Methodenartikel

Herzstillstandsmodell der Maus für die Bildgebung des Gehirns und die Überwachung der Gehirnphysiologie während Ischämie und Wiederbelebung

DOI:

10.3791/65340

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14. April 2023

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1Multidisciplinary Brain Protection Program, Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Anesthesiology and Pain Management, UT Southwestern University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll demonstriert ein einzigartiges Mausmodell für Asphyxie-Herzstillstand, bei dem keine Herzdruckmassage zur Wiederbelebung erforderlich ist. Dieses Modell ist nützlich für die Überwachung und Bildgebung der Dynamik der Gehirnphysiologie während eines Herzstillstands und einer Wiederbelebung.

Zusammenfassung

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Die meisten Überlebenden eines Herzstillstands (CA) leiden unter unterschiedlich starken neurologischen Defiziten. Um die Mechanismen zu verstehen, die der CA-induzierten Hirnschädigung zugrunde liegen, und in der Folge wirksame Behandlungen zu entwickeln, ist die experimentelle CA-Forschung unerlässlich. Zu diesem Zweck wurden einige Maus-CA-Modelle etabliert. In den meisten dieser Modelle werden die Mäuse in Rückenlage gebracht, um eine Thoraxkompression für die Herz-Lungen-Wiederbelebung (CPR) durchzuführen. Dieses Wiederbelebungsverfahren macht jedoch die Echtzeit-Bildgebung/Überwachung der Gehirnphysiologie während der CA und der Wiederbelebung zu einer Herausforderung. Um dieses wichtige Wissen zu erlangen, stellt das vorliegende Protokoll ein Maus-Asphyxie-CA-Modell vor, das den HLW-Schritt der Thoraxkompression nicht erfordert. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung dynamischer Veränderungen des Blutflusses, der Gefäßstruktur, der elektrischen Potentiale und des Sauerstoffgehalts des Hirngewebes von der Prä-CA-Baseline bis zur frühen Post-CA-Reperfusion. Wichtig ist, dass dieses Modell auf gealterte Mäuse zutrifft. Daher wird erwartet, dass dieses Maus-CA-Modell ein wichtiges Werkzeug für die Entschlüsselung des Einflusses von CA auf die Gehirnphysiologie sein wird.

Einleitung

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Herzstillstand ist nach wie vor eine globale Krise der öffentlichen Gesundheit1. Allein in den USA werden jährlich mehr als 356.000 Fälle von CA außerhalb des Krankenhauses und 290.000 Fälle im Krankenhaus gemeldet, und die meisten CA-Opfer sind über 60 Jahre alt. Bemerkenswert ist, dass neurologische Beeinträchtigungen nach einer CA bei Überlebenden häufig sind und eine große Herausforderung für das CA-Management darstellen 2,3,4,5. Um pathologische Veränderungen des Gehirns nach der CA und ihre Auswirkungen auf die neurologischen Ergebnisse zu verstehen, wurden verschiedene neurophysiologische Überwachungs- und Hirngewebeüberwachungstechniken bei Patienten angewendet 6,7,8,9,10,11,12. Mittels Nahinfrarotspektroskopie wurde auch eine Echtzeit-Gehirnüberwachung bei CA-Ratten durchgeführt, um neurologische Ergebnisse vorherzusagen13.

In murinen CA-Modellen wurde ein solcher bildgebender Ansatz jedoch durch die Notwendigkeit von Herzdruckmassagen zur Wiederherstellung der spontanen Durchblutung erschwert, die immer mit erheblichen körperlichen Bewegungen verbunden ist und daher empfindliche bildgebende Verfahren behindert. Darüber hinaus werden CA-Modelle normalerweise mit Mäusen in Rückenlage durchgeführt, während die Mäuse für viele bildgebende Verfahren des Gehirns in die Bauchlage gedreht werden müssen. Daher ist in vielen Fällen ein Mausmodell mit minimaler Körperbewegung während der Operation erforderlich, um eine Echtzeit-Bildgebung/Überwachung des Gehirns während des gesamten CA-Eingriffs durchzuführen, der sich von der Prä-CA bis zur Nachreanimation erstreckt.

Zuvor berichteten Zhang et al. über ein Maus-CA-Modell, das für die Bildgebung des Gehirns nützlich sein könnte14. In ihrem Modell wurde CA durch Bolusinjektionen von Vecuronium und Esmolol induziert, gefolgt von der Beendigung der mechanischen Beatmung. Sie zeigten, dass nach 5 Minuten CA eine Wiederbelebung durch Infusion einer Wiederbelebungsmischung erreicht werden konnte. Bemerkenswert ist jedoch, dass der Kreislaufstillstand in ihrem Modell erst etwa 10 s nach der Esmolol-Injektion auftrat. Daher rekapituliert dieses Modell nicht das Fortschreiten der Asphyxie-induzierten CA bei Patienten, einschließlich Hyperkapnie und Gewebehypoxie während der Präarrest-Phase.

Das übergeordnete Ziel des aktuellen chirurgischen Verfahrens ist es, die klinische Asphyxie-CA bei Mäusen zu modellieren, gefolgt von einer Wiederbelebung ohne Herzdruckmassage. Dieses CA-Modell ermöglicht daher den Einsatz komplexer bildgebender Verfahren zur Untersuchung der Gehirnphysiologie bei Mäusen15.

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Protokoll

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Alle hier beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) für die Pflege und Verwendung von Tieren in der Forschung durchgeführt, und das Protokoll wurde vom Duke Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 8-10 Wochen verwendet.

1. Chirurgische Vorbereitung

  1. Wiegen Sie eine Maus auf einer digitalen Waage und legen Sie sie in eine 4 Zoll x 4 Zoll x 7 Zoll große Anästhesie-Induktionsbox aus Plexiglas.
  2. Stellen Sie den Anästhesieverdampfer auf 5 % Isofluran, den Sauerstoffdurchflussmesser auf 30 und den Stickstoffdurchflussmesser auf 70 ein (siehe Materialtabelle).
  3. Nehmen Sie das Tier aus der Induktionsbox und legen Sie es in Rückenlage auf die Operationsbank, wenn seine Atemfrequenz auf 30-40 Atemzüge pro Minute gesunken ist.
  4. Ziehen Sie die Zunge mit einer stumpfen Pinzette heraus und halten Sie sie mit der nicht-dominanten Hand. Verwenden Sie die dominante Hand, um ein Laryngoskop (siehe Materialtabelle) in den Mund der Maus einzuführen und das Stimmband zu visualisieren.
  5. Verwenden Sie die nicht-dominante Hand, um einen Führungsdraht und einen 20 G intravenösen Katheter in den Mund einzuführen. Führen Sie den Führungsdraht vorsichtig in die Luftröhre ein.
  6. Schieben Sie den Katheter in die Luftröhre, bis der Flügelteil des Katheters auf gleicher Höhe mit der Nasenspitze ist.
    HINWEIS: Intubieren Sie keine Maus, die nicht vollständig betäubt ist, da dies die Luftröhre verletzen und Atemwegsblutungen verursachen kann.
  7. Schließen Sie die intubierte Maus an ein Beatmungsgerät für Kleintiere an (siehe Materialtabelle) und reduzieren Sie das Isofluran auf 1,5 %.
  8. Geben Sie das Körpergewicht der Maus in das Bedienfeld des Beatmungsgeräts ein, um das Atemzugvolumen und die Atemfrequenz zu bestimmen.
  9. Halten Sie die Maus in Rückenlage unter einer Wärmelampe und halten Sie die Rektaltemperatur mit einem Temperaturregler bei 37 °C.
  10. Rasieren Sie die Leistenbereiche, desinfizieren Sie den Operationsbereich mindestens dreimal mit Jod und Alkohol (siehe Materialtabelle) und decken Sie den Bereich mit einem sterilen OP-Tuch ab.
  11. Augensalbe auf beide Augen auftragen und vor der Operation 5 mg/kg Carprofen subkutan verabreichen.
  12. Öffnen Sie die sterile Instrumentenverpackung für die Operation. Machen Sie einen 1 cm langen Hautschnitt mit einer chirurgischen Schere, um die Oberschenkelarterien auf beiden Seiten zu erreichen. Die distale Oberschenkelarterie wird mit einem einzigen Strang 4-0-Seidennaht (siehe Materialtabelle) präpariert und ligiert und ein Tropfen Lidocain aufgetragen.
  13. Bringen Sie einen Aneurysma-Clip an der proximalen Oberschenkelarterie an und machen Sie einen kleinen Schnitt an der Arterie distal des Clips. Ein Katheter aus Polyethylen 10 (PE-10, siehe Materialtabelle) wird in die linke und rechte Oberschenkelarterie eingeführt.
    HINWEIS: Der linke arterielle Zugang wird für die Blutdrucküberwachung verwendet, während der rechte für die Blutentnahme und die Infusion mit Reanimationsmischung verwendet wird.
  14. Injizieren Sie 50 μl 1:10 heparinisierte Kochsalzlösung in jede arterielle Leitung, um eine Gerinnung in der Leitung zu verhindern.
  15. Drehen Sie die Maus in die Bauchlage und montieren Sie sie auf einem stereotaktischen Kopfgestell.
  16. Schließen Sie drei Nadelelektroden (rot, grün und schwarz) an den linken Arm, das linke Bein und den rechten Arm an, um ein Elektrokardiogramm (EKG, siehe Materialtabelle) zu überwachen.
  17. Kleben Sie eine flexible Kunststofffasersonde durch einen 0,5 cm langen Hautschnitt auf den intakten Schläfenschädel, um den zerebralen Blutfluss zu überwachen. Dieser Schritt ist optional.
  18. Rasieren Sie die Oberseite des Kopfes, desinfizieren Sie den Operationsbereich mindestens dreimal mit Jod und Alkohol und decken Sie den Bereich mit einem sterilen chirurgischen Tuch ab.
  19. Schneiden Sie einen 2,5 cm langen Hautschnitt in der Mittellinie und legen Sie mit vier kleinen Retraktoren die gesamte Schädeloberfläche für die Bildgebung des Gehirns frei.
  20. Platzieren Sie einen Überwachungs-Imager (z. B. einen Laser-Speckle-Kontrast-Imager, siehe Materialtabelle) über dem Kopf.
    HINWEIS: Ein paar Tropfen Kochsalzlösung können auf die Schädeloberfläche gegeben werden, um die Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung zu erleichtern.

2. Einleitung eines Herzstillstands

  1. Füllen Sie eine 1-ml-Kunststoffspritze mit 26 μl der Wiederbelebungs-Cocktail-Stammlösung.
    HINWEIS: Jeder Milliliter dieser Lösung enthält 400 μl 1 mg/ml Epinephrin, 500 μl 8,4 % Natriumbicarbonat, 50 μl 1.000 U/ml Heparin und 50 μl 0,9 % Natriumchlorid (siehe Materialtabelle).
  2. Warten Sie, bis die Körpertemperatur 37 °C erreicht hat. Stellen Sie das Sauerstoffmessgerät auf 100% ein, um das Blut 2 Minuten lang mit Sauerstoff zu versorgen.
  3. Das sauerstoffreiche arterielle Blut wird bis zu 200 μl über die rechte Oberschenkelarterie in die vorbereitete Kunststoffspritze mit 26 μl Wiederbelebungscocktail-Stammlösung entnommen.
  4. Schalten Sie den Sauerstoff aus und erhöhen Sie den Stickstoff auf 100%, um eine Anoxie zu induzieren.
    HINWEIS: Nach ca. 45 s funktioniert das Herz nicht mehr und die Herzfrequenz nimmt rapide ab, was auf den Beginn einer CA hinweist. Nach etwa 2 Minuten Sauerstoffmangel zeigt die EKG-Überwachung eine Asystolie an, und es gibt keinen messbaren systemischen Blutdruck und einen vernachlässigbaren zerebralen Blutfluss.
  5. Schalten Sie den Ventilator, den Isofluran-Verdampfer, den Temperaturregler und den Stickstoffdurchflussmesser aus. Stellen Sie den Sauerstoff auf 100 % ein, um sich auf die Wiederbelebung vorzubereiten.

3. Ablauf der Wiederbelebung

  1. Schalten Sie das Beatmungsgerät 8 Minuten nach Beginn der CA ein.
  2. Beginnen Sie sofort damit, das entnommene sauerstoffhaltige Blut, das mit dem Wiederbelebungscocktail vermischt ist, über die rechte Oberschenkelarterie in 1 Minute in den Blutkreislauf zu infundieren.
    HINWEIS: Die Infusion führt zu einem allmählichen Anstieg der Herzfrequenz und zur Wiederherstellung der Blutdurchblutung; Schließlich wird die Rückkehr der spontanen Zirkulation (ROSC) erreicht.

4. Wiederherstellung nach der Zertifizierungsstelle

  1. Bringen Sie die Maus in Rückenlage, nachdem Sie sie aus dem stereotaktischen Rahmen entfernt haben, und entfernen Sie die PE-10-Katheter aus den Oberschenkelarterien.
  2. Tragen Sie 0,25 % Bupivacain auf den Hautschnitt auf und vernähen Sie die Hautschnitte mit einem 6-0-Nylon-Nahtmaterial (siehe Materialtabelle). Tragen Sie eine antibiotische Salbe auf die Oberfläche des Hautschnitts auf.
  3. Trennen Sie das Beatmungsgerät der Maus, wenn die spontane Atmung wiederhergestellt ist.
  4. Bringen Sie die Maus in eine Rückgewinnungskammer mit einer kontrollierten Temperatur von 32 °C.
  5. Nach 2 Stunden Erholung extubieren Sie die Maus und kehren in den Heimatkäfig zurück. Injizieren Sie 0,5 ml normale Kochsalzlösung subkutan, um eine Dehydrierung zu verhindern.

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Ergebnisse

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Um CA zu induzieren, wurde die Maus mit 1,5% Isofluran betäubt und mit 100% Stickstoff beatmet. Dieser Zustand führte innerhalb von 45 Sekunden zu einer schweren Bradykardie (Abbildung 1). Nach 2 Minuten Anoxie sank die Herzfrequenz dramatisch (Abbildung 2), der Blutdruck sank unter 20 mmHg und der zerebrale Blutfluss hörte vollständig auf (Abbildung 1). Da das Isofluran ausgeschaltet wurde, konnte die Körpertemperatur nicht mehr ko...

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Diskussion

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In experimentellen CA-Studien wurden Asphyxie, Kaliumchlorid-Injektionen oder durch elektrischen Strom abgeleitetes Kammerflimmern verwendet, um CA 16,17,18,19,20,21,22,23 zu induzieren. Normalerweise ist bei diesen CA-Modellen, insbesondere bei Mäusen, ein...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Die Autoren danken Kathy Gage für ihre redaktionelle Unterstützung. Diese Studie wurde durch Mittel der Abteilung für Anästhesiologie (Duke University Medical Center), Zuschuss der American Heart Association (18CSA34080277) und Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH) (NS099590, HL157354, NS117973 und NS127163) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AdrenalinPar PharmaceuticalNDC 42023-159-01
AlkoholtupferBD326895
Animal Bio AmpADInstrumentsFE232
BP WandlerADInstrumentsMLT0699
Bridge AmpADInstrumentsFE117
Heparin-Natrium-Injektion, USPFresenius KabiNDC 63323-540-05
IsofluranCovetrusNDC 11695-6777-2
Laser-Doppler-PerfusionsmonitorMoor InstrumentsmoorVMS-LDF1
Laser speckle imaging systemRWDRFLSI III
Gleitmittel AugensalbeBausch + Lomb339081
Micro clipRobozRS-5431
Maus-RektumsondePhysitempRET-3
NadelelektrodeADInstrumenteMLA121329 Ga, 1,5 mm Sockel
StickstoffAirgasUN1066
Optische KunststofffaserMoor InstrumentsPOF500
OtoskopWelchallyn7282,5 mm Spekulum
SauerstoffAirgasUN1072
PE-10-SchlauchBD427401Polyethylenschlauch
Povidon-JodCVS955338
PowerLab 8/35ADInstruments
Rimadyl (Carprofen)Zoetis6100701Injizierbar 50 mg/ml
Beatmungsgerät für KleintiereKent ScientificRoVent Jr.
TemperaturreglerPhysitempTCAT-2DF
Dreifach antibiorik & schmerzlinderndCVSNDC 59770-823-56
VaporizerRWDR583S
0,25% BupivacainHospiraNDC 0409-1159-18
0,9% NatriumchroridICU MedicalNDC 0990-7983-03
1 mL Kunststoff SpritzeBD309659
4-0 SeidennahtLookSP116Schwarz geflochtene Seide
6-0 NylonnahtEthilon1698G
8,4% Natriumbicarbonat Inj., USPHospiraNDC 0409-6625-02
20 G IV KatheterBD38153420GA 1,6 IN
30 G PrecisionGlide NadelBD30510630 G X 1/2

Referenzen

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Mausmodell der Asphyxiezerebraler BlutflussHirnosxygenierungneurologische FunktionGef strukturReanimationsmonitoringexperimentelle CA Forschung

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