Bildgebung von ATG9A, einem mehrspannigen Membranprotein

ATG9A ist das einzige Transmembranprotein der zentralen Autophagie-Maschinerie und wird zwischen dem Golgi und einem zytosolischen ATG9A-Vesikelkompartikel, das durch das endosomale Kompartiment¹ transportiert wird. ATG9A, das lange Zeit rätselhaft war, wurde kürzlich als Lipid-Scramblase beschrieben, da es Lipide über Membrandoppelschichten hinweg ausgleicht ^2,3. Es ist nun klar, dass ATG9A bei der Autophagosomenbildung an der Spitze der Hierarchie steht, und seine Untersuchung ist daher für das Verständnis der Autophagie von entscheidender Bedeutung ^4,5. Daher wurden kürzlich ATG9A-Vesikel als "Keim" des Autophagosoms ^6,7 vorgeschlagen. Frühere Studien haben jedoch gezeigt, dass ATG9A nur vorübergehend mit dem bildenden Autophagosom in verschiedenen Stadien seiner Reifung interagiert und sich nicht in die autophagische Membran integriert 6,8,9,10,11. Daher sind weitere Untersuchungen erforderlich, um die Rolle und die möglichen Mehrfachfunktionen von ATG9A bei der Autophagosomenbildung vollständig zu entschlüsseln. Die Diskrepanz zwischen den aktuellen Modellen und den bisherigen Daten kann jedoch nur durch gezielte Experimente aufgelöst werden, die sich mit dem Transport von ATG9A unter Verwendung validierter quantitativer Ansätze und intrazellulärer Marker befassen.

Es gibt verschiedene Werkzeuge, die verwendet werden, um ATG9A zu untersuchen, jedes mit Vor- und Nachteilen, und die Verwendung dieser Werkzeuge wird durch die Struktur von ATG9A, seine molekulare Funktion und den zellulären Transport erschwert 2,8,12. ATG9A bildet ein Homotrimer, ist glykosyliert und wird durch die Zelle zu Kompartimenten wie dem Golgi, den Endosomen und der Plasmamembran transportiert^13,14. Angesichts seiner komplexen Reiseroute gibt es mehrere Herausforderungen bei der Interpretation von Messwerten, wie z. B. der Ausbreitung von ATG9A aus dem Golgi bei bestimmten Behandlungen oder Reizen (wie Nährstoff- und Serummangel). ATG9A ist extrem dynamisch in Bezug auf den vesikulären Transport; In der Tat wurden ATG9A-haltige Vesikel im Zusammenhang mit hungerinduzierter Autophagie als ATG9A-Kompartiment definiert. Das ATG9A-Kompartiment, das von diesen dynamischen Vesikeln gebildet wird, interagiert vorübergehend mit mehreren intrazellulären Organellen 8,15,16,17. Die hier beschriebenen Techniken, einschließlich Immunfluoreszenz, Live-Bildgebung und Glykosylierungsassays, sollten zum Nachweis und Verständnis der ATG9A-Biologie beitragen. Insbesondere werden die in diesem Artikel beschriebenen Ansätze dazu beitragen, Fragen zur Lokalisierung in bestimmten zellulären Kompartimenten und Interaktionen mit spezifischen Proteinpartnern und/oder Membrankompartimenten zu beantworten. Da die hydrophob konservierte Kerndomäne (PFAM-Domäne PF04109) ATG9A eine einzigartige Topologie aufweist und ATG9A-Zyklen zwischen mehreren Membrankompartimenten aufweist, sollten sich Forscher bestimmter Fallstricke und Artefakte bewusst sein, wenn ATG9A vorübergehend überexprimiert wird, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Retention des endoplasmatischen Retikulums (ER). Andere mögliche Probleme können aufgrund einer Fehlfaltung des Proteins, einer künstlichen Aggregation unter normalen Wachstumsbedingungen oder einer unzureichenden Detektion des vesikulären Kompartiments aufgrund suboptimaler Permeabilisierungsprotokolle für die Immunfluoreszenz auftreten.

Bei der Bildgebung von endogenem ATG9A muss bei der Probenvorbereitung und Bildaufnahme darauf geachtet werden, die Qualität der anschließenden quantitativen Analyse und die korrekte Interpretation der Daten zu gewährleisten. Die Kombination der in diesem Artikel beschriebenen Techniken mit biochemischen Standardansätzen (wie Immunpräzipitation oder Pull-Down-Experimenten, die hier nicht beschrieben sind) sollte unser Verständnis der Funktion von ATG9A verbessern. Dieses experimentelle Toolkit soll neuen Forschern helfen, sich in einigen der Assays zurechtzufinden, die zur Bestimmung der Funktion von ATG9A in ihrem biologischen System erforderlich sind.

Alle in dieser Studie verwendeten Reagenzien sind im Handel erhältlich, mit Ausnahme der ATG9A-DNA-Konstrukte und des hausgemachten STO-215-Antikörpers (siehe Materialtabelle), die auf Anfrage erhältlich sind. Die hier beschriebenen Analysetools basieren auf Open-Source-Software (FIJI/ImageJ)¹⁸.

1. Zellkultur

1. Halten Sie HEK293A Zellen in einer mit T150-Gewebekultur behandelten Flasche auf 80%-90% Konfluenz in DMEM mit hohem Glukosegehalt (Dulbecco's Modified Eagle Medium), ergänzt mit 10% FBS (fötales Kälberserum) und 4 mM L-Glutamin (siehe Materialtabelle). Die Zellen werden bei 37 °C in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 10 % CO₂ inkubiert.
   ANMERKUNG: HEK293A Zellen werden in der vorliegenden Studie verwendet, da sie eine robuste kanonische Autophagiereaktion auf Aminosäuremangel aufweisen, die insbesondere durch einen Anstieg der lipidierten, membranassoziierten LC3 1,9,19 nachgewiesen wird^, und für die Bildgebung geeignet sind.
2. Die Zellen werden durch Absaugen des Mediums aus dem Kolben mit einer serologischen Pipette durchgelassen. Waschen Sie die Zellen einmal mit 15 ml 1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) oder einer ähnlichen Lösung, bevor Sie 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung (Ethylendiamintetraessigsäure) hinzufügen, um die Zellen abzulösen. Sammeln Sie die abgelösten Zellen mit 8 ml DMEM und säen Sie eine Anzahl von Zellen zurück, so dass nach 2 Tagen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % für die hier beschriebenen Experimente erreicht wird.

2. Endogene Färbung von ATG9A

1. Säen Sie HEK293A Zellen (oder Zellen Ihrer Wahl) auf sterile Glasdeckgläser Nr. 1,5, die in eine 24-Well-Platte gelegt werden, so dass sie am nächsten Tag ~80% konfluierend sind. Dies ergibt in der Regel 7 x 10⁴ Zellen/Well in 500 μl DMEM.
   HINWEIS: Für HEK293A Zellen oder andere lose anhaftende Zelllinien müssen die Deckgläser mit Poly-D-Lysin bei 0,1 mg/ml in deionisiertem Wasser beschichtet werden. Geben Sie 500 μl des Poly-D-Lysins (siehe Materialtabelle) auf die Oberseite der Deckgläser, die 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) in die Vertiefungen gelegt wurden, gefolgt von drei Wäschen mit deionisiertem Wasser und einer letzten Wäsche in DMEM. Fahren Sie mit der Aussaat der Zellen nach der Beschichtung fort und achten Sie darauf, dass sie gleichmäßig in der Kulturschale verteilt sind.
2. Behandeln Sie die Zellen entsprechend den spezifischen Versuchsbedingungen (d.h. 2 h Hungern in EBSS [Earle's Balanced Salt Solution]).
   ANMERKUNG: Die EBSS-Zusammensetzung besteht aus 1 g/L D-Glukose, 6,8 g/L NaCl, 0,4 g/L KCl, 0,151 g/L CaCl 2,2H 2 O, 0,2 g/L mM MgSO 4,7H 2 O, 0,124 g/L NaH 2 HPO_4,2H 2 O und 2,2 g/L NaHCO 3 (siehe Materialtabelle), gelöst in destilliertem Wasser.
3. Das Medium wird abgesaugt und vorsichtig durch 500 μl 4%ige Formaldehydlösung in PBS ersetzt, ergänzt mit 0,1 mM CaCl2_und 0,1 mM MgCl2_für 20 min bei RT, um die Zellen zu fixieren.
4. Saugen Sie die 4%ige Formaldehydlösung aus jeder Vertiefung an und ersetzen Sie sie durch 500 μl PBS. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Lassen Sie die Deckgläser nicht austrocknen oder ohne Flüssigkeit bleiben.
5. Die freien Aldehydgruppen werden mit 500 μl 50 mM NH₄Cl-Lösung in PBS für 10 min bei RT abgeschreckt.
6. Saugen Sie das PBS an und ersetzen Sie es durch 500 μl einer 50 μg/ml Digitoninlösung in PBS (Stammlösung 1 mg/ml in deionisiertem Wasser, siehe Materialtabelle) für 5 Minuten bei RT, um die Zellen zu permeabilisieren.
7. Saugen Sie die Digitoninlösung aus jeder Vertiefung an und ersetzen Sie sie durch 500 μl PBS. Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal.
8. Das PBS wird aus jeder Vertiefung abgesaugt und durch 500 μl Blockierungslösung (5 % BSA [Rinderserumalbumin], verdünnt in PBS) für 30 Minuten bei RT ersetzt.
9. Saugen Sie die Blockierungslösung an und ersetzen Sie sie durch 500 μl PBS.
10. Sammeln Sie die Deckgläser mit einer Pinzette aus der Vertiefung, entfernen Sie die überschüssige PBS-Lösung vorsichtig mit dünnen Tüchern oder Zellulose-Filterpapier und legen Sie jedes Deckglas vorsichtig mit der Zellseite nach unten auf einen 50-μl-Tropfen der primären Antikörperlösung (z. B. Armenischer Hamster 14F2 verdünnt auf 0,9 μg/ml in 1%iger BSA/PBS-Lösung, siehe Materialtabelle). In einer befeuchteten Kammer für 1 h bei RT inkubieren.
    HINWEIS: Für eine einfache Handhabung können die Tropfen der Antikörperlösung auf einer Folie aus selbstklebender thermoplastischer Folie (siehe Materialtabelle) in einem anderen Behälter statt direkt auf eine feste Oberfläche gegeben werden.
11. Sammeln Sie die Deckgläser mit einer Pinzette, und nachdem Sie die überschüssige Primärantikörperlösung vorsichtig mit dünnen Gewebetüchern abgetropft haben, legen Sie die Deckgläser (Zellseite nach oben) wieder in die 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
12. Wiederholen Sie Schritt 2.10. Sammeln Sie mit einer Pinzette die Deckgläser aus jeder Vertiefung, lassen Sie das überschüssige PBS vorsichtig mit dünnen Tüchern abtropfen und legen Sie jedes Deckglas vorsichtig (mit der Zellseite nach unten) auf einen 50 μl großen Tropfen einer Sekundärantikörperlösung, die 1:1.000 in 1%iger BSA/PBS-Lösung verdünnt ist (z. B. Cy3 Goat Anti-Armenian Hamster IgG, das eine minimale Kreuzreaktivität mit Rindern, Menschen, Serumproteine von Mäusen, Kaninchen und Ratten, siehe Materialtabelle). In einer befeuchteten Kammer für 1 h bei RT inkubieren.
    HINWEIS: Optional: Für die anschließende Bildanalyse kann zusätzlich zum Sekundärantikörper ein Zytoskelett-Marker verwendet werden (z. B. Alexa Fluor 647 Phalloidin verdünnt 1:1.000, siehe Materialtabelle). Für eine einfache Handhabung können die Tropfen der Antikörperlösung auf einer Siegelfolie in einem anderen Behälter statt direkt auf eine feste Oberfläche gegeben werden.
13. Sammeln Sie die Deckgläser mit einer Pinzette und legen Sie die Deckgläser nach dem Abtropfen der überschüssigen Sekundärantikörperlösung in die 24-Well-Platte (mit der Zellseite nach oben) und waschen Sie sie dreimal mit 500 μl PBS.
14. Sammeln Sie die Deckgläser mit einer Pinzette, lassen Sie das überschüssige PBS vorsichtig mit dünnen Tüchern abtropfen und legen Sie jedes Deckglas vorsichtig (mit der Zellseite nach unten) auf einen 50-μl-Tropfen 1:4.000 Hoechst-Lösung (Hoechst 33342) in PBS. In einer Feuchtigkeitskammer für 5 Minuten bei RT inkubieren.
    HINWEIS: Für eine einfache Handhabung können die Tropfen der Antikörperlösung auf eine Siegelfolie in einem anderen Behälter statt direkt auf eine feste Oberfläche gegeben werden.
15. Sammeln Sie die Deckgläser mit einer Pinzette und legen Sie die Deckgläser nach vorsichtigem Abtropfen der überschüssigen Hoechst-Lösung mit dünnen Tüchern wieder in die 24-Well-Platte und waschen Sie sie dreimal mit PBS und einmal mit entionisiertem Wasser (500 μl pro Waschgang).
16. Lassen Sie das überschüssige deionisierte Wasser vorsichtig mit dünnen Tüchern ab, und legen Sie jedes Deckglas vorsichtig (mit der Zellseite nach unten) auf einen 10-20 μl großen Tropfen Eindecklösung (siehe Materialtabelle), der auf einem Objektträger für Immunfluoreszenz getupft wird, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
    HINWEIS: Das hier verwendete Eindeckmedium hat den gleichen Brechungsindex wie Immersionsöl und härtet nach einigen Stunden bei RT oder über Nacht bei 4 °C aus. Es können nicht aushärtende Montagelösungen verwendet werden, es muss jedoch darauf geachtet werden, dass das Deckglas mit Nagellack versiegelt wird.
17. Entfernen Sie die überschüssige Montagelösung durch Aspiration und lassen Sie die Proben trocknen, während sie über Nacht im Dunkeln flach bei RT liegen, entweder in einem Objektträgerhalter oder mit Aluminiumfolie abgedeckt.

3. Bildaufnahme

1. Schalten Sie das konfokale Mikroskop ein. Öffnen Sie die Bildbearbeitungssoftware (siehe Materialtabelle), um die Einrichtung der Bildaufnahme zu starten.
2. Wählen Sie auf der Registerkarte Funktion das Objektiv Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 aus, um die Bilder für die Analyse aufzunehmen.
3. Schalten Sie auf der Registerkarte Erfassungsfunktion die entsprechenden Laser im Laserbereich des Bedienfelds ein (Argon, Diode-405-30, DPSS 561-10 und HeNe633).
4. Erstellen Sie in der Imaging-Setup-Zone des Bedienfelds vier Spuren, wobei jede Spur einem Kanal entspricht, um eine sequenzielle Erfassung durchzuführen.
5. Stellen Sie die geeignete Auflösung der Bilder im Fenster Aufnahmemodus ein. Stellen Sie die Auflösung auf 1.024 x 1.024 (Bildgröße) ein und wählen Sie eine Bittiefe von 16 Bit.
6. Passen Sie für jeden Kanal die Laserleistung und -verstärkung an, um ein gutes Signal ohne gesättigte Pixel zu erhalten, die die Bildintensitätsanalyse behindern würden. Stellen Sie mit der Live-Taste den Laserausgangspegel und die Verstärkung (Master) ein.
   HINWEIS: Die Verwendung der Option "Bereichsanzeige" wird für die Erkennung gesättigter Pixel empfohlen. Halten Sie die Laserleistung zwischen 1 % und 10 % und die Verstärkung (Master) unter 850, um Hintergrundgeräusche zu vermeiden.
7. Stellen Sie in der Zone "Channels " des Bedienfelds für jeden Kanal die gleiche Pinhole-Blende ein, wobei 1 Airy Unit (AU) für den Kanal mit der höchsten Wellenlänge berücksichtigt wird.
8. Erfassen Sie 10 zufällige Felder mit einer ähnlichen Anzahl von Zellen (20-30 Zellen pro Feld). Die Erfassung von 100-200 Zellen pro Bedingung liefert eine gute Leistung für die spätere Bildanalyse.

4. Bildanalyse der ATG9A-Ausbreitung

1. Laden Sie die FIJI-Software aus dem Internet herunter (siehe Materialtabelle). Öffnen Sie das Bild mit FIJI, indem Sie auf Plugins > Bio-Formate > BioFormats Importer klicken.
2. Klicken Sie auf Analysieren > Messungen festlegen und wählen Sie im Messfenster den Grauwert Mittelwert für die Intensitätsanalyse aus.
3. Klicken Sie auf Image > Color > Split Channels und teilen Sie die Kanäle in drei Bilder auf (Golgi-Marker, Zytoskelett, ATG9A-Signal).
4. Gehen Sie zu Bild > passen Sie > Schwellenwert an und definieren Sie einen Schwellenwert im Kanal, der der Golgi-Markierung entspricht.
5. Klicken Sie auf > Auswahl bearbeiten > Auswahl erstellen und erstellen Sie eine Auswahl aus dem Binärbild.
6. Gehen Sie zu >Auswahl bearbeiten > Zum Manager hinzufügen > Umbenennen (Golgi), speichern Sie die Auswahl im ROI-Manager und benennen Sie sie in Golgi um.
7. Klicken Sie auf Bild > > Schwellenwert anpassen und definieren Sie einen Schwellenwert im Kanal, der dem Zytoskelett-Marker entspricht, um die Zellkontur zu definieren.
8. Wechseln Sie zu >Auswahl bearbeiten > Auswahl erstellen und erstellen Sie eine Auswahl aus dem Binärbild.
9. Klicken Sie auf > Auswahl bearbeiten > Zum Manager hinzufügen > Umbenennen (Gesamt), speichern Sie die Auswahl im ROI-Manager und benennen Sie sie in Gesamt um.
10. Wählen Sie das Bild aus, das der ATG9A-Färbung entspricht.
11. Wenden Sie unter Analysieren > Messen den ROI-Golgi an, indem Sie darauf klicken, und messen Sie die Intensität der Golgi-Region.
12. Klicken Sie auf Analysieren > Messen, wenden Sie die ROI-Gesamtsumme an, indem Sie darauf klicken, und messen Sie die Intensität der Gesamtregion.
13. Wiederholen Sie den Vorgang in allen Bildern, speichern Sie die Ergebnisse als .csv-Dateien, und verarbeiten Sie die Daten mit der folgenden Formel:
    ATG9A-Ausbreitungsrate = Golgi-Intensität/Gesamtintensität

5. Lebendzell-Bildgebung von ATG9A-Konstrukten

1. Säen Sie HEK293A Zellen (oder Zellen Ihrer Wahl) in 2 ml Medium in eine 60-mm-Gewebekulturschale, so dass sie am nächsten Tag eine ~65%-70%ige Konfluenz erreichen; Dies ergibt in der Regel 1 x 10 6-2 x 10⁶ Zellen.
2. Bereiten Sie am nächsten Tag Lipofectamin:DNA-Mischungen (oder ein geeignetes alternatives DNA-Transfektionsreagenz, siehe Materialtabelle) wie folgt vor:
   1. Abhängig von der Effizienz der Konstruktexpression werden 0,5-2 μg Plasmid-DNA in 100 μl eines geeigneten serumfreien Mediums verdünnt und die Lösung vorsichtig durch Pipettieren auf und ab gemischt. Die Mischung wird 5 Minuten lang bei RT inkubiert.
      HINWEIS: Das Plasmid-DNA-Konstrukt ist experimentspezifisch. Forscher können entweder selbst klonen oder auf Anfrage von den Autoren erhalten.
   2. Verdünnen Sie das Transfektionsreagenz Lipofectamine 2000 im Verhältnis 3:1 Lipofectamin:DNA in 100 μl eines geeigneten serumfreien Mediums und mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Pipettieren auf und ab. Inkubieren Sie diese Mischung 5 Minuten lang bei RT.
   3. Mischen Sie beide Lösungen miteinander, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren und 20 Minuten lang bei RT inkubieren.
3. Geben Sie den Lipofectamin:DNA-Mix zu jeder Zellkulturplatte, die 4 ml Wachstumsmedium enthält, und wiegen Sie die Platte vorsichtig hin und her, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen. Die Zellen werden bei 37 °C in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 10 % CO₂ inkubiert.
4. Ersetzen Sie das Medium 4 h nach der Transfektion durch frisches Wachstumsmedium und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Zellkulturinkubator bei 10 % CO₂ über Nacht.
5. Am nächsten Tag werden die Zellen auf Kulturschalen, die für die Lebendzellmikroskopie geeignet sind, trypsinisiert, gezählt und erneut ausgesiedelt (Kulturschalen mit einem Deckglas Nr. 1,5, siehe Materialtabelle). Säen Sie 0,4 x 10 6-0,7 x 10⁶ Zellen auf die Schalen, um ~60%-75% Konfluenz auf dem Deckglas zum Zeitpunkt der Bildgebung zu erreichen.
   HINWEIS: Die Beschichtung mit Poly-D-Lysin, wie in Schritt 2.1 erläutert, wird für HEK293A Zellen empfohlen.
6. Am nächsten Tag (48 Stunden nach der Transfektion) werden die Zellen abgebildet.

6. Untersuchung des Glykosylierungszustands von ATG9A

1. Säen Sie HEK293A Zellen (oder Zellen Ihrer Wahl) in eine 10 cm große Gewebekulturschale, damit sie am nächsten Tag ~80% Konfluenz erreichen, wenn Sie endogenes ATG9A untersuchen möchten, was typischerweise 1,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ Zellen in 10 ml ergibt. Alternativ können Sie die Zellen so aussäen, dass sie ~65%-70% Konfluenz erreichen, wenn ATG9A-Konstrukte transfiziert werden, was typischerweise 1 x 10 6-1,5 x 10⁶ Zellen in 10 ml ergibt.
2. Behandeln Sie die Zellen am nächsten Tag mit 100 μg/ml Cyclohexamid (CHX, siehe Materialtabelle) oder Vehikel. 24 Stunden (oder bis zu einem gewünschten Zeitpunkt) inkubieren.
3. Entnehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator, saugen Sie das Medium ab und legen Sie es auf Eis. Ersetzen Sie es durch 5 ml eiskaltes 1x PBS. Lösen Sie die Zellen physikalisch mit einem Zellschaber von der Schale und pipettieren Sie die PBS-Zelllösung in ein 15-ml-Röhrchen mit konischem Boden. Bei 800 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren.
4. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie die Zellen in ~100 μl (abhängig von der Größe des Zellpellets) eiskalten TNTE-Lysepuffer (1 % Triton, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 mM EDTA), ergänzt mit Proteaseinhibitor-Cocktail-Tabletten (siehe Materialtabelle), und überführen Sie sie in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
   1. Das Lysat 15 Minuten lang auf Eis inkubieren. Danach zentrifugiert man das Lysat bei 20.000 x g für 10 min bei 4 °C, um die Kerne und unlöslichen Ablagerungen zu sedimentieren, und überführt den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen.
5. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration des Lysats mit der Bradford-Methode²⁰ und einem Spektralphotometer, das bei einer Wellenlänge von 595 nm messen kann.
6. Normalisieren Sie die Proteinmengen und kombinieren Sie 16 μl des Lysats (das insgesamt nicht mehr als 100 μg Protein enthält) mit 5x PNGase F (Peptid:N-Glykosidada F)-Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers, bevor Sie 1 μl PNGase F-Enzym hinzufügen (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie gemäß den Anweisungen des Herstellers der PNGase F.
7. Fügen Sie ein Volumen von 3x Laemmli-Probenpuffer hinzu, um eine 1-fache Konzentration zu erreichen, und inkubieren Sie bei 65 °C für 5 Minuten, bevor Sie sie für die Elektrophorese mit einem Trisacetat-Gel laden, um die Trennung von Proteinen zu maximieren. Die Proteine aus dem Gel werden auf eine geeignete Membran (d. h. PVDF [Polyvinylidendifluorid]) unter Verwendung von Standard-Western-Blot-Protokollen²¹ übertragen (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Das Kochen der Proben bei 95 °C führt zu einer Aggregation von ATG9A, wodurch der Nachweis von ATG9A verringert wird.
8. Das Western Blot wird mit spezifischen Antikörpern gegen ATG9A (STO-215-Antikörper^{, selbst hergestellt} 1) durchgeführt (siehe Materialtabelle). Lassen Sie den Abschnitt mit höherem Molekulargewicht der Membran ungeschnitten, um die Spezies mit höherem Molekulargewicht von ATG9A sichtbar zu machen.

ATG9A ist ein Transmembranprotein, das mit mehreren intrazellulären Membrankompartimenten 8,17,22,23,24 assoziiert ist. Unter basalen Bedingungen ist ATG9A hauptsächlich im trans-Golgi-Netzwerk (TGN) lokalisiert, was durch die Immunfluoreszenz des endogenen Proteins und die Überlappungen mit GM130, einem cis-Golgi-Marker (Abbildung 1A), sowie in kleinen Vesikel, die sich teilweise mit dem endozytären Recyclingkompartiment (ERC) überlappen, angezeigt wird23. Die Lokalisation von ATG9A am Golgi kann mit verschiedenen Immunfluoreszenzprotokollen nachgewiesen werden. Die vesikuläre Fraktion von ATG9A sowie seine Lokalisationsänderung, insbesondere die Zunahme des vesikulären Pools, als Reaktion auf spezifische Stimuli wie Nährstoff- und Serummangel können jedoch in ihrer Intensität sehr unterschiedlich sein und mit herkömmlichen bildgebenden Verfahren nur schwer sichtbar werden. Das Verhältnis zwischen ATG9A, das am Golgi lokalisiert ist, und ATG9A, das an einer vesikulären Fraktion lokalisiert ist, wird als ATG9A-Ausbreitungsrate bezeichnet. Um Veränderungen in der ATG9A-Ausbreitungsrate zu erkennen, z. B. nach einer EBSS-Behandlung, die zur Depletion von Serum- und Aminosäuren verwendet wird, sind ein Golgi-Marker wie GM130 oder TGN46 und ein Zytoskelettmarker wie Phalloidin, der die Zellkontur25 färbt, nützlich, um die ATG9A-Ausbreitung leicht zu quantifizieren (Abbildung 1B). Wichtig ist, dass die Analyse des mittleren Fluoreszenzverhältnisses nur als Vergleichsmaß zwischen den Bedingungen und nicht als feste Ausbreitungsrate interpretiert werden kann. Das Verhältnis zwischen den Kompartimenten hängt stark von biologischen und nicht-biologischen Faktoren ab, wie z. B. der verwendeten Zelllinie, der Färbequalität oder den angewandten Schwellenmethoden (Abbildung 1B). Aus diesem Grund muss der Forscher eine Pipeline einrichten, die in der Lage ist, die ATG9A-Golgi-Anreicherung unter ihren spezifischen experimentellen Bedingungen zu detektieren und dann die Analyse mit den gleichen Parametern auf alle zu analysierenden Bilder in der zu analysierenden Menge auszuweiten. Repräsentative binäre Bilder und Bereiche, die für die Analyse der mittleren Fluoreszenz von ATG9A ausgewählt wurden, sind in Abbildung 1B als Leitfaden dargestellt.

ATG9A beherbergt mehrere Transmembrandomänen, die von zwei relativ flexiblen und unstrukturierten N- und C-terminalen Domänen flankiert werden, von denen die C-terminale Sequenz fast die Hälfte des Proteins12 umfasst. Wichtig ist, dass das Lokalisierungsmuster von überexprimiertem ATG9A beeinflusst werden kann, indem das Proteinende markiert wird (Abbildung 2A). Insbesondere bei der Verwendung von transienten Expressionssystemen und der Markierung von ATG9A direkt an seinem N-Terminus mit einem fluoreszierenden Tag (z. B. eGFP, mRFP oder Derivaten) kann seine Golgi-Lokalisierung teilweise beeinträchtigt werden, wobei unter basalen (d. h. gefütterten) Bedingungen eine geringere Anreicherung zu beobachten ist, während die ATG9A-Vesikel immer noch gut sichtbar sind (Abbildung 2A). Die Markierung von ATG9A an seinem C-Terminus scheint leicht größere GFP-positive Cluster zu induzieren, die aggregiert werden könnten. Schließlich zeigt auch eine monomere Version von mRFP-ATG9A ähnliche fluoreszierende Vesikelcluster und eine geringe Golgi-Färbung in überexprimierenden Zellen (Abbildung 2A).

ATG9A faltet sich in der ER-Membran, bevor es zu den Golgi- und ATG9A-Vesikeln transportiert wird. Während seines Aufenthalts im ER wird ATG9A durch N-verknüpfte Glykane auf Asparagin 99 modifiziert und erwirbt dann beim Erreichen des Golgi komplexe, reife N-verknüpfte Glykane 1,14. Diese Modifikation durch Glykosylierung kann durch Western Blot durch das Auftreten einer Doppelbande14 nachgewiesen werden. In Übereinstimmung mit seiner intrazellulären Lokalisation beherbergt das endogenste ATG9A komplexe N-verknüpfte Glykane, und daher ist die höhermolekulare Bande vorherrschend, wobei auch eine schwache niedermolekulare Bande sichtbar ist (Abbildung 2B). Das Vorhandensein einer Doppelbande ist am ehesten bei der Verwendung von Trisacetat-Gelen zur Verbesserung der Auflösung von Proteinen mit höherem Molekulargewicht zu erkennen (Abbildung 2B, Kontrolle, t = 0). Wenn das endogene Protein einer PNGase F-Behandlung (Peptid:N-Glykosidase F) unterzogen wird, die den größten Teil der komplexen N-verknüpften Glykane entfernt, läuft das Protein als einzelne Bande (Abbildung 2B, PNGase F, t = 0). Daher kann der N-verknüpfte Glykosylierungsstatus von ATG9A als Proxy verwendet werden, um den Austritt von ATG9A aus dem ER in den Golgi zu überwachen, was sich im relativen Verhältnis zwischen den beiden Banden widerspiegelt.

Bei transienten Transfizierungen von mRFP-ATG9A-Konstrukten sammelt sich das überexprimierte Protein zunächst im ER an, möglicherweise weil die Transportmaschinerie nicht in der Lage ist, das gesamte ATG9A zu falten und zu transportieren, und die niedrigere Molekulargewichtsbande vorherrscht (Abbildung 2C, Kontrolle t = 0). Bemerkenswert ist, dass nach 24 Stunden der Expression von mRFP-ATG9A eine annähernd gleiche Verteilung zwischen dem oberen und dem unteren Band besteht, was darauf hindeutet, dass sich der mRFP-ATG9A-Pool in den Golgi bewegt (Abbildung 2C, Kontrolle, t = 24). Werden die Zellen mit Cycloheximid (CHX) behandelt, das die de novo Proteinsyntheseblockiert 26, kann die Faltung und der Austritt von ATG9A aus dem ER geklärt werden. Da das endogene Protein gefaltet, glykosyliert und im Golgi residiert ist, verändert die Behandlung mit CHX das Verhältnis der unteren und höheren Molekulargewichtsbanden nicht signifikant (Abbildung 2B, Kontrolle). Unter Verwendung der transienten Expression von mRFP-ATG9A fördert die CHX-Behandlung jedoch die Akkumulation der Bande mit höherem Molekulargewicht (Abbildung 2C, Kontrolle, CHX t = 24). Die überexprimierte mRFP-ATG9A-Bande mit höherem Molekulargewicht kollabiert nach der Behandlung mit PNGase F in die untere Bande (Abbildung 2C, PNGase F, t = 24). Diese Daten zeigen, dass das endogene Protein schnell reife Glykane erwirbt, was sich in der Dominanz der höhermolekularen Bande widerspiegelt, und die CHX-Jagd hat keinen Einfluss auf das Verhältnis der Doppelbanden (Abbildung 2B). Im Falle von vorübergehend überexprimiertem mRFP-ATG9A induziert die CHX-Behandlung die Akkumulation des oberen Bandes, was darauf hindeutet, dass reifere Glykane erworben werden, wenn sich der ER-Pool faltet und das ER in den Golgi verlässt (Abbildung 2C).

Die Hinzufügung eines Linkers zwischen der ATG9A-Sequenz und den fluoreszierenden Markierungen kann hilfreich sein, um eine physiologischere Lokalisierung und einen besseren Transport des Proteins zu fördern. Die Fusion einer 3x-FLAG-Sequenz (24 Aminosäuren) zwischen einem N-terminalen Fluorophor und ATG9A trägt dazu bei, dass sich das überexprimierte Protein ähnlich wie das endogene Protein verhält (Abbildung 3). In der Tat kolokalisiert überexprimiertes mCherry-3xFLAG-ATG9A mit dem Golgi-Marker GM130 unter fütterten Bedingungen (Abbildung 3A). Wichtig ist, dass diese Lokalisation und das vesikuläre Kompartiment von ATG9A über die Zeit erhalten bleiben, was eine raumzeitliche Untersuchung des Transports von ATG9A ermöglicht (Abbildung 3B).

Abbildung 1: Bildanalyse der endogenen ATG9A-Lokalisation. (A) Repräsentatives Immunfluoreszenzbild von endogenem ATG9A (rot), GM130 als Golgi-Marker (grün) und Phalloidin zur Visualisierung des Aktin-Zytoskeletts (Cyan). Maßstabsleiste = 10 μm. (B) Ablauf der Bildanalyse zur Bestimmung des Anteils an endogenem ATG9A, der im Golgi-Bereich lokalisiert ist. Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Analyse von fluoreszenzmarkierten ATG9A-Konstrukten durch Lokalisierung und Glykosylierung . (A) eGFP N-terminales ATG9A ist weniger am Golgi lokalisiert und befindet sich hauptsächlich in den Vesikel. eGFP C-terminaled taged ATG9A weist Aggregate innerhalb der Zelle auf (einige Exemplare sind durch weiße Pfeilspitzen gekennzeichnet; eGFP-ATG9A und ATG9A-eGFP sind grün). mRFP N-terminaled taged ATG9A ist weniger am Golgi lokalisiert und befindet sich hauptsächlich in den Vesikel. N gibt die ungefähre Position des Zellkerns an, und der mRFP-ATG9A ist rot. Maßstabsbalken = 5 μm. (B) Endogenes ATG9A erscheint in zwei Banden, wenn es mit Western Blot (Pfeilspitzen) analysiert wird: eine obere Bande (komplexe N-verknüpfte Glykane) und eine untere Bande (keine reifen N-verknüpften Glykane). Die Behandlung mit Cyclohexamid (CHX) hat keinen Einfluss auf das Verhältnis zwischen dem oberen und unteren Band. Die Behandlung mit PNGase F bewirkt das Verschwinden des oberen Bandes. (C) Nach transienter Transfektion von mRFP-markiertem ATG9A in HEK293A Zellen sind zwei prominente Banden auf dem Western Blot (Pfeilspitzen) sichtbar. Die Behandlung mit PNGase F bewirkt das Verschwinden des oberen Bandes. Die Behandlung mit CHX nach der Transfektion führt zu einer erhöhten Glykosylierung, da der Pool an transfiziertem ATG9A aus dem ER in den Golgi transportiert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Analyse der Lokalisation von mCherry-3xFLAG-ATG9A mittels Immunfluoreszenz und Live-Imaging. (A) Immunfluoreszenzexperimente HEK293A Zellen, die mCherry-3xFLAG-ATG9A vorübergehend überexprimieren und mit dem Golgi-Marker GM130 färben. Maßstabsleiste = 10 μm. Der mCherry-3xFLAG-ATG9A ist rot und der GM130 Golgi Marker ist grün. (B) Montage aus Live-Imaging-Experimenten in HEK293A Zellen, die mCherry-3xFLAG-ATG9A vorübergehend überexprimieren. N bezeichnet die ungefähre Lage des Zellkerns. Zeitrahmen = 1 fps. Maßstabsleiste = 10 μm. Die mCherry-3xFLAG-ATG9A ist in Rot gehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

S.A.T. ist Mitglied des wissenschaftlichen Beirats von Casma Therapeutics.