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Ein modifiziertes transkranielles Modell für den Verschluss der mittleren Hirnarterie zur Untersuchung von Schlaganfallergebnissen bei gealterten Mäusen

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DOI:

10.3791/65345

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5. Mai 2023

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1Multidisciplinary Brain Protection Program, Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert ein einzigartiges Mausschlagmodell mit einem mittelgroßen Infarkt und einer ausgezeichneten Überlebensrate. Dieses Modell ermöglicht es präklinischen Schlaganfallforschern, die Dauer der Ischämie zu verlängern, gealterte Mäuse zu verwenden und langfristige funktionelle Ergebnisse zu bewerten.

Zusammenfassung

In der experimentellen Schlaganfallforschung wird der Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO) mit einem intraluminalen Filament häufig verwendet, um einen ischämischen Schlaganfall bei Mäusen zu modellieren. Das Filament-MCAO-Modell zeigt typischerweise einen massiven Hirninfarkt bei C57Bl/6-Mäusen, der manchmal Hirngewebe in dem Gebiet umfasst, das von der hinteren Hirnarterie versorgt wird, was weitgehend auf eine hohe Inzidenz von posteriore kommunizierenden Arterienatresie zurückzuführen ist. Dieses Phänomen wird als ein wesentlicher Faktor für die hohe Mortalitätsrate angesehen, die bei C57Bl/6-Mäusen während der langfristigen Schlaganfallerholung nach Filament-MCAO beobachtet wurde. Daher nutzen viele Studien zu chronischen Schlaganfällen distale MCAO-Modelle. Diese Modelle erzeugen jedoch in der Regel nur einen Infarkt im Bereich der Großhirnrinde, so dass die Beurteilung neurologischer Defizite nach einem Schlaganfall eine Herausforderung darstellen könnte. In dieser Studie wurde ein modifiziertes transkranielles MCAO-Modell etabliert, bei dem das MCA am Rumpf entweder dauerhaft oder vorübergehend über ein kleines Schädelfenster teilweise verschlossen ist. Da die Okklusionsstelle relativ nahe am Ursprung des MCA liegt, erzeugt dieses Modell Hirnschäden sowohl im Kortex als auch im Striatum. Eine umfangreiche Charakterisierung dieses Modells hat eine hervorragende Langzeitüberlebensrate, auch bei gealterten Mäusen, sowie leicht nachweisbare neurologische Defizite gezeigt. Daher stellt das hier beschriebene MCAO-Mausmodell ein wertvolles Werkzeug für die experimentelle Schlaganfallforschung dar.

Einleitung

Fast 800.000 Menschen erleiden in den USA jedes Jahr einen Schlaganfall, und die meisten dieser Schlaganfälle sind ischämischer Natur1. Die rechtzeitige Wiederherstellung des zerebralen Blutflusses mit einem Gewebeplasminogenaktivator (tPA) und/oder einer Thrombektomie ist derzeit die wirksamste Behandlung für Schlaganfallpatienten. Die vollständige Wiederherstellung neurologischer Funktionen auf lange Sicht ist jedoch selten 2,3. Daher ist die Suche nach neuartigen Schlaganfalltherapien, die auf eine funktionelle Verbesserung abzielen, ein intensives Forschungsgebiet, das klinisch relevante Tiermodelle für Schlaganfälle erfordert.

Das häufigste ischämische Schlaganfallmodell bei Nagetieren verwendet den intraluminalen Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO), um einen Schlaganfall zu induzieren. Bei diesem Modell, das ursprünglich 1989 von Zea Longa entwickelt wurde, wird ein Nylonfilament in die Arteria carotis interna (ICA) eingeführt, um den Blutfluss zur mittleren Hirnarterie (MCA) zu blockieren4. Dieses Modell hat jedoch seine Grenzen. Erstens, wenn das Filament in das ICA eingeführt wird, könnte auch der Blutfluss zur hinteren Hirnarterie (PCA) teilweise blockiert werden, insbesondere bei Mäusen. Kritisch ist, dass die hintere kommunizierende Arterie (PcomA), eine kleine Arterie, die den vorderen und hinteren Hirnkreislauf verbindet, bei einigen Mausstämmen häufig unterentwickelt ist, wie z. B. C57Bl/6, dem Stamm, der hauptsächlich in der experimentellen Schlaganfallforschung verwendet wird. Es wird angenommen, dass diese Durchgängigkeit des PcomA zur Variabilität der Läsionsgröße bei Mäusen nach Schlaganfallbeiträgt 5. In der Tat, wenn der Blutfluss zur PCA während der MCAO steil abfällt und die PcomA nicht in der Lage ist, einen ausreichenden kollateralen Blutfluss bereitzustellen, kann sich der Schlaganfallinfarkt in das Territorium der PCA ausdehnen. Darüber hinaus führt in diesem Modell eine lange Dauer der Ischämie zu einer höheren Mortalitätswahrscheinlichkeit bei Mäusen. Folglich wird bei Mäusen typischerweise eine kurze MCAO-Dauer von 30-60 Minuten verwendet. Bei den meisten Schlaganfallpatienten kommt es jedoch einige Stunden vor der Reperfusionsbehandlung zu einer Ischämie. Daher ist ein Mausschlagmodell mit einer verlängerten Dauer der Ischämie von hoher klinischer Relevanz.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den ischämischen Schlaganfall bei Mäusen zu modellieren, die einen mittelgroßen Infarkt und eine ausgezeichnete Überlebensrate haben. Dieses transkranielle MCAO-Modell adressiert kritische Merkmale des klinischen Schlaganfalls, da eine verlängerte Ischämie durchgeführt werden kann und ältere Mäuse dieses Modell gut vertragen, was eine langfristige Beurteilung der funktionellen Erholung ermöglicht.

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Protokoll

Alle in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren werden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren in der Forschung durchgeführt, und das Protokoll wurde vom Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Junge (8-10 Wochen alt) und ältere (22 Monate alte) männliche C57Bl/6-Mäuse wurden für die vorliegende Studie verwendet. Eine Übersicht über dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Chirurgische Vorbereitung

  1. Untersuchen Sie die Maus auf grobe Anomalien und Verhaltensdefizite.
    HINWEIS: Vor der Operation ist es wichtig, dass Chirurgen geeignete PSA (persönliche Schutzausrüstung) tragen, einschließlich chirurgischer Maske, Mütze, Handschuhe und Kittel.
  2. Wiegen Sie die Maus; Programmieren Sie das Beatmungsgerät (siehe Materialtabelle) auf der Grundlage des Körpergewichts.
  3. Platzieren Sie die Maus in einem 4 Zoll x 4 Zoll x 7 Zoll Induktionskasten für Anästhesie. Schalten Sie den Sauerstoffdurchflussmesser (siehe Materialtabelle) auf 30 und den Lachgasdurchflussmesser auf 70 ein. Schalten Sie den Vaporizer mit 5% Isofluran ein.
  4. Führen Sie den Führungsdraht in den 20 G intravenösen (IV) Katheter ein.
  5. Nehmen Sie die Maus aus der Induktionsbox, wenn ihre Atemfrequenz auf 30-40 Atemzüge pro Minute reduziert ist.
  6. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf die Operationsbank. Ziehen Sie die Zunge der Maus heraus und halten Sie sie mit den Fingern der linken Hand fest. Führen Sie ein Laryngoskop (siehe Materialtabelle) in das Maul des Tieres ein, um das Stimmband sichtbar zu machen.
  7. Stabilisieren Sie das Mäusekinn am Laryngoskop mit dem rechten Mittelfinger. Geben Sie die linke Hand frei, um den 20 G IV-Katheter zu halten.
  8. Führen Sie den Führungsdraht leicht in das Stimmband ein und schieben Sie dann den 20 G IV-Katheter langsam in die Luftröhre, bis der Flügelteil des Katheters mit der Nasenspitze übereinstimmt.
    HINWEIS: Wenn sich die Maus bewegt, stecken Sie den Draht nicht ein. Dies kann zu einem Trauma der Luftröhre und Blutungen führen.
  9. Schalten Sie das Beatmungsgerät ein (siehe Materialtabelle) und verbinden Sie es mit dem 20 G IV-Katheter, der in der Maus intubiert ist. Reduzieren Sie das Isofluran auf 1,5 % und stellen Sie sicher, dass beide Lungen mechanisch beatmet werden.
    HINWEIS: Vergessen Sie nicht, die Isofluran-Konzentration zu reduzieren. Andernfalls erhält die Maus eine Überdosis Anästhesie.
  10. Augensalbe auf beide Augen auftragen und 5 mg/kg Carprofen subkutan injizieren.
  11. Halten Sie die Maus in einer seitlichen Position mit dem rechten Schläfenbereich nach oben. Halten Sie die Rektaltemperatur mit einem Heizkissen (35 °C) und einer Wärmelampe, die von einem Temperaturregler gesteuert wird, auf 37 °C (siehe Materialtabelle).
  12. Rasieren Sie die Oberfläche zwischen dem rechten Auge und dem Ohr und desinfizieren Sie den Operationsbereich mindestens dreimal mit Jod- und Alkoholtupfern.

2. MCAO-Chirurgie

  1. Öffnen Sie die sterile Instrumentenverpackung für die MCAO-Chirurgie. Tragen Sie sterile Handschuhe und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen 1 cm langen Hautschnitt zwischen dem rechten Auge und dem rechten Ohr.
    HINWEIS: Überwachen Sie die Hautfarbe, die Körpertemperatur und die Reaktion auf das Einkneifen der Zehen alle 15 Minuten.
  2. Sezieren Sie die darunter liegende Faszie mit einer Pinzette, um die Schläfen- und Kaumuskeln freizulegen.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, die Ohrspeicheldrüse nicht zu beschädigen.
  3. Berühre mit einer Pinzette den unteren Teil des Schläfenmuskels und erkenne die Position des Jochbeinbogens. Ziehe vorsichtig die Äste des Gesichtsnervs zur Seite.
  4. Verwenden Sie die Spitze einer Hochtemperatur-Kauterschlaufe (siehe Materialtabelle), um einen 5 mm breiten Querschnitt am Schläfenmuskel zu schneiden.
  5. Verwenden Sie zwei Pinzetten, um den darunter liegenden Jochbogen zu präparieren und das Gelenk zwischen Oberkiefer und Jochbein freizulegen.
  6. Schneiden Sie mit einer Schere einen 3 mm großen Teil des Jochbogens ab und entfernen Sie ihn. Trennen Sie den Kaumuskel von der Schädelbasis.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, den Sinus retroorbitalis und die oberflächliche Schläfenvene nicht zu brechen.
  7. Wenden Sie vier kleine Retraktoren an, die in verschiedenen Richtungen positioniert sind, um die Schädelbasis des Schädels freizulegen, wobei die Äste des Trigeminusnervs von einem Retraktor seitlich gezogen werden.
    ANMERKUNG: Ein Sulcus auf der Außenfläche der Schädelbasis markiert die Lage der lateralen Fissur zwischen Frontallappen und Temporallappen. Hier liegt der MCA (Abbildung 2A), und sein Stamm und seine Äste sind durch den dünnen, durchsichtigen Schädel sichtbar (Abbildung 2B). Die Beziehung dieser Arterie zu anderen großen Hirnarterien ist in Abbildung 2A dargestellt.
  8. Tragen Sie einen Tropfen mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung auf den Schädel über dem MCA-Stamm und proximal zum Ast des rhinalen Kortex auf. Verwende eine elektrische Schleifmaschine, um den Schädel zu verdünnen, bis ein kleiner Bruch sichtbar ist.
    HINWEIS: Drücken Sie den Grinder nicht gegen den Schädel, da er in den Schädel eindringen und die darunter liegende Arterie verletzen kann.
  9. Verwenden Sie die Spitze der Pinzette, um den ausgedünnten Schädel anzuheben und zu entfernen. Bei Scheinmäusen sollten Sie hier aufhören und die Arterie nicht ligieren.
    HINWEIS: Es wird ein kleines rechteckiges Fenster quer über den MCA-Stamm gebildet.
  10. Legen Sie eine einzelsträngige Schlaufe aus schwarzer, geflochtener Seide auf den MCA (Abbildung 2C). Füge eine 8-0 ein mikrochirurgische Nadel, um den MCA-Stamm anzuheben und die Naht (siehe Materialtabelle) unter der Nadel zu binden, wobei beide Enden der Nadel auf der Oberseite des Seidenfadenschlaufenknotens belassen werden (Abbildung 2D).
  11. Bei vorübergehendem MCAO ziehen Sie den Seidenfadenknoten leicht unter der Nadel fest, um den arteriellen Blutfluss zu blockieren (Abbildung 2E), was den Beginn des MCAO darstellt.
  12. Verwenden Sie die Pinzette, um die Naht zu halten, und entfernen Sie die Nadel langsam am Ende der Ischämie (z. B. 60 Minuten oder länger).
    HINWEIS: Wenn die Nadel entfernt wird, wird der Seidenfadenknoten vom MCA gelöst und das Gehirn wird wieder perfundiert (Abbildung 2F).
  13. Für eine dauerhafte MCAO ziehen Sie die Seidenfadenschlaufe um die Arterie fest und entfernen Sie die Nadel. Schneiden und entfernen Sie das überschüssige Nahtmaterial.
  14. Tragen Sie einen Tropfen 0,25 % Bupivacain auf den Hautschnitt auf und vernähen Sie den Muskel und die Haut separat mit 6-0-Nylonnähten (siehe Materialtabelle). Tragen Sie eine antibiotische Salbe auf die Oberfläche des Hautschnitts auf.
    HINWEIS: Der Hautschnitt kann auch mit sterilen Klammern oder Kleber verschlossen werden.

3. Nachsorge

  1. Schalten Sie das Isofluran aus, um die Maus aufzuwecken. Trennen Sie das Beatmungsgerät, wenn die Spontanatmung wiederhergestellt ist.
  2. Bringen Sie die Maus in eine Rückgewinnungskammer (siehe Materialtabelle) mit kontrollierter Temperatur.
  3. Extubieren Sie die Maus, wenn ihr Aufrichtreflex wiederhergestellt ist oder sie sich zu bewegen beginnt.
  4. Überwachen Sie die Maus genau in einer temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Kammer. Bringen Sie die Maus in den häuslichen Käfig zurück, nachdem sie das volle Bewusstsein erlangt hat (Erholungsphase ~2 h). Verabreichen Sie 5 mg/kg Carprofen täglich subkutan für 3 Tage.

4. Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung (LSCI)

  1. Sechs und 24 Stunden nach dem MCAO montieren Sie die anästhesierte Maus auf dem stereotaktischen Rahmen. Rasieren Sie die Oberseite des Kopfes und reinigen Sie ihn abwechselnd mit drei Jod- und Alkoholtupfern.
    HINWEIS: Die Anästhesie wurde wie in Schritt 1.3 beschrieben durchgeführt. LSCI wird auch vor MCAO durchgeführt.
  2. Machen Sie einen 3 cm langen Hautschnitt in der Mittellinie und trennen Sie die Haut vom Schädel ab. Wenden Sie vier kleine Nadelwundhaken an, um die Schädelspitze freizulegen.
  3. Bewegen Sie die Laser-Speckle-Kamera (siehe Materialtabelle) über den Kopf und stellen Sie den Fokus der Kamera ein. Stellen Sie sich den zerebralen Blutfluss vor.

5. 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung

  1. Betäuben Sie die Maus am Ende des Experiments, typischerweise am Tag 1, 3 oder 28 nach dem Schlaganfall, mit 5% Isofluran tief. Kneifen Sie den Schwanz zusammen, um sicherzustellen, dass es keine Schmerzreaktion gibt.
  2. Enthaupte die Maus mit einer chirurgischen Schere und ernte das Gehirn. Das Gehirn 20 Minuten lang in eiskalter Kochsalzlösung inkubieren.
  3. Legen Sie das Gehirn in eine Gehirnschneide-Matrix auf Eis und tropfen Sie kalte Kochsalzlösung auf das Gehirn. Schneide das Gehirn mit dünnen Rasierklingen in 1 mm dicke Scheiben.
  4. Tauchen Sie die Hirnschnitte in der gleichen Ausrichtung in eine Schale mit 2%iger TTC-Lösung (siehe Materialtabelle). Das Gericht 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahren.
    HINWEIS: Normales Hirngewebe wird rot und ischämisches Gewebe bleibt weiß.
  5. Übertragen Sie die Gehirnschnitte für 24 Stunden Fixierung auf 10% Formalin. Stellen Sie die Hirnschnitte ab und messen Sie den Infarktbereich.

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Ergebnisse

Mit einem direkten Blick unter dem Operationsmikroskop kann visuell bestätigt werden, dass der MCA-Blutfluss während der Ischämie blockiert ist. Unsere vorherige Studie zeigte eine >80%ige Verringerung des Blutflusses im ischämischen Bereich mit einem Laser-Doppler-Monitor6. Um Veränderungen des Blutflusses nach MCAO zu bestimmen, kann LSCI verwendet werden, um den ischämischen Insult und die Reperfusion weiter zu bestätigen (Abbildung 1). In A...

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Diskussion

Das erste transkranielle MCA-Okklusionsmodell wurde 1981 bei Ratten etabliert 11,12 und1989 durch das MCAO-Modell ohne Kraniektomie ersetzt4. Der initiale transkranielle MCA-Verschluss hatte ein weites Operationsfeld, so dass der gesamte Jochbogen entfernt und die Muskulatur seitlich gezogen wurde. Das lokale Gewebe war nach der Operation geschwollen, was zu Stress und einer verringerten Nahrungsaufnahme für die Tiere führte. In unserem mo...

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Offenlegungen

Alle Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Die Autoren danken Kathy Gage für ihre redaktionelle Unterstützung. Mit BioRender.com wurden Schemafiguren erstellt. Diese Studie wurde durch Mittel der Abteilung für Anästhesiologie (Duke University Medical Center) und NIH-Zuschüsse (NS099590, HL157354, NS117973 und NS127163) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % BupivacainHospiraNDC 0409-1159-18
0,9 % NatriumchloridICU MedicalNDC 0990-7983-03
2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC)Sigma oder ein verfügbarer Anbieter
20 G IV KatheterBD38153420 GA 1,6 IN
30 G NadelBD305106
4-0 SeidennahtLookSP116Schwarz geflochtene Seide
8-0 Naht mit Nadel Ethilon2822G
AlkoholtupferBD326895
Anästhesie-InduktionsboxJeder geeignete AnbieterPexiglass Fabrikat 
Elektrische SchleifmaschineJSDAJD 700
Hochtemperatur-KauterschleifenspitzeBovieAA03
IsofluranCovetrusNDC 11695-6777-2
Laser-Doppler-PerfusionsmonitorMoor InstrumentsmoorVMS-LDF1
Gleitmittel AugensalbeBausch + Lomb339081
Maus RektumsondePhysitempRET-3
DistickstoffmonoxidAirgasUN1070
OtoskopWelchallyn7282,5 mm Spekulum Otoskop diente als Laryngoskop zur Visualisierung von Stimmbändern bei Mäusen
SauerstoffAirgasUN1072
Povidon-JodCVS955338
Recovery BoxBrinsea TLC eco
Rimadyl (Carprofen)Zoetis6100701Injizierbares 50 mg/ml
NagetierbeatmungsgerätKent ScientificNagetier Jr.
TemperaturreglerPhysitempTCAT-2DF 
Dreifach antibioric & schmerzlinderndCVSNDC 59770-823-56
VaporizerRWDR583S

Referenzen

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Schlagwörter

MCAO Modellisch mischer Schlaganfalltranskranielle MCAOneurologische DefiziteHirninfarktchronischer SchlaganfallSchlaganfall Erholung

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