Summary
Questo protocollo presenta un modo unico di generare colture cellulari del sistema nervoso centrale da cervelli di topo embrionali del giorno 17 per la ricerca neuro(immuno)logica. Questo modello può essere analizzato utilizzando varie tecniche sperimentali, tra cui RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria a flusso.
Abstract
I modelli del sistema nervoso centrale (SNC) devono ricapitolare la complessa rete di cellule interconnesse trovate in vivo. Il SNC è costituito principalmente da neuroni, astrociti, oligodendrociti e microglia. A causa dei crescenti sforzi per sostituire e ridurre l'uso di animali, sono stati sviluppati una varietà di sistemi di coltura cellulare in vitro per esplorare le proprietà cellulari innate, che consentono lo sviluppo di terapie per infezioni e patologie del SNC. Mentre alcune domande di ricerca possono essere affrontate da sistemi di coltura cellulare basati sull'uomo, come le cellule staminali pluripotenti (indotte), lavorare con cellule umane ha i suoi limiti per quanto riguarda la disponibilità, i costi e l'etica. Qui, descriviamo un protocollo unico per isolare e coltivare cellule da cervelli di topo embrionali. Le colture di cellule neurali miste risultanti imitano diverse popolazioni cellulari e interazioni trovate nel cervello in vivo. Rispetto agli attuali metodi equivalenti, questo protocollo imita più da vicino le caratteristiche del cervello e raccoglie anche più cellule, consentendo così di studiare più condizioni sperimentali da un topo gravido. Inoltre, il protocollo è relativamente facile e altamente riproducibile. Queste colture sono state ottimizzate per l'uso su varie scale, tra cui schermi ad alta produttività basati su 96 pozzetti, analisi al microscopio a 24 pozzetti e colture a 6 pozzetti per la citometria a flusso e l'analisi della reazione a catena quantitativa della polimerasi a trascrizione inversa (RT-qPCR). Questo metodo di coltura è un potente strumento per studiare l'infezione e l'immunità nel contesto di alcune delle complessità del SNC con la comodità dei metodi in vitro .
Introduction
Migliorare la nostra comprensione del sistema nervoso centrale (SNC) è fondamentale per migliorare le opzioni terapeutiche per molte malattie neuroinfiammatorie e neurodegenerative. Il SNC, una complessa rete di cellule interconnesse all'interno del cervello, del midollo spinale e dei nervi ottici, comprende neuroni, oligodendrociti, astrociti e le loro cellule immunitarie innate, la microglia1. Un approccio in vitro può spesso ridurre drasticamente il numero di topi necessari per eseguire ricerche significative; tuttavia, la natura complessa del SNC rende impossibile ricapitolare la situazione in vivo utilizzando linee cellulari. Le colture miste di cellule neurali forniscono uno strumento di ricerca estremamente prezioso per indagare le questioni neuro(immuno)logiche in un modello pertinente, in linea con i principi di sostituzione, riduzione e raffinamento (3R) 2,3.
Thomson et al. hanno descritto un metodo di coltura cellulare utilizzando cellule del midollo spinale prenatale che si differenziano in tutti i suddetti principali tipi di cellule del SNC4. Questo sistema ha anche formazione di sinapsi, assoni mielinizzati e nodi di Ranvier. Il limite principale di questo metodo di coltura è che, essendo il midollo spinale, non modella utilmente il cervello, e le rese cellulari dal giorno embrionale 13 (E13) del midollo spinale sono costrittive. Pertanto, questo limita il numero di condizioni sperimentali che possono essere studiate. Pertanto, questo studio mirava a sviluppare un nuovo sistema di coltura cellulare che ricapitola le caratteristiche del cervello con una maggiore resa cellulare per ridurre i requisiti per gli animali.
Usando Thomson et al. come punto di partenza, abbiamo sviluppato un modello di coltura cellulare derivato esclusivamente dal cervello prenatale del topo. Queste colture hanno le stesse popolazioni cellulari, interconnettività e opzioni di trattamento delle colture del midollo spinale, tranne che c'è meno mielinizzazione in confronto. Tuttavia, avere un modello in vitro sul SNC con una resa cellulare circa tre volte superiore è più efficiente, richiedendo meno topi e meno tempo per elaborare gli embrioni. Abbiamo ottimizzato questo esclusivo sistema di coltura per molteplici applicazioni e bilance a valle, incluso l'utilizzo di vetrini di copertura per l'analisi al microscopio e varie dimensioni di lastre di plastica, comprese le lastre a 96 pozzetti per la ricerca ad alta produttività.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono conformi alle leggi e alle linee guida locali per l'uso degli animali e sono stati approvati dal locale Comitato di revisione etica dell'Università di Glasgow. Gli animali sono stati alloggiati in specifiche condizioni prive di agenti patogeni in conformità con il UK Animals Scientific Procedures Act 1986, sotto gli auspici di una licenza di progetto del Ministero degli Interni del Regno Unito. Per questo studio, sono stati utilizzati topi adulti C57BL / 6J allevati internamente. L'uso di giovani donne (8-12 settimane) è raccomandato a causa del più alto tasso di successo della gravidanza; I maschi possono essere riutilizzati per più cicli di riproduzione. La Figura 1 rappresenta una panoramica schematica del metodo descritto per generare colture miste neuronali e gliali.
1. Preparazione dei materiali di consumo per la coltura tissutale
- Preparare le piastre e/o le stoviglie contenenti i vetrini di copertura per microscopia all'interno di un armadio di sicurezza di Classe 2. Sterilizzare tutti i reagenti o l'autoclave per garantire la sterilità durante il periodo di coltura.
- Aggiungere il volume appropriato di BA-PLL (13,2 μg/mL di poli-L-lisinebromidrato [PLL] nel tampone di acido borico [BA] [50 mM di acido borico, 12,5 mM di tetraborato di sodio, pH 8,5]; vedere la tabella dei materiali) a ciascun pozzetto (1.000 μL/pozzetto in una piastra a 6 pozzetti, 100 μL/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti; i volumi sono riassunti nella Tabella 1). Per i vetrini di copertura per microscopia, aggiungere 20 ml di BA-PLL a un piatto di coltura tissutale di 9 cm di diametro contenente 200 vetrini sterili e ruotare per distribuire uniformemente.
- Incubare a 37 °C per 1-2 h.
- Rimuovere la soluzione BA-PLL da ciascun pozzetto o piatto contenente i vetrini di copertura della microscopia e lavare aggiungendo 20 ml di acqua sterile, ruotando i vetrini di copertura e quindi rimuovendo l'acqua. Ripetere questo passaggio di lavaggio tre volte. Per un piatto contenente coverslips, lasciare acqua sterile nel piatto di coltura di tessuto al lavaggio finale per rimuovere facilmente i coprifogli.
- Rimuovere quanto più liquido possibile con una pipetta sterile e lasciare asciugare per almeno 2 ore a tutta la notte.
- Conservare le piastre rivestite a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
NOTA: L'acido borico preparato con soluzione di poli-l-lisina (BA-PLL) può essere riutilizzato fino a tre volte, aggiungendo ogni volta nuovo PLL. Conservare il BA-PLL a 4 °C. I piatti sono trattati con BA-PLL, poiché il PLL consente alle cellule di attaccarsi e crescere. Senza questo trattamento, le cellule si solleveranno dopo circa 1 settimana di coltura e non saranno più in grado di differenziarsi.
2. Dissezione del cervello embrionale E17
- Co-ospitare uno o più topi femmina con un topo maschio. Controlla quotidianamente le femmine per un tappo di muco, indicando che l'accoppiamento ha avuto luogo.
NOTA: Tutti i topi femmina "collegati" devono essere separati dal maschio per garantire la corretta data di inizio della gestazione. I topi possono essere pesati per confermare la gravidanza o monitorati visivamente. - Tagliare il topo gravido a E17 utilizzando metodi appropriati in conformità con le linee guida e le leggi locali sul benessere degli animali, ad esempio, aumentando la concentrazione di anidride carbonica (CO2), un sovradosaggio di anestetico letale o la lussazione del collo.
NOTA: Il metodo scelto non deve disturbare gli embrioni. Per questo studio, l'esposizione a una crescente concentrazione di anidride carbonica gassosa seguita dalla conferma della morte recidendo l'arteria femorale è stata utilizzata per abbattere le madri gravide. - Posizionare il topo gravido abbattuto sulla schiena su una tavola di dissezione; Mentre non è necessario appuntarlo, potrebbe renderlo più facile per i ricercatori inesperti. Pizzica la linea mediana dell'addome usando una pinza. Usando forbici affilate, tagliare l'addome attraverso la pelle e il peritoneo oltre la linea mediana dai genitali alla gabbia toracica, facendo attenzione a non perforare l'utero.
- L'utero del topo ha due corna, ciascuna contenente tipicamente da uno a cinque embrioni. Rimuovere l'utero contenente gli embrioni dalla madre e metterlo immediatamente sul ghiaccio.
- Tagliare il sacco vitellino sul lato della placenta, facendo attenzione a non danneggiare gli embrioni e rimuovere gli embrioni dal loro sacco vitellino.
- Decapitare immediatamente gli embrioni. Aggiungere le teste decapitate in un piatto con la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) senza calcio (Ca 2+) e magnesio (Mg2+) (HBSS-/-) su ghiaccio.
NOTA: Se è richiesta la genotipizzazione, è possibile rimuovere la coda in questa fase per l'analisi genetica. Quando sono previsti più genotipi, le teste di ciascun embrione devono essere tenute separate per la coltivazione. - Usando una pinza angolata, posiziona la testa sul lato rivolto a sinistra.
- Forare l'occhio con un bordo della pinza, tenendo saldamente il mento con l'altro.
- Partendo dalla nuca, strappare delicatamente la pelle del cuoio capelluto lungo la linea mediana verso la punta del muso.
- Entrando attraverso il midollo spinale, evidente come un ovale bianco, usa la pinza angolata per aprire il cranio lungo la linea mediana, esponendo il cervello.
- Staccare delicatamente il cranio sul lato rivolto verso l'alto, esponendo il cervello.
- Sollevare il cervello dal cranio, eliminando il cranio una volta che il cervello è stato completamente rimosso.
- Usando la pinza, rimuovere le meningi, che sono evidenti come una membrana sottile con vasi sanguigni densi.
- Mettere il cervello in un bijou (vedi Tabella dei materiali) contenente 2 ml di HBSS-/- su ghiaccio.
- Ripeti i passaggi da 2,6 a 2,13 con i cervelli rimanenti, aggiungendo fino a quattro cervelli per bijou.
- Aggiungere 250 μL di tripsina 10x al bijou e triturare il cervello scuotendo il bijou. Incubare per 15 min a 37 °C.
NOTA: Tutti i passaggi da questo punto in avanti devono essere eseguiti in una cappa di coltura di tessuti sterili. - Scongelare 2 mL di inibitore della tripsina (SD) della soia (Leibovitz L-15, 0,52 mg/mL di inibitore della tripsina da soia, 40 μg/mL di DNasi I, 3 mg/mL di sieroalbumina bovina [BSA] frazione V; cfr. tabella dei materiali) da -20 °C ponendolo a 37 °C.
- Aggiungere 2 ml di inibitore SD a ciascun bijou contenente cervelli (per bijou contenente fino a quattro cervelli), agitando nuovamente il bijou per disperderlo uniformemente.
NOTA: L'inibitore SD diminuisce l'attività della tripsina per prevenire la digestione non necessaria dei campioni e preservare la vitalità cellulare. - Senza centrifugazione, rimuovere 2 ml di surnatante da ogni bijou e trasferirlo in una provetta da centrifuga da 15 ml, facendo attenzione a non trasferire grumi di cellule.
- Triturare le cellule rimanenti nel bijou con un ago da 19 G attaccato a una siringa da 5 mL aspirando due volte la sospensione. Questo creerà una miscela densa simile al muco.
- Ripetere altre due volte utilizzando un ago da 21 G. Se rimangono grumi, triturare ancora una volta con l'ago 21 G.
- Trasferire le cellule dal bijou alla stessa provetta da centrifuga da 15 ml (dal punto 2.18) utilizzando un ago da 23 G.
- Centrifugare a 200 x g a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
- Rimuovere tutto il surnatante con una pipetta sierologica da 5 mL e trasferirlo in un'altra provetta da centrifuga da 15 ml, facendo attenzione a non disturbare il pellet sciolto sul fondo contenente le cellule necessarie.
- Centrifugare nuovamente il surnatante a 200 x g a RT per 5 minuti.
NOTA: Questo passaggio non è essenziale, ma se si richiedono molte cellule o si hanno pochi embrioni, si potrebbe eseguire questo passaggio per recuperare quante più cellule possibili dal surnatante. - Utilizzando 10 ml di terreno di placcatura (PM) (49% terreno di aquila modificato di Dulbecco [DMEM], 1% penicillina/streptomicina [Pen/Strep], 25% siero di cavallo, 25% HBSS con Ca 2+ e Mg2 + [HBSS+ /+]; vedi Tabella dei materiali), combinare e risospendere i due pellet insieme per creare una sospensione di cellule intere.
- Contare le cellule usando il blu di tripano e un emocitometro o un contatore cellulare digitale e diluire la sospensione cellulare con PM a una concentrazione di 1,8 x 106 cellule / ml.
3. Placcatura delle celle
- Aggiungere il volume richiesto della sospensione cellulare al formato richiesto come descritto nella Tabella 1: 1.000 μL per pozzetto in formato a 6 pozzetti, 50 μL per pozzetto in formato 96 pozzetti o 100 μL per vetrino.
- Incubare per 2-4 ore a 37 °C con 5%-7% CO2. Controllare che le cellule abbiano aderito usando un microscopio invertito.
- Rimuovere il terreno e rabboccare con nuovi mezzi di differenziazione (DM+: DM- inclusi 10 μg/ml di insulina. DM-: DMEM, 1% Pen/Strep, 50 nM idrocortisone, 10 ng/mL biotina, 2,5 mL 100x N1 media supplemento; vedi Tabella dei materiali). I volumi sono dettagliati nella tabella 1. Premere verso il basso eventuali vetrini di copertura flottanti utilizzando una punta sterile per pipetta.
4. Mantenere le culture
NOTA: Queste colture richiedono l'alimentazione tre volte alla settimana per supportare una crescita e una differenziazione ottimali. Le colture raggiungeranno la salute e la maturità ottimali per esperimenti su DIV (giorni in vitro) 21. Le cellule possono essere tenute in coltura per un massimo di 28 giorni, dopo di che le colture degenerano rapidamente.
- Tre volte alla settimana fino a DIV12, sostituire parte del surnatante con DM+ fresco rimuovendo 500 μL per pozzetto in formato a 6 pozzetti, 50 μL per pozzetto in formato a 96 pozzetti o 500 μL per piatto contenente tre vetrini di copertura e aggiungendo 600 μL per pozzetto in formato 6 pozzetti, 60 μL per pozzetto in formato 96 pozzetti, o 600 μL per capsula di copertura (Tabella 1).
- Tre volte alla settimana dal DIV13 in poi, sostituire parte del surnatante con DM- fresco rimuovendo 500 μL per pozzetto in formato 6 pozzetti, 50 μL per pozzetto in formato 96 pozzetti o 500 μL per piatto contenente tre coprivetrini e aggiungendo 600 μL per pozzetto in formato 6 pozzetti, 60 μL per pozzetto in formato 96 pozzetti, o 600 μL per capsula di copertura (Tabella 1).
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Representative Results
Microscopia
Le colture coltivate su vetrini sono ideali per essere analizzate al microscopio. Per visualizzare lo sviluppo delle colture, i vetrini di copertura sono stati fissati in paraformaldeide al 4% (PFA) in più punti temporali da DIV0 (una volta che le cellule sono state attaccate) fino a DIV28. Le colture sono state colorate per l'imaging immunofluorescenza come precedentemente descritto5 utilizzando tre diverse combinazioni di colorazione: NG2 (oligodendrociti immaturi) e nestina (cellule staminali / progenitrici neuronali) come marcatori dello sviluppo, SMI31 (assoni), MBP (mielina) e NeuN (corpo delle cellule neuronali) come marcatori neuronali, o CNP (oligodendrociti), GFAP (astrociti) e Iba1 (microglia) come marcatori gliali (Figura 2).
I vari tipi di cellule sono stati quantificati utilizzando pipeline CellProfiler (basate su ′,6-diamidino-2-fenilindolo-positivo (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1). Ogni singolo punto dati è stato generato da una media di 10 immagini prese da tre copertine per punto temporale. Per microglia, neuroni e oligodendrociti, è stata calcolata la percentuale di tipo cellulare per cellula 4′,6-diamidino-2-fenilindolo-positiva (DAPI+). Il campo visivo percentuale è stato utilizzato al posto del numero di cellule per quantificare il numero di astrociti. Ciò era dovuto alle difficoltà di differenziazione tra le singole cellule poiché spesso si sovrapponevano (Figura 2M,N). Le colture hanno raggiunto il picco di maturità e densità cellulare a DIV21, dopo di che le colture hanno iniziato a degradarsi (Figura 2N).
È importante sottolineare che queste colture possono essere facilmente trattate con farmaci, come potenziali terapie, o utilizzate per tracciare le infezioni in vitro . In questo esempio, le colture su vetrini sono state trasferite su una piastra a 24 pozzetti e infettate dal virus altamente neurotropico Semliki Forest virus (SFV) (ceppo SFV6)6, che esprime zsGreen nelle cellule infette. Una molteplicità di infezione (MOI, il numero di particelle virali aggiunte per cellula) di 0,05, titolata sulle cellule renali di criceto (BHK), è stata utilizzata per garantire un'infezione di basso livello. Dopo 0-72 ore post-infezione (hpi), le colture sono state fissate in PFA al 4% e colorate per l'analisi mediante imaging immunofluorescente. La figura 3 illustra che, in linea con l'infezione in vivo , l'SFV infetta principalmente oligodendrociti e neuroni6.
qRT-PCR
Oltre alla microscopia, queste colture del SNC possono essere utilizzate per l'analisi con metodi molecolari, come RT-qPCR delle risposte dell'mRNA al trattamento. Per studiare ulteriormente la risposta antivirale innata, le colture di piastre a 6 pozzetti sono state trattate con una gamma di dosi del potente citochina antivirale interferone beta (IFN-β) per 24 ore. Le colture sono state lisate con guanidio-tiocianato / fenolo e l'RNA è stato isolato, convertito in cDNA e analizzato mediante qPCR come precedentemente descritto7. Utilizzando questo metodo, è possibile misurare l'espressione differenziale di molti geni. Qui, la sovraregolazione di Ccl5 è stata quantificata rispetto al gene housekeeping 18s. CCL5 è una citochina chemiotattica (chemochina) coinvolta nella risposta infiammatoria. Il trattamento con IFN-β ha determinato una sovraregolazione dell'mRNA Ccl5 nelle colture (Figura 4A).
Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)
Il formato di colture a 96 pozzetti è uno strumento eccellente per screening ad alta produttività dei trattamenti. Per indagare se la sovraregolazione dell'mRNA di Ccl5 determina l'espressione della proteina CCL5, CCL5 è stato misurato nel surnatante delle colture mediante ELISA, secondo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali). In questo esempio, le colture a 96 pozzetti sono state trattate in duplicato con 27 dosi incrementali di IFN-β per generare una curva dose-risposta (Figura 4B). In linea con l'aumentata espressione di mRNA (Figura 4A), c'è stato un aumento di CCL5 rilasciato nel surnatante. Come previsto, la Figura 4C mostra una chiara correlazione tra mRNA ed espressione proteica.
Citometria a flusso
La citometria a flusso è un potente strumento per studiare simultaneamente l'espressione di molti marcatori intra e/o extracellulari. Tuttavia, l'analisi di colture complesse e altamente interattive mediante citometria a flusso può essere difficile a causa del danno cellulare e della morte quando si prelevano cellule dalla coltura a una sospensione monocellulare per l'elaborazione e l'analisi. Confrontando una varietà di protocolli che utilizzano acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) allo 0,05%-0,5%, tripsina 1x-10x senza EDTA e reagente di dissociazione delicato, è stato riscontrato che dopo aver trattato le colture di piastre a 6 pozzetti con tripsina-EDTA allo 0,05% per 10 minuti a 37 °C con delicata agitazione, le cellule sono state sollevate con una leggera triturazione per creare una sospensione monocellulare. Soprattutto per l'analisi citometrica a flusso delle cellule del SNC, è fondamentale essere delicati durante la preparazione delle cellule, ridurre al minimo le fasi di lavaggio e fare molta attenzione a mantenere le cellule a 4 °C o sul ghiaccio in ogni momento.
Per valutare la vitalità e i tipi di cellule in questa sospensione monocellulare, le cellule sono state colorate con un colorante di vitalità e anticorpi marcati con fluorescenza contro CD45, CD11b, O4, ACSA-2 e CD24 per consentire la visualizzazione di ogni singola popolazione cellulare nelle colture8 (Figura 5). Da questo metodo è stata ottenuta circa il 70% di vitalità cellulare, con una media di circa 2 x 10 6 cellule singole vitali per piastra a6 pozzetti (Figura 5C). In linea con i risultati della microscopia (Figura 2N), c'era un gran numero di microglia, neuroni e astrociti, mentre gli oligodendrociti erano i meno abbondanti.
Figura 1: Panoramica schematica del metodo descritto per generare colture miste neuronali e gliali. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Colture E17 del SNC colorate per marcatori cellulari di imaging immunofluorescenza nel tempo. Le cellule sono state fissate con il 4% di PFA prima di essere permeabilizzate e colorate per visualizzare diverse popolazioni. Immagini rappresentative dei marcatori dello sviluppo (A,D,G,J,M) NG2 (cellule precursori degli oligodendrociti) e nestina (cellule precursori neuronali e gliali), (B,E,H,K,N) marcatori neuronali SMI31 (assoni), MBP (mielina) e NeuN (corpo cellulare neuronale) e (C,F,I,L,O) marcatori gliali CNP (oligodendrociti), GFAP (astrociti) e Iba1 (microglia). Barre della scala = 50 μm. (P) Conteggi di DAPI per mm2, n = 3, ciascuno n da triplicati tecnici di 10 immagini per triplice. (Q) Conta le cellule come percentuale di cellule DAPI+ (microglia, oligodendrociti e neuroni) e percentuale del campo visivo (astrociti), n = 3, ciascuna n da triplicati tecnici di 10 immagini per triplice. Le barre di errore sono ±errore standard della media (SEM). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Infezione da virus della foresta di Semliki (SFV) delle colture del SNC E17 nel tempo. Immagini rappresentative di colture di controllo non infette (A,C,E,G) e colture infette da 0,05 MOI SFV (B,D,F,H). Le cellule sono state infettate per 0-48 ore e colorate con CNP (marcatore oligodendrocitario) e NeuN (marcatore neuronale) (A-D) o GFAP (marcatore astrocitario) e Iba1 (marcatore microgliale) (E-H). Le frecce bianche indicano una cellula infetta. Questo ceppo di SFV esprime la proteina fluorescente verde zsGreen per consentire il tracciamento dell'infezione virale. Barre della scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Espressione dell'mRNA CCL5 e della proteina di colture E17 del SNC dopo trattamento con IFN-β. Le cellule sono state trattate in formato piastra a 6 pozzetti (mRNA) o formato piastra a 96 pozzetti (proteine) per 24 ore con un intervallo di dosi di IFN-β. (A) Espressione di mRNA Ccl5 dopo trattamento con 0-100 ng/mL IFN-β, n = 2 biologico, ciascuno prelevato da triplicati tecnici. (B) concentrazione di CCL5 nel surnatante dopo trattamento con IFNβ 0-100 ng/ml, n = 1 biologico, prelevato da triplicati tecnici. (C) Upregulation dell'mRNA cellulare Ccl5 rispetto alla concentrazione della proteina CCL5 nel surnatante con linea di tendenza logaritmica. Le barre di errore sono ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Strategia di gating della citometria a flusso per generare popolazioni monocellulari da colture E17 del SNC. Le cellule sono state dissociate utilizzando tripsina-EDTA allo 0,05%, colorate con anticorpi appropriati e ordinate in singole popolazioni cellulari. (A-C) Strategia di gating per ordinare per cellule singole vive. (D) Strategia di selezione per microglia (CD45+ CD11b+). (E) Strategia di selezione degli oligodendrociti (CD45- CD11b- O4+). (F) Strategia per ordinare astrociti (CD45- CD11b- O4- ACSA-2+ CD24+) e neuroni (CD45- CD11b- O4- ACSA-2- CD24+). (G) Singole popolazioni cellulari sovrapposte l'una sull'altra, che mostrano popolazioni discrete. (H) Singoli tipi di cellule come percentuale delle celle totali ordinate, n = 4. Le barre di errore sono ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Formato richiesto | BA-PLL/pozzo | Acqua per il lavaggio | Celle di volume in Plating Media (PM) per placcare | Ricarica dei media | Rimuovere/aggiungere durante l'alimentazione delle colture (3x/settimana) |
| Formato a 6 pozzetti (9.6cm2) | 1000 μL | 1000 μL | 1000 μL | -400 μL | -500 μL Fluido |
| +600 μL DM+ | +600 μL DM+/- | ||||
| Formato a 96 pozzetti (0,32 cm2) | 100μL | 100 μL | 50 μL | +60 μL DM+ | -50 μL di fluido |
| +60 μL DM+/- | |||||
| Copertina in formato piatto | 20 ml per 200 vetrini | 20 ml | 100 μL per coprivetrino | +600 μL DM+ | -500 μL Fluido |
| +300 μL PM | +600 μL DM+/- |
Tabella 1: Volumi richiesti per la preparazione di tessuti plastici rivestiti.
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Discussion
Il SNC è una rete complessa che si estende dal cervello fino al midollo spinale e consiste di molti tipi di cellule, prevalentemente neuroni, oligodendrociti, astrociti e microglia1. Poiché ogni cellula ha un ruolo importante nel mantenere l'omeostasi e generare risposte appropriate alle sfide nel SNC 9,10,11, un sistema di coltura che contiene tutti questi tipi di cellule è uno strumento utile e versatile per studiare come il cervello potrebbe reagire a uno stimolo. La capacità di studiare queste cellule e le loro interazioni in un contesto in vitro significa che una grande varietà di tecniche può essere impiegata per indagare facilmente varie domande sperimentali. Abbiamo delineato un metodo rapido ed efficiente per ottenere e coltivare i principali tipi di cellule del SNC dal cervello prenatale, che può imitare le singole popolazioni cellulari nel cervello del topo adulto12.
I protocolli precedentemente stabiliti per la generazione di colture del SNC utilizzano il midollo spinale E13.5 4,5. Oltre ad avere un modello adatto per il midollo spinale, è molto importante avere un modello che ricapitola il cervello. Pertanto, i cervelli di questi topi E13.5 sono stati originariamente utilizzati per generare le colture del SNC qui descritte utilizzando lo stesso protocollo. Tuttavia, dopo DIV14, le cellule hanno iniziato a formare grandi aggregati con corpi cellulari neuronali densamente impacchettati. Mentre gli astrociti erano presenti, non è chiaro se fossero distribuiti uniformemente. Non è chiaro se le cellule al centro di questi corpi cellulari riceverebbero nutrienti e ossigeno sufficienti dal terreno di coltura come farebbero le cellule esterne. Quando si verifica la privazione di ossigeno e nutrienti, i neuroni sono suscettibili di passare attraverso l'apoptosi e rilasciare segnali di stress alle cellule gliali13, che potrebbero portare a un fenotipo proinfiammatorio14. Si pensava che la neurogenesi fosse una probabile causa di questi aggregati densamente impacchettati, e questa fase si attenua da E1715. Quando sono stati utilizzati cervelli di embrioni di topo E17, le cellule formavano ancora reti ma non si raggruppavano nei grandi aggregati visti in E13.5, e sono stati quindi considerati un'età più adatta per le colture cerebrali da cui generare.
La tecnica attuale si traduce anche in un maggior numero di cellule ottenute da una gravidanza (in media 1 x 10 7 cellule / cervello rispetto a 3-4 x 106 cellule / midollo spinale)7. Per un topo gravido medio con 8-10 embrioni, questo è correlato a un massimo di 54 diverse condizioni sperimentali nel formato a piastra a 6 pozzetti, o 150 condizioni sperimentali per la microscopia (rispetto a 19 e 64, rispettivamente, dal midollo spinale). Come tali, queste colture del SNC sono un ottimo strumento per ridurre il numero richiesto di topi16. In particolare, il formato a 96 pozzetti può essere facilmente utilizzato per saggi ad alto rendimento, ad esempio consentendo lo screening di farmaci candidati prima della sperimentazione sugli animali, riducendo notevolmente il numero di animali richiesti per tali studi. Si spera che ciò migliorerà il basso tasso di successo della sperimentazione dei farmaci del SNC negli animali e migliorerà la traduzione negli studi clinici nell'uomo17,18.
Le culture raggiungono il picco di maturità entro DIV21. I conteggi cellulari aumentano fino a questo punto temporale, dopo di che le cellule iniziano a degenerare con numeri decrescenti di ciascun tipo di cellula. Questo è stato misurato sia osservando il numero di cellule quantificate (Figura 2N) che il numero di nuclei picnotici (colorazioni DAPI dense) (Figura 2M). Mentre i marcatori dello sviluppo nestina e NG2 sono ancora espressi su DIV14 (Figura 2G) e DIV21 (Figura 2J), ciò è dovuto al fatto che alcuni degli astrociti attraversano l'astrogliosi, che sovraregola la nestina19, mentre alcuni degli oligodendrociti non sono completamente maturi e quindi esprimono ancora NG220. Sulla base della convalida al microscopio, solo una piccola parte delle cellule esprime ancora marcatori di sviluppo rispetto alle cellule completamente mature di DIV21 (Figura 2I,L); Pertanto, le culture sono in gran parte mature a questo punto. Da notare che, in vivo, la densità della microglia è altamente variabile attraverso il SNC murino. Il livello di microglia, come definito dall'espressione di Iba1 mediante microscopia, è all'estremità alta di questa densità nelle nostre colture12. L'alta percentuale di microglia che sopravvivono alla procedura di citometria a flusso è probabilmente dovuta al fatto che le microglia sono più robuste di altre cellule del SNC, che generalmente hanno estensioni delicate e hanno quindi maggiori probabilità di essere danneggiate durante la preparazione della citometria a flusso.
Ci vogliono solo 3 settimane dopo la dissezione prima che le cellule siano pronte per la sperimentazione, che è più breve della maggior parte dei metodi in vitro basati sull'uomo, come organoidi o modelli derivati da cellule staminali pluripotenti indotte21. Finché la ricerca in vivo è necessaria per garantire la sicurezza di nuove terapie, l'uso di metodi di coltura cellulare in vitro come il nostro aiuterà a testare la tossicità e l'efficacia in modo efficiente prima della sperimentazione sugli animali, riducendo il fabbisogno di animali e migliorando la traduzione della ricerca da in vitro a in vivo. Si spera che questo alla fine porterà a una traduzione più efficiente anche in studi clinici basati sull'uomo. In definitiva, queste culture sono state create per consentire lo studio del SNC. Mentre i sistemi in vitro non possono esprimere pienamente la complessità del SNC, le colture primarie derivate da cellule rappresentano più accuratamente le proprietà del SNC in vivo 22,23. Gli approcci in vitro possono consentire un approccio più riduttivo per studiare il SNC in assenza di cellule immunitarie infiltranti24 e l'integrità della barriera emato-encefalica25. Rimuovere questo livello di complessità può rendere più facile svelare i meccanismi. In quanto tale, l'attuale sistema di coltura è uno strumento utile per rispondere a domande di ricerca che completano la ricerca animale in vivo.
La capacità di raccogliere, isolare e coltivare cellule del SNC ha già notevolmente migliorato la nostra comprensione dell'innato SNC16. Questo articolo dimostra la dissezione del cervello di topo E17 e la conseguente triturazione e coltura delle cellule per generare un sistema di coltura cellulare contenente tutti i principali tipi di cellule del SNC. Molteplici tecniche molecolari sono state impiegate su queste colture, mostrando l'efficacia che queste colture hanno per studiare il SNC.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i membri dei laboratori Edgar e Linington, in particolare il Prof. Chris Linington, la Dott.ssa Diana Arseni e la Dott.ssa Katja Muecklisch, per i loro consigli, commenti utili e assistenza nell'alimentazione delle culture mentre creiamo queste culture. Un ringraziamento particolare va al Dr. Muecklisch per aver fornito i punti di partenza per le pipeline di Cell Profiler. Questo lavoro è stato sostenuto dalla MS Society (sovvenzione 122) e dalla fondazione Yuri e Lorna Chernajovsky a MP; Finanziamenti dell'Università di Glasgow a JC e MP; e Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) e Medical Research Council (MRV0109721) a GJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
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