI ist eine der Hauptursachen für klinische Pilzinfektionenim Blutkreislauf 7,14, und mehr als 40 % der Patienten mit C. albicans-Infektion im zentralen Venenkatheter entwickeln sich zu einer Bakteriämie15.

Nach Angaben der Infectious Disease Society of America umfasst die empfohlene Behandlung von Candida CRI (1) die Entfernung des infizierten Katheters; (2) die Patienten einer 14-tägigen systemischen antimykotischen Therapiezu unterziehen 8; (3) Reimplantation eines neuen Katheters4. In der klinischen Anwendung können Katheter jedoch manchmal nicht vollständig entfernt werden. Einige Patienten können nur mit systemischen Antibiotika und einer antimikrobiellen Lock-Therapie behandelt werden, die mit starken Nebenwirkungen einhergeht16,17.

Bestehende Tiermodelle von C. albicans, wie z. B. das oropharyngeale Candidiasis-Modell, das vaginale Candidiasis-Modell und das invasive systemische Infektionsmodell, das durch Candidiasis verursacht wird18,19, können nicht gut mit dem klinischen CRI korrelieren. Daher wurde in dieser Studie ein C. albicans-assoziiertes CRI-Modell in Mäusen etabliert. Als subkutane Implantate wurden klinisch häufig verwendete Polyethylenkatheter verwendet20,21, und C. albicans wurden auf die Hautoberfläche inokuliert, um die Adhäsion von C. albicans an den medizinischen Kathetern und die Bildung von Biofilmen zu simulieren.

Dieses Modell wurde in unserem Labor erfolgreich eingesetzt, um die Anti-Biofilm-Wirkung verschiedener Therapeutika zu untersuchen22. Darüber hinaus wurde aufgrund der verzögerten Detektion von C. albicans nach Katheterinfektion ein C. albicans-Stamm mit verstärktem grün fluoreszierendem Protein (EGFP) konstruiert und in Mäusen inokuliert, um die intuitive Beobachtung der Kolonien und Biofilme von C. albicans auf dem implantierten Katheter zu erleichtern.

Protokoll

Die Versuchstiere, männliche BALB/c-Mäuse (12-16 g), wurden vom Laboratory Animal Center des Xi'an Jiaotong University Health Science Center gekauft. Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Ethics Committee der Xi'an Jiaotong University mit der Lizenznummer SCXK (Shaanxi) 2021-103 genehmigt.

1. Vorbereitung des Puffers und der Ausrüstung

  1. Transfect C. albicans-Stämme mit einem hochexprimierten Plasmid pCaExp.
    1. Kaufen Sie C. albicans (SC5314) von ATCC. Man erhält den EGFP-Hochexpressions-Fluoreszenzstamm22 durch Transfizierung von C. albicans mit einem Hochexpressionsplasmid pCaExp, das den vollständigen offenen Leserahmen des EGFP-Gens enthält (die Plasmidkarte ist in Abbildung 1 dargestellt), und verwendet diese für nachfolgende Experimente.
  2. Kultivierung der transfizierten C. albicans-Stämme .
    1. Wählen Sie monoklonale Kolonien des fluoreszierenden Stamms von C. albicans aus der Platte des Hefeextrakts Pepton-Dextrose-Medium (YPD) aus und kultivieren Sie sie über Nacht (30 °C und 220 U/min) in 5 ml YPD-Flüssigmedium (YPD + 50 μg/ml Carbenicillin).
    2. Resuspendieren Sie die C. albicans in normaler Kochsalzlösung nach Zentrifugation bei 400 x g für 5 min bei RT.
    3. Die Konzentration der C. albicans-Suspension wird auf 1 x 108 Zellen/ml eingestellt, indem die Trübung mit dem McFarland-Standard von 0,5 verglichen wird.
  3. Bereiten Sie die chirurgischen Instrumente vor.
    1. Stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente (Schere, Pinzette, hämostatische Pinzette, Nadelhalter, Nahtnadeln) 30 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert werden. Zum Einsatz kommen sterile Polyethylen-Katheter (Innendurchmesser: 0,28 mm; Außendurchmesser: 0,63 mm).
      HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Katheter wurden mit Ethylenoxidgas sterilisiert und die Verpackung wurde auf einem ultrareinen Tisch geöffnet, der mehr als 30 Minuten lang UV-Strahlen ausgesetzt war. Vor der Implantation in Mäuse wurden die Katheter in 75%iges Ethanol getaucht, um eine Kontamination zu verhindern.

2. Etablierung eines Maus-CRI-Modells

HINWEIS: Das chirurgische Verfahren ist in Abbildung 2 dargestellt.

  1. Akklimatisieren Sie 30 BALB/c-Mäuse (12-16 g, männlich) unter spezifisch pathogenfreien (SPF) Bedingungen mit freiem Zugang zu Wasser und Futter und 12 h-12 h abwechselndem Hell- und Dunkelzyklus.
  2. 30 BALB/c-Mäuse werden nach dem Zufallsprinzip in drei Gruppen eingeteilt (n = 10 Mäuse/Gruppe): (A) normale Kontrollgruppe; (B) Kathetergruppe (Katheter, die ohne C. albicans implantiert wurden); (C) Modellgruppe (Katheter, die mit C. albicans implantiert wurden).
  3. Betäuben Sie die Mäuse mit 1-4% Isofluran und legen Sie die Mäuse in Bauchlage auf einen Operationstisch. Der Verlust des Aufrichtungsreflexes und das Ausbleiben einer Reaktion auf die Zehenstimulation bestätigen die erfolgreiche Anästhesie. Entfernen Sie die Haare und sterilisieren Sie die Operationsstelle mit drei abwechselnden Runden Jodophor- oder Chlorhexidin- und Alkoholpeelings.
  4. Lassen Sie die Mäuse ohne Behandlung in der normalen Kontrollgruppe und gewähren Sie freien Zugang zu Futter und Wasser.
  5. Bei den Mäusen in der Katheter- und Modellgruppe sollte die Anästhesie bei 3 % Isofluran beibehalten werden. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe, indem Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren, und passen Sie die Isoflurankonzentration nach Bedarf an.
  6. Bei den Mäusen in der Kathetergruppe wird eine sterile 1-ml-Spritzennadel intradermal in den rückenenthaarten Bereich eingeführt, um ein Loch zu bohren. Führen Sie einen Katheter (ca. 1 cm lang) in das Loch ein, nachdem Sie die Spritzennadel entfernt haben.
  7. Bei den Mäusen in der Modellgruppe werden 20 μl C. albicans-Suspension auf den Rückenthaarungsbereich pipettiert, um die kommensale C. albicans auf der Haut zu simulieren.
  8. Nachdem die Lösung von der Haut absorbiert wurde, führen Sie einen Katheter in den rückenenthaarten Bereich ein, wobei die gleichen Verfahren wie in Schritt 2.5 beschrieben sind.
  9. Pipettieren Sie weitere 20 μl C. albicans-Suspension entlang des Katheters in das Gewebe, um C. albicans in der äußeren Umgebung zu simulieren.
  10. Befestigen Sie die Katheter mit Klebeband und Gaze und setzen Sie die Mäuse zur Fütterung in die Käfige zurück. Am Ende der Behandlung injizieren Sie den Mäusen an drei aufeinanderfolgenden Tagen Meloxicam (4 mg/kg) als Analgesie.
    HINWEIS: Nach der Operation wurden die Mäuse vorsichtig mit Wasser und Futter gefüttert. Die Mäuse wurden zweimal täglich überwacht. Mäuse wurden mit einer von der IACUC zugelassenen Methode euthanasiert, wenn sie Schwierigkeiten bei der Fütterung, einen signifikanten Gewichtsverlust (10-20%) und Unterkühlung hatten.

3. Evaluierung des CRI-Modells

  1. Nach 3 Tagen werden die Mäuse mit 3% Isofluran betäubt und durch Zervixluxation geopfert. Entnehmen Sie die Katheter und Hautgewebeproben von der Rückseite der Mäuse.
  2. Beobachten Sie C. albicans und Biofilme auf dem Katheter mittels Rasterelektronenmikroskopie.
    1. Die Katheter werden 48 h lang bei 4 °C in eine 2,5%ige Glutaraldehydlösung getaucht. Spülen Sie die Katheter dreimal mit sterilem PBS.
    2. Fixieren Sie die Katheter 3 h lang mit 1%iger Osmsäure und spülen Sie sie dreimal mit sterilem PBS.
    3. Dehydrieren Sie die Zellen auf den Kathetern in Gradienten-Ethanollösung mit aufsteigenden Konzentrationen (50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 %, 15 min/Gradient).
    4. Die Katheter werden dreimal (jeweils 30 min) in tert-Butylalkohol getaucht.
    5. Frieren Sie die Katheter schnell in flüssigem Stickstoff ein und gefriertrocknen Sie die Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers in einem Gefriertrockner.
    6. Die Katheterproben werden durch eine Ionenstrahlabscheidung mit einem 10-nm-Gold bestrichen.
    7. Beobachten Sie das Vorhandensein von C. albicans und seinem Biofilm auf der Katheteroberfläche jeder Gruppe unter einem Rasterelektronenmikroskop (unter Hochvakuum, 1,5 kV-Bedingungen) und zeichnen Sie die Bilder in jeder Gruppe auf.
  3. Beobachten Sie C. albicans am Katheter mittels Fluoreszenzmikroskopie.
    1. Die Katheter werden 48 Stunden lang bei 4 °C in 4%ige Paraformaldehydlösung zur Fixierung getaucht.
    2. Beobachten Sie das Vorhandensein von C. albicans und seinem Biofilm auf der Katheteroberfläche jeder Gruppe mit einem Fluoreszenzmikroskop unter 484 nm Anregung und zeichnen Sie die Bilder in jeder Gruppe auf.
      HINWEIS: Die Vergrößerung beträgt 400x. Die Fluoreszenz von Candida albicans kann mit Anregung bei 490 nm und Emission bei 510 nm beobachtet werden.
  4. Beobachten Sie C. albicans , die sich in der Haut der Maus befinden.
    1. Das dorsale Hautgewebe von Mäusen wird zur Fixierung bei 4 °C 48 h lang in 4%ige Paraformaldehydlösung getaucht.
    2. Dehydrieren Sie das dorsale Hautgewebe in einer Gradienten-Ethanollösung mit aufsteigenden Konzentrationen (50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 %, 15 min/Gradient).
    3. Betten Sie das dehydrierte dorsale Hautgewebe bei 55-60 °C in Paraffin ein. Achten Sie auf die Temperatur, um sprödes Gewebe zu vermeiden. Um so viele Verunreinigungen wie möglich zu entfernen, wiederholen Sie diesen Schritt dreimal (jeweils 30 min).
    4. Das dorsale Hautgewebe (Dicke = 5 μm) wird mit einem Mikrotom geschnitten.
    5. Entwachsen Sie die Paraffinabschnitte, indem Sie die Objektträger zweimal für 20 Minuten in Xylol tauchen.
    6. Rehydrieren Sie die Abschnitte durch Eluieren mit Gradientenethanol (absolutes Ethanol, 90 % Ethanol, 75 % Ethanol, Wasser) für jeweils 5 Minuten.
    7. Färben Sie die Abschnitte mit Periodensäure, indem Sie die Schnitte 15 Minuten lang in die Periodensäurelösung tauchen, bevor Sie sie einmal mit fließendem Wasser und zweimal mit destilliertem Wasser waschen.
    8. Färben Sie die Abschnitte mit einer Chevron-Färbelösung (gemäß Herstelleranweisung) 30 Minuten lang im Dunkeln und spülen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang unter fließendem Wasser ab.
    9. Tauchen Sie die Abschnitte 3-5 Minuten lang in Hämatoxylinlösung, bevor Sie sie mit fließendem Wasser (2-3 Minuten), differenzierter Lösung (5-10 Minuten) bzw. fließendem Wasser waschen.
    10. Tauchen Sie die Abschnitte dreimal (je 5 Minuten) in Ethanol und zweimal (je 5 Minuten) in Xylol, bevor Sie den Abschnitt mit neutralem Gummi versiegeln.
    11. Betrachten Sie die Bilder der Probe mit einem Mikroskop und analysieren Sie die Rückstände von C. albicans in der Haut der Maus.
      HINWEIS: Die Vergrößerung beträgt 10x für das Okular und 4x oder 10x für die Objektivlinse.
  5. Beobachten Sie die histopathologischen Veränderungen im dorsalen Hautgewebe.
    1. Das dorsale Hautgewebe wird 48 Stunden lang bei 4 °C in 4%ige Paraformaldehydlösung zur Fixierung getaucht. Dehydrieren Sie das dorsale Hautgewebe in Gradienten-Ethanollösung mit aufsteigenden Konzentrationen (50 %, 70 %, 80 %, 90 % und 100 %, 15 min/Gradient).
    2. Betten Sie das dehydrierte Rückenhautgewebe in Paraffin ein, wie in Schritt 3.4.3 beschrieben.
    3. Das dorsale Hautgewebe (Dicke = 5 mm) wird mit einem Mikrotom durchtrennt.
    4. Entwachsen Sie die Paraffinabschnitte, indem Sie die Objektträger zweimal für 20 Minuten in Xylol tauchen.
    5. Rehydrieren Sie die Abschnitte durch Eluieren mit Gradientenethanol (absolutes Ethanol, 90 % Ethanol, 75 % Ethanol, Wasser) für jeweils 5 Minuten.
    6. Färben Sie die Abschnitte 4 Minuten lang mit Hämatoxylin, bevor Sie sie mit Leitungswasser abspülen, um die Farbe des Schwimmers zu entfernen.
    7. Differenzieren Sie die Probe mit 1%iger Salzsäure-Ethanol-Lösung, bevor Sie die Objektträger mit fließendem Wasser abspülen.
    8. Tauchen Sie die Probe 5 Minuten lang in 85%iges und 95%iges Ethanol und färben Sie sie 3 Minuten lang mit Eosinlösung.
    9. Dehydrieren Sie die Probe, indem Sie sie jeweils 2 Minuten lang in Gradientenethanol (70 %, 90 %, 95 % und 100 %) und Xylol eintauchen.
    10. Versiegeln Sie die Probe mit neutralem Harz.
    11. Betrachten Sie die Bilder der Probe mit einem Mikroskop und analysieren Sie die pathologischen Veränderungen.

Ergebnisse

Die C. albicans und Biofilme auf den Kathetern konnten vom REM beobachtet werden. Wie in Abbildung 322 gezeigt, war die Oberfläche der Polyethylenkatheter in der Kathetergruppe glatt, und es wurden keine anhaftenden pathogenen Mikroorganismen beobachtet. Auf der Oberfläche der Polyethylenkatheter in der Modellgruppe waren jedoch reife und dichte C. albicans-Biofilme sichtbar, was darauf hindeutet, dass C. albicans unter den experimentellen Bedingungen erfolgreich Biofilme auf der Katheteroberfläche von Mäusen besiedeln und bilden konnten. Darüber hinaus bestätigten die Ergebnisse der Fluoreszenzmikroskopie die oben genannten Schlussfolgerungen weiter (Abbildung 4)22. Es gab keine offensichtliche Fluoreszenz auf der Oberfläche der Polyethylenkatheter in der Kathetergruppe. In der Modellgruppe war jedoch eine starke Fluoreszenz, die von adhärenten C. albicans-Zellen emittiert wurde, auf der Katheteroberfläche sichtbar. Dies deutete darauf hin, dass eine große Anzahl von C. albicans-Zellen an der Oberfläche der Katheter haftete, was die erfolgreiche Konstruktion von C. albicans-Biofilm-verwandten CRI-Modellen in Mäusen zeigte.

Um die Infektion von Hautgewebe von Mäusen intuitiver zu verifizieren, wurde eine Sheff Periodate-Färbeanalyse durchgeführt. Es detektiert die Kohlenhydrate der Pilzzellen, was in der klinischen Forschung häufig verwendet wird (Abbildung 5)22. Das Hautgewebe in der normalen Kontroll- und Kathetergruppe wurde negativ mit Periodsäure-Schiff (PAS) gefärbt, was auf das Fehlen von C. albicans-Zellen im Gewebe hindeutete . In der Modellgruppe wurde eine kleine Anzahl positiver PAS-gefärbter C. albicans-Zellen beobachtet, was die erfolgreiche Simulation der Invasion und Adhäsion von C. albicans weiter bestätigt.

Als nächstes wurden die pathologischen Veränderungen im Hautgewebe von Mäusen, die durch C. albicans induziert wurden, durch histopathologische Analyse untersucht. Wie in Abbildung 622 dargestellt, war die Epidermisschicht in der Modellgruppe deutlich verdickt und bis zum inneren Teil der Haut ausgedehnt. Eine Entzündungsinfiltration war ebenfalls sichtbar, was darauf hindeutet, dass die Infektion mit C. albicans offensichtliche pathologische Veränderungen im Hautgewebe der Maus verursachte. Die Epidermisschicht, die Dermisschicht, die Talgdrüsen, die Haarfollikel und andere Strukturen waren in der Kathetergruppe klar und vollständig. Es wurden keine Ödeme und Entzündungen beobachtet, ähnlich wie bei der normalen Kontrollgruppe. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass das Einführen des Katheters allein keine offensichtlichen Veränderungen im Hautgewebe verursachte. Die pathologischen Veränderungen in den Geweben der Modellgruppe resultierten aus der Infektion durch C. albicans. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse die erfolgreiche Etablierung eines CRI-Mausmodells, das mit dem Biofilm von C. albicans assoziiert ist .

figure-results-1
Abbildung 1: pCaExp Plasmid-Atlas. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

figure-results-2
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Vorgehens des C.albicans-assoziierten CRI-Mäusemodells. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: REM auf der Oberfläche des Katheters in jeder Gruppe. (A) Kathetergruppe; (B) Modellgruppe (1000x, Maßstabsbalken = 50 μm; 5000x, Maßstabsbalken = 10 μm). Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Mo et al.22 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Katheteroberflächenfluoreszenzmikroskopie in jeder Gruppe. (A) Kathetergruppe; (B) Modellgruppe (Maßstabsbalken = 100 μm). Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Mo et al.22 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-5
Abbildung 5: H&E-Färbung der Rückhaut von Mäusen in jeder Gruppe. (A) Kathetergruppe; (B) Modellgruppe; (C) Kontrollgruppe, (40x, Maßstabsbalken = 400 μm; 100x, Maßstabsbalken = 200 μm). Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Mo et al.22 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-6
Abbildung 6: PAS-Färbung der Rückhaut von Mäusen in jeder Gruppe. (A) Kathetergruppe; (B) Modellgruppe; (C) Kontrollgruppe, (40x, Maßstabsbalken = 400 μm; 100x, Maßstabsbalken = 200 μm). In der Modellgruppe (rote Rechtecke) ist eine deutliche Verdickung und Ausdehnung der Epidermisschicht auf das Innere der Haut zu erkennen. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Mo et al.22 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diskussion

CRI ist eine der häufigsten nosokomialen Infektionen in der klinischen Praxis23. Krankheitserreger in den Hautanhangsgebilden, wie Epidermis, Talgdrüsen und Haarfollikeln, sind mögliche Ursachen für CRI23,24. Candida ist der drittgrößte Erreger, der CRI verursacht, wobei Candida albicans die häufigste Form der Biofilminfektion war25,26. Daher haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein relevantes Tiermodell für Candida albicans Biofilm-assoziierte CRI zu erstellen, um die Behandlung und Prävention von verwandten CRI zu unterstützen.

Um das CRI-Modell zu konstruieren, wurde der dorsalen Haut von Mäusen eine kleine Menge C . albicans zugesetzt, die die klinische Situation simuliert, in der ein Teil der C. albicans in den tiefen Geweben und Anhängseln der Haut nicht vollständig durch routinemäßige Sterilisation eliminiert werden kann. Nach der Implantation des Katheters wurde C. albicans erneut inokuliert, um das Vorhandensein von C. albicans in der äußeren Umgebung während der Operation nachzuahmen.

In dieser Studie wurde für die Modellkonstruktion ein 3-Tage-Zeitpunkt gewählt, der aufgrund der Schwierigkeit der Biofilmbildung niedriger ist als der der traditionellen C. albicans-Biofilm-verwandten Tiermodelle18,27. Nach der Infektion waren in diesem Modell die Adhäsion und die Biofilmbildung von C. albicans auf der Katheteroberfläche sichtbar, was durch die Ergebnisse der REM- und Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen wurde (Abbildung 3 und Abbildung 4). Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Konzentration von C. albicans in dieser Studie 1 × 108 KBE/ml betrug, was viel höher war als in anderen Tiermodellen18,27. Außerdem steht die Haut um den Katheter herum in ständigem Kontakt mit der äußeren Umgebung. Um die extremen Umgebungen, denen CRI ausgesetzt sein kann, zu simulieren, wurden C. albicans nach der Operation erneut geimpft.

Das Wiederauftreten der Infektion wird häufig durch Krankheitserreger verursacht, die im umgebenden Gewebe verbleiben 23,28,29. Daher ist das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Krankheitserregern im Gewebe für CRI wichtig. In dieser Arbeit wurde eine PAS-Färbung durchgeführt, um die Rückstände von C. albicans im Hautgewebe zu untersuchen. Diese Methode könnte auch verwendet werden, um die Clearance-Wirkung neuer therapeutischer Medikamente oder Methoden für CRI zu bewerten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein Candida albicans-Stamm mit eGFP verwendet wurde, um ein Maus-CRI-Modell zu konstruieren, um die intuitive Beobachtung der Candida albicans-Besiedlung auf Kathetern zu erleichtern. Dieser Stamm kann auch verwendet werden, um die Interaktion zwischen Candida albicans und Wirtszellen zu bewerten, z. B. die Invasion und Adhäsion von Candida albicans am Wirt, die Anti-Candida albicans-Wirkung von Therapeutika und die Immunantwort. Außerdem wurde eine zweistufige Inokulationsmethode verwendet, um Krankheitserreger aus der äußeren Umgebung und dem Körper zu simulieren. Es ist erwähnenswert, dass eine anschließende mikrobielle Kultur nach der Infektion nicht durchgeführt wurde. Das Vorhandensein von Biofilmen ist ein wichtiger Faktor für die geringe Empfindlichkeit von Kulturen 30,31,32. Frühere Berichte deuten darauf hin, dass die mikrobielle Kultur nach der Infektion eine geringe Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit aufwies 30,31,32,33,34. Stattdessen ist das Vorhandensein von Biofilmen auf dem Implantat ein zuverlässigerer Index. Daher wurden in dieser Studie REM- und Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um Candida albicans, die Biofilme bilden, sichtbar zu machen und zu identifizieren.

Dieses Modell simulierte jedoch nicht die Wechselwirkung zwischen der geschwächten Immunität des Patienten und der in Kliniken beobachteten Candida albicans-Infektion . Wenn das Modell die immungeschwächten Behandlungen (z. B. kontinuierliche Injektionen von Glukokortikoiden)35 vor der Inokulation von Candida albicans berücksichtigen könnte, wäre es möglich, Infektionen, die in klinischen Situationen auftreten, besser zu simulieren.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass ihnen keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen bekannt sind, die den Anschein erwecken könnten, dass sie die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben.

Danksagungen

Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch die Natural Science Foundation of Shaanxi Province (Fördernummer 2021SF-118) und die National Natural Science Foundation of China (Fördernummern 81973409, 82204631).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
2,5 % Glutaraldehyd-FixierlösungXingzhi Biotechnology Co., LtdDF015
4 ° C KühlschrankElectrolux (China) Electric Co., LtdESE6539TA
AgarBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
AnalysenwaagenShimadzuATX124
Autoklaven SterilisatorSANYOMLS-3750
ButanolTianjin Chemio Reagent Co., Ltd200-889-7
CarbenicillinAmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon aufrechtes optisches Mikroskop NikonEclipse Ts2-FL
GlukoseMacklin 
ImpfringThermo Scientific251586
IsofluranRWD20210103
ParaformaldehydBeyotime BiotechnologyP0099
PAS Farbstoff KitServicebioG1285
PeptonBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-001
Polyethylen-KatheterShining Plastic MallPE100
RWD R550 Mehrkanal-Anästhesiegerät für Kleintiere RWDR550
SEMHitachiTM-1000
TemperaturinkubatorShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
ReinstwassergeneratorHeal ForceNW20VF
UltraschallgerätDo-ChromDS10260D
XylolSinopharm  Chemical Reagent Co., Ltd10023428
HefeextraktThermo Scientific  Oxoid-LP0021B
D823520

Referenzen

  1. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. microbiology reviews. 17 (2), 255-267 (2004).
  2. Giri, S., Kindo, A. J. A review of Candida species causing blood stream infection. Indian Journal of Medical Microbiology. 30 (3), 270-278 (2012).
  3. Weinstein, R. A., Darouiche, R. O. Device-associated infections: A macroproblem that starts with microadherence. Clinical Infectious Diseases. 33 (9), 1567-1572 (2001).
  4. Mermel, L. A., et al. Guidelines for the management of intravascular catheter-related infections. Clinical Infectious Diseases. 32 (9), 1249-1272 (2001).
  5. Seidler, M., Salvenmoser, S., Müller, F. -M. C. In vitro effects of micafungin against Candida biofilms on polystyrene and central venous catheter sections. International Journal of Antimicrobial Agents. 28 (6), 568-573 (2006).
  6. Chaves, F., et al. Diagnosis and treatment of catheter-related bloodstream infection: Clinical guidelines of the Spanish Society of Infectious Diseases and Clinical Microbiology and (SEIMC) and the Spanish Society of Spanish Society of Intensive and Critical Care Medicine and Coronary Units (SEMICYUC). Medicina Intensiva. 42 (1), 5-36 (2018).
  7. Raad, I. I., Bodey, G. P. Infectious complications of indwelling vascular catheters. Clinical Infectious Diseases. 15 (2), 197-208 (1992).
  8. Paul DiMondi, V., Townsend, M. L., Johnson, M., Durkin, M. Antifungal catheter lock therapy for the management of a persistent Candida albicans bloodstream infection in an adult receiving hemodialysis. Pharmacotherapy. 34 (7), e120-e127 (2014).
  9. Bouza, E., Guinea, J., Guembe, M. The role of antifungals against candida biofilm in catheter-related candidemia. Antibiotics (Basel). 4 (1), 1-17 (2014).
  10. Raad, I., et al. Ultrastructural analysis of indwelling vascular catheters: a quantitative relationship between luminal colonization and duration of placement. The Journal of Infectious Diseases. 168 (2), 400-407 (1993).
  11. Yousif, A., Jamal, M. A., Raad, I. Biofilm-based central line-associated bloodstream infections. Advances in Experimental Medicine and Biology. 830, 157-179 (2015).
  12. Douglas, L. J. Candida biofilms and their role in infection. Trends in Microbiology. 11 (1), 30-36 (2003).
  13. Mack, D., et al. Biofilm formation in medical device-related infection. International Journal of Artificial Organs. 29 (4), 343-359 (2006).
  14. Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (5), 1727-1732 (2004).
  15. Anaissie, E. J., Rex, J. H., Uzun, O., Vartivarian, S. Predictors of adverse outcome in cancer patients with candidemia. The American Journal of Medicine. 104 (3), 238-245 (1998).
  16. Fujimoto, K., Takemoto, K. Efficacy of liposomal amphotericin B against four species of Candida biofilms in an experimental mouse model of intravascular catheter infection. Journal of Infection and Chemotherapy. 24 (12), 958-964 (2018).
  17. Shuford, J. A., Rouse, M. S., Piper, K. E., Steckelberg, J. M., Patel, R. Evaluation of caspofungin and amphotericin B deoxycholate against Candida albicans biofilms in an experimental intravascular catheter infection model. The Journal of Infectious Diseases. 194 (5), 710-713 (2006).
  18. Koh, A. Y., Köhler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35(2008).
  19. Tucey, T. M., et al. Glucose homeostasis is important for immune cell viability during candida challenge and host survival of systemic fungal infection. Cell Metabolism. 27 (5), 988-1006 (2018).
  20. Lawrence, E. L., Turner, I. G. Materials for urinary catheters: a review of their history and development in the UK. Medical Engineering & Physics. 27 (6), 443-453 (2005).
  21. Schumm, K., Lam, T. B. Types of urethral catheters for management of short-term voiding problems in hospitalized adults: a short version Cochrane review. Neurourology and Urodynamics. 27 (8), 738-746 (2008).
  22. Mo, F., et al. Development and evaluation of a film forming system containing myricetin and miconazole nitrate for preventing candida albicans catheter-related infection. Microbial Drug Resistance. 28 (4), 468-483 (2022).
  23. Balikci, E., Yilmaz, B., Tahmasebifar, A., Baran, E. T., Kara, E. Surface modification strategies for hemodialysis catheters to prevent catheter-related infections: A review. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 109 (3), 314-327 (2021).
  24. María, L. T., Alejandro, G. S., María Jesús, P. G. Central venous catheter insertion: Review of recent evidence. Best Practice & Research. Clinical Anaesthesiology. 35 (1), 135-140 (2021).
  25. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 255-267 (2004).
  26. He, Y., et al. Retrospective analysis of microbial colonization patterns in central venous catheters, 2013-2017. Journal of Healthcare Engineering. 2019, 8632701(2019).
  27. Mo, F., et al. In vitro and in vivo effects of the combination of myricetin and miconazole nitrate incorporated to thermosensitive hydrogels on C. albicans biofilms. Phytomedicine. 71, 153223(2020).
  28. Cantón-Bulnes, M. L., Garnacho-Montero, J. Practical approach to the management of catheter-related bloodstream infection. Revista Espanola de Quimioterapia. 32 Suppl 2 (Suppl 2), 38-41 (2019).
  29. Böhlke, M., Uliano, G., Barcellos, F. C. Hemodialysis catheter-related infection: prophylaxis, diagnosis and treatment. The Journal of Vascular Access. 16 (5), 347-355 (2015).
  30. Fang, X., et al. Effects of different tissue specimen pretreatment methods on microbial culture results in the diagnosis of periprosthetic joint infection. Bone & Joint Research. 10 (2), 96-104 (2021).
  31. Naumenko, Z. S., Silanteva, T. A., Ermakov, A. M., Godovykh, N. V., Klushin, N. M. Challenging diagnostics of biofilm associated periprosthetic infection in immunocompromised patient: A clinical case. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 7 (5), 786-790 (2019).
  32. Cai, Y., et al. Metagenomic next generation sequencing improves diagnosis of prosthetic joint infection by detecting the presence of bacteria in periprosthetic tissues. International Journal of Infectious Diseases. 96, 573-578 (2020).
  33. Samanipour, A., Dashti-Khavidaki, S., Abbasi, M. R., Abdollahi, A. Antibiotic resistance patterns of microorganisms isolated from nephrology and kidney transplant wards of a referral academic hospital. Journal of Research in Pharmacy Practice. 5 (1), 43-51 (2016).
  34. Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans. Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).
  35. Garlito-Díaz, H., et al. A new antifungal-loaded sol-gel can prevent candida albicans prosthetic joint infection. Antibiotics (Basel). 10 (6), 711(2021).

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

KatheterinfektionMausinfektionsmodellBiofilmbildungKatheterbiofilmPolyethylenkatheterFluoreszenzmikroskopieRasterelektronenmikroskopieHauthistopathologieInfiltration von Entzündungszellen
Ein katheterbezogenes Candida albicans-Infektionsmodell in der Maus
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.