Dieses Protokoll bietet einen einfach zu befolgenden Arbeitsablauf für die Durchführung von Poly(A)-RNA-Aufreinigung, Bisulfitumwandlung und Bibliotheksvorbereitung mit standardisierten Geräten für eine biologische Probe von Interesse.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Anreicherung von mRNA- und Bisulfit-mRNA-Bibliotheksvorbereitung für Next-Generation-Sequencing
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
RNA-posttranskriptionelle Modifikationen in verschiedenen Arten von RNA-Transkripten sind mit einer vielfältigen RNA-Regulation in eukaryotischen Zellen verbunden. Es wurde gezeigt, dass aberrante RNA-5-Methylcytosin-Modifikationen und die dysregulierte Expression von RNA-Methyltransferasen mit verschiedenen Krankheiten, einschließlich Krebs, in Verbindung gebracht werden. Die Transkriptom-weite Bisulfit-Sequenzierung wurde entwickelt, um die Positionen und die quantitativen Cytosin-Methylierungsniveaus in der Bisulfit-konvertierten RNA mit Basenpaarauflösung zu charakterisieren. In diesem Protokoll werden die Verfahren von zwei Runden der Poly(A)-RNA-Reinigung, drei Zyklen der Bisulfitreaktion und der Bibliotheksvorbereitung im Detail vorgestellt, um die transkriptomweite Kartierung von mRNA-5-Methylcytosin-Modifikationsstellen zu ermöglichen. Die Bewertung der RNA-Quantität und -Qualität nach der Hauptreaktion ist für die Überwachung der RNA-Integrität unerlässlich und ein entscheidender Schritt zur Gewährleistung qualitativ hochwertiger Sequenzierungsbibliotheken. Im Idealfall können die Eingriffe innerhalb von drei Tagen abgeschlossen werden. Mit diesem Protokoll können durch die Verwendung hochwertiger Gesamt-RNA als Input praktisch robuste Bisulfit-mRNA-Bibliotheken für die Sequenzierung der nächsten Generation aus der interessierenden Probe aufgebaut werden.
Einleitung
Unter über 150 Arten von posttranskriptionellen Modifikationen1 wurde eine Modifikation von 5-Methylcytosin (m5C) in verschiedenen Arten von RNAs identifiziert, darunter ribosomale RNA, Transfer-RNA, Boten-RNA, Mikro-RNA, lange nicht-kodierende RNA, Vault-RNA, Enhancer-RNA und kleine Cajal-Körper-spezifische RNAs2. Die RNA m5Cist mit verschiedenen biologischen und pathologischen Mechanismen assoziiert, wie z. B. der Regulierung der Pflanzenwurzelentwicklung3, der viralen Genexpression4 und der Krebsprogression5. Das Ziel dieses ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Poly(A)-RNA-Aufreinigung
HINWEIS: Verwenden Sie die mit DNase I behandelte Gesamt-RNA und untersuchen Sie die Gesamt-RNA-Qualität und -Integrität durch Kapillar- oder konventionelle Gelelektrophorese, bevor Sie mit der Poly(A)-RNA-Aufreinigung fortfahren. Die Forscher sollten in der Lage sein, die ribosomalen 28S- und 18S-rRNA-Banden im hochmolekularen Feld und die 5,8S-rRNA-Bande im niedermolekularen Feld ohne signifikante Schmierbanden im Elektropherogramm zu identifizieren. Die Reinigungsschritte folgen im Wesentlichen den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen, die in den spezifischen Schritten angege....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Eine Reihe von bsRNA-seq-Bibliotheken aus Zelllinien19 wurde erzeugt, indem die Verfahren in diesem Bericht befolgt wurden (Abbildung 1). Nach der vollständigen RNA-Aufreinigung mit einer DNase-Behandlung, die an Zelllinienproben durchgeführt wird, und der Qualitätskontrolle durch Gelelektrophorese und UV-Vis-Spektrophotometrie (A260/A280) kann die RNA-Probe zur Poly(A)-RNA-Anreicherung übergehen. Um festzustellen, ob durch die doppelte Aufreinigung d.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
In diesem Protokoll wurde eine detaillierte Pipeline von Poly(A)-Anreicherung, Bisulfitumwandlung und Bibliotheksvorbereitung durch die Verwendung standardisierter Komponenten erreicht. Weitere Sequenzierungsanalysen ermöglichten die Identifizierung von mRNA 5-Methylcytosin in Proben von Interesse.
Der entscheidende Schritt ist die Qualität des Ausgangsmaterials - der Gesamt-RNA -, da der Abbau von RNA die Wiederfindungsrate der Poly(A)-RNA-Reinigung beeinträchtigen würde. Die Probe sollte vor.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom National Science and Technology Council of Taiwan unterstützt. [NSTC 111-2314-B-006-003]
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 Elektrophorese-Bioanalysator-System | Agilent, Santa Clara, Kalifornien | Nachweis der RNA-Qualität | |
| AMpure XP-Kügelchen | Beckman Coulter | A63881 | Aufreinigung |
| DNA-Kit mit hoher Empfindlichkeit | Agilent, Santa Clara, Kalifornien | 5067-4626 | Nachweis der DNA-Qualität |
| Bioanalysator RNA 6000 Pico-Kit | Agilent, Santa Clara, Kalifornien | 5067-1513 | RNA Qualitätsnachweis |
| DiaMag02 - magnetisches Gestell | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | Unterstützung der Bibliotheksvorbereitung |
| DiaMag1.5 - magnetisches Gestell | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | Unterstützung der Poly(A)-RNA-Aufreinigung |
| Dynabeads mRNA DIRECT-Aufreinigungskit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | Poly(A)-RNA-Aufreinigung; Waschpuffer 1 und Waschpuffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA-Methylierungskit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | Bisulfit-Behandlung |
| Firefly Luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | Anstieg der Kontrollsequenz |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Schweiz | KK4824 | Bibliotheksquantifizierung |
| Nanodrop-Spektralphotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | Bibliotheksvorbereitung |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit für Illumina | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | Bibliotheksvorbereitung |
| Nukleasefreies Wasser | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 Pipettierer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Nachweis von RNA-Mengen | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | Nachweis von DNA-Mengen |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | Nachweis von RNA-Mengen |
Referenzen
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
- Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Me....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
