Methodenartikel

Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Gentechnik von Grünen Mikroalgen, Chlorella vulgaris

5.1K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/65382

⸱

27. Oktober 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Waterloo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Nutzung der Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transformation (AMT) zur Integration von Genen von Interesse in das Kerngenom der grünen Mikroalge Chlorella vulgaris, was zur Produktion stabiler Transformanten führt.

Zusammenfassung

Die Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation (AMT) dient als weit verbreitetes Werkzeug zur Manipulation von Pflanzengenomen. A. tumefaciens weist jedoch die Fähigkeit auf, Gene auf eine Vielzahl von Arten zu übertragen. Zahlreichen Mikroalgenarten fehlen etablierte Methoden, um interessante Gene zuverlässig in ihr Kerngenom zu integrieren. Um die potenziellen Vorteile der Mikroalgenbiotechnologie zu nutzen, sind einfache und effiziente Werkzeuge zur Genommanipulation von entscheidender Bedeutung. In dieser Arbeit wird ein optimiertes AMT-Protokoll für die industrielle Mikroalgenart Chlorella vulgaris vorgestellt, das das grün fluoreszierende Reporterprotein (mGFP5) und den Antibiotikaresistenzmarker für Hygromycin B verwendet. Mutanten werden durch Plattierung auf Tris-Acetat-Phosphat (TAP)-Medien ausgewählt, die Hygromycin B und Cefotaxim enthalten. Die Expression von mGFP5 wird nach über zehn Generationen der Subkultivierung mittels Fluoreszenz quantifiziert, was auf eine stabile Transformation der T-DNA-Kassette hinweist. Dieses Protokoll ermöglicht die zuverlässige Generierung mehrerer transgener C. vulgaris-Kolonien in weniger als zwei Wochen unter Verwendung des kommerziell erhältlichen Pflanzenexpressionsvektors pCAMBIA1302.

Einleitung

Agrobacterium tumefaciens, ein gramnegatives bodenbürtiges Bakterium, besitzt eine einzigartige Fähigkeit zum Gentransfer zwischen den Königreichen, was ihm den Titel "natürlicher Gentechniker"1 eingebracht hat. Dieses Bakterium kann DNA (T-DNA) von einem tumorinduzierenden Plasmid (Ti-Plasmid) über ein Typ-IV-Sekretionssystem in Wirtszellen übertragen, was zur Integration und Expression der T-DNA in das Wirtsgenom führt 1,2,3,4. In der Natur führt dieser Prozess bei Pflanzen zur Tumorbildung, die allgemein als Kronengallenkrankheit bekannt ist. Agrobacterium kann T-DNA jedoch auch in verschiedene andere Organismen übertragen, darunter Hefen, Pilze, Algen, Seeigelembryonen und sogar menschliche Zellen unter Laborbedingungen 5,6,7,8.

Unter Ausnutzung dieses natürlichen Systems ermöglicht die Agrobacterium tumefaciens-vermittelte Transformation (AMT) die zufällige Integration von Genen von Interesse in das Kerngenom einer Wirtszelle, indem die T-DNA-Region des Ti-Plasmids modifiziert wird. Zu diesem Zweck ist pCAMBIA13029 ein weit verbreiteter AMT-Pflanzenexpressionsvektor. Forscher können einfache Klonierungs-Workflows in E. coli anwenden, bevor sie den gewünschten Vektor in A. tumefaciens übertragen, um ihn anschließend auf den interessierenden Wirt zu übertragen.

Grüne Mikroalgen sind Eukaryoten, die viele Ähnlichkeiten mit Landpflanzen haben, aber sehr widerspenstig gegenüber gentechnischen Veränderungen sind. Die genetische Transformation spielt jedoch sowohl in der Grundlagen- als auch in der biotechnologischen Erforschung von Mikroalgen eine entscheidende Rolle. In mehreren Mikroalgenarten, insbesondere Chlamydomonas reinhardtii, hat die genetische Transformation durch AMT erfolgreich Transgene wie humanes Interleukin-2 (hIL-2), die Coronavirus-2-Rezeptor-Bindungsdomäne des schweren akuten respiratorischen Syndroms (SARS-CoV-2 RBD) und zwei antimikrobielle Peptide (AMPs) eingeführt10,11,12,13. Unter diesen hat Chlorella vulgaris, eine weniger anspruchsvolle und schnell wachsende Grünalgenart, ein erhebliches Potenzial für die nachhaltige Produktion von Kohlenhydraten, Proteinen, Nutrazeutika, Pigmenten und anderen hochwertigen Verbindungen14. Der Mangel an zuverlässigen Werkzeugen zur Herstellung transgener Stämme von C. vulgaris behindert jedoch den kommerziellen Fortschritt. Da es nur eine begrenzte Anzahl von Veröffentlichungen gibt, die AMT in C. vulgaris15 verwenden, und angesichts der erheblichen Unterschiede zwischen Pflanzen- und Mikroalgenkultivierung, ist eine Optimierung des AMT-Protokolls unerlässlich.

In dieser Studie fügten die Forscher grün fluoreszierendes Protein (mGFP5) stromabwärts des 35S-Promotors des Blumenkohlmosaikvirus (CamV) ein und fügten einen Histidin-Tag hinzu, um es als Reportergen für die Proteinexpression zu verwenden. Die Transformanten wurden mit Hygromycin B ausgewählt, und nach einer Subkultivierung über zwanzig Generationen blieb die Transformation stabil. Das in dieser Arbeit verwendete pCAMBIA1302-Plasmid kann leicht angepasst werden, um jedes Gen von Interesse zu enthalten. Des Weiteren können die vorgestellte Methode und Materialien für andere Grünalgenarten mit einem aktiven CamV35S-Promotor angepasst werden, da dieser Promotor für die Hygromycin-Selektion verwendet wird.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle Medien und Lösungen müssen vor der Verwendung autoklaviert werden, sofern nicht anders angegeben. Alle Zentrifugenröhrchen, Pipettenspitzen usw. sollten vor Gebrauch steril oder autoklaviert sein. Zur leichteren Referenz sind die in diesem Protokoll verwendeten Medienrezepte in Tabelle 1 aufgeführt.

1. Herstellung von elektrokompetenten Zellen von A. tumefaciens

  1. Inimpfen Sie Agrobacterium (AGL-1) in einen sterilen 25-ml-Schüttelkolben mit LB-Medien (ergänzt mit Rifampicin, 20 mg/L-1) aus einem gefrorenen Glycerin-Vorrat und lassen Sie es über Nacht bei 28-30 °C und 150 U/min wachsen.
    HINWEIS: Der Agrobacterium-Stamm AGL-1 ist (siehe Materialtabelle) resistent gegen Rifampicin, Ampicillin, Chloramphenicol und Streptomycin und kann von mehreren Lieferanten bezogen werden.
  2. Am nächsten Tag wird die Kultur 1.000.000-fach verdünnt, indem 0,5 μl der Übernachtkultur zu 50 ml autoklaviertem Reinstwasser gegeben und 10 μl dieser verdünnten Kultur auf einer LB-Platte verteilt und dann 1-3 Tage lang bei 28-30 °C inkubiert wird.
  3. Wählen Sie eine Kolonie aus und beginnen Sie eine 20-ml-Kultur über Nacht in LB mit Rifampicin bei 28-30 °C.
  4. Am nächsten Tag werden 500 ml LB-Medien (kein Antibiotikum) in einem Schüttelkolben mit 9 ml der Nachtkultur geimpft und bei 28-30 °C angebaut, bis der OD600 0,5 erreicht.
  5. Verteilen Sie die Kultur gleichmäßig auf zehn 50-ml-Zentrifugenröhrchen und kühlen Sie sie 30 Minuten lang auf Eis. Die Zentrifuge auf 4 °C vorkühlen.
  6. Die Röhrchen werden bei 4 °C und 4000 x g 15 min zentrifugiert. Anschließend wird mit einer Pipette so viel Überstand wie möglich entfernt und das Pellet in jedem Röhrchen in 50 ml eiskaltem Wasser resuspendiert.
  7. Die Zellen werden bei 4 °C und 4000 x g für 15 min zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 25 ml eiskaltem Wasser in jedem Röhrchen.
  8. Die Zellen werden bei 4 °C und 4000 x g für 15 min zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 1 ml eiskaltem 10%igem (w/v) Glycerin in jedem Röhrchen.
  9. Kombinieren Sie alle Röhrchen zu einem 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 4 °C und 4000 x g 15 Minuten lang. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet wieder in 400 μl eiskaltem 10% (w/v) Glycerin. Die Zellkonzentration sollte etwa 1-3 x10 10 Zellen/ml betragen.
  10. Verteilen Sie die Zellen als 50-μl-Aliquots in sterilen, vorgekühlten Mikroröhrchen. In flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 °C im Gefrierschrank aufbewahren.

2. Elektroporation von A. tumefaciens

  1. Geben Sie 50 μl elektrokompetente AGL-1 A. tumefaciens Zellen in eine vorgekühlte 0,1 mm Küvette und fügen Sie 2 μl pCAMBIA1302 oder ein ähnliches Plasmid (konz. 15 ng/μl) hinzu (siehe Materialtabelle).
  2. Elektroporat bei 2400 V mit einem Elektroporator (200 Ω, kapazitiver Extender 250 μFD, Kapazität 25 μFD, exponentieller Zerfall, siehe Materialtabelle). Die Zeitkonstante sollte für eine erfolgreiche Elektroporation mit exponentiellem Zerfall >4,5 ms betragen.
  3. Geben Sie sofort 1 ml LB-Medium in die Küvette und pipettieren Sie es vorsichtig auf und ab, um es zu mischen. Überführen Sie die 1 ml resuspendierten Zellen in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen und inkubieren Sie es bei 28-30 °C für mindestens 1 Stunde, um sich zu erholen.
  4. Die Zellen werden auf LB-Agar aufgetragen, der das geeignete Antibiotikum enthält (d. h. 50 mg/l Kanamycin für pCAMBIA1302 für die prokaryotische Selektion).
  5. 2-3 Tage bei 28-30 °C inkubieren.
  6. Wählen Sie eine Kolonie aus, züchten Sie über Nacht in LB mit der entsprechenden Selektion (50 mg/l Kanamycin für pCAMBIA1302) und konservieren Sie den plasmidhaltigen Stamm unter Verwendung von 50 % Glycerin bei -80 °C für die zukünftige Verwendung.

3. AMT von C. vulgaris

HINWEIS: Bereiten Sie die Kulturen von C. vulgaris (UTEX 395, siehe Materialtabelle) und A. tumefaciens parallel für die Co-Kultivierung vor. Mit der Kultivierung von C. vulgarisollte 3 Tage vor der Aufbereitung von A. tumefaciens-Kulturen begonnen werden. Das Protokoll wurde auf der Grundlage des von Kumar et al. veröffentlichten Protokolls modifiziert.7.

  1. C. vulgaris-Kultur vorbereiten
    1. C. vulgaris wird traditionell schräg gelagert oder in Log-Phase-Kulturen unter beleuchteten Bedingungen aufbewahrt. Aus einer Log-Phase-Kultur bei OD600 = 1,0 0,5 mL auf eine Tris-Acetat-Phosphat-Agarplatte (TAP, siehe Tabelle 1) ( 1,2 Gew.-% Agar Agar) auftragen und 5 Tage lang bei 25 °C mit Beleuchtung (50 μE/m2s) wachsen lassen. Dies ergibt ca. 5 x 106 Zellen.
  2. A . tumefaciens-Kultur vorbereiten
    1. Züchten Sie den Stamm A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302 in einem Schüttelkolben, indem Sie 10 ml LB-Medien, ergänzt mit 15 mM Glukose, 20 mg/l Rifampicin und 50 mg/l Kanamycin (siehe Materialtabelle) unter Verwendung des Glycerinstamms inokulieren. Bei 28-30 °C und 250 U/min über Nacht inkubieren.
    2. 1 ml Kultur über Nacht in 50 ml LB mit 15 mM Glukose, 20 mg/l Rifampicin und 50 mg/l Kanamycin intubieren und bei 28-30 °C und 250 U/min inkubieren, bis der OD600 1,0 erreicht.
  3. Kokultivierung von C. vulgaris und A. tumefaciens
    1. Um die A. tumefaciens-Kultur für die Co-Kultivierung vorzubereiten, wird die gezüchtete Kultur in ein 50-ml-Röhrchen überführt und bei 4000 x g 30 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen zweimal mit dem Induktionsmedium.
      HINWEIS: Als Induktionsmedium werden TAP-Medien verwendet, die auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt sind und mit F/2-Medium Spurenmetallen und Vitaminen mit 200 μM Acetosyringon (AS, siehe Materialtabelle) ergänzt werden. Resuspendieren Sie die Zellen in Induktionsmedien, so dass OD600 = 0,5 ist.
    2. Um die C. vulgaris-Kultur für die Co-Kultivierung vorzubereiten, geben Sie 25 ml Induktionsmedien auf die C. vulgaris-Platte mit ~ 5 x 106 Zellen. In ein 50-ml-Röhrchen umfüllen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 4000 x g für 15 min bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand.
    3. Mischen Sie das Algenzellpellet mit 200 μl der Bakteriensuspension (OD600: 0,5) und inkubieren Sie sie in einem Rotationsschüttler bei 21-25 °C bei 150 U/min für 1 h.
    4. Die Mischkultur (200 μl) wird auf Induktionsmedienplatten verteilt, die mit 15 mM Glukose angereichert sind, und 3 Tage lang bei 21-25 °C im Dunkeln inkubiert.
    5. Verwenden Sie nach 3 Tagen 10 ml TAP-Medien, ergänzt mit 400 mg/l Cefotaxim oder 20 mg/l Tetracyclin (siehe Materialtabelle), um die Mikroalgen zu sammeln und 2 Tage lang im Dunkeln bei 21-25 °C zu inkubieren, um A. tumefaciens aus der Kultur zu entfernen.
    6. Tragen Sie 500 μl der Kultur auf selektive Medien auf, z. B. TAP-Medien, die mit 20-70 mg/l Hygromycin B (bei Verwendung von pCAMBIA1302) und 400 mg/l-1 Cefotaxim oder 20 mg/l Tetracyclin ergänzt werden. 2 Tage bei 21-25 °C im Dunkeln inkubieren, bevor sie in eine beleuchtete Kammer gestellt werden.
      HINWEIS: Resistente Kolonien erscheinen 5-7 Tage nach der Lichtexposition.
    7. Nehmen Sie einzelne Kolonien von der Transformationsplatte und streifen Sie sie erneut auf TAP-Agarplatten, ergänzt mit 400 mg/l Cefotaxim oder 20 mg/l Tetracyclin und 20-70 mg/l Hygromycin B.

4. Kolonie-PCR (cPCR) zur Bestätigung der Genintegration in C. vulgaris-Transformanten

  1. Extrahieren Sie genomische DNA aus einem C. vulgaris-Transformanten nach mindestens zweimaliger Subkultivierung aus einer einzigen Kolonie mit einem pflanzlichen genomischen DNA-Extraktionskit (siehe Materialtabelle). Unter Verwendung dieses Templates für die PCR werden Primer für die mgfp5-Region der T-DNA entworfen (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' und M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
    1. Führen Sie mit einem Q5-High-Fidelity-DNA-Polymerase-Mastermix-Kit (siehe Materialtabelle) eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch, um die Transgenintegration zu validieren.
      ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie wurden die folgenden Bedingungen verwendet: 98 °C für 3 min; 35 Zyklen (98 °C für 10 s, 57 °C für 30 s, 72 °C für 1 min); 72 °C für 5min. Verwenden Sie pCAMBIA1302 als Positivkontrolle und genomische Wildtyp-DNA von C. vulgaris als Negativkontrolle.
  2. Um zu bestätigen, dass aufgrund einer Restkontamination durch A. tumefaciens kein pCAMBIA1302 in der Probe vorhanden ist, verwenden Sie die Kolonie-PCR. Eine kleine Menge transformierender Zellen wird in 10 μl steriles Wasser gegeben und bei 98 °C 15 Minuten lang gekocht. Verwenden Sie dies als Vorlage für die PCR.
    1. Design von Primern für eine Region außerhalb der T-DNA auf pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' und B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie wurden die folgenden Bedingungen verwendet: 94 °C für 3 min; 30 Zyklen (94 °C für 30 s, 48 °C für 30 s, 68 °C für 5 min); 68 °C für 7 Min. Verwenden Sie eine gekochte Kolonie von A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) als Positivkontrolle und eine gekochte Kolonie von Wildtyp C. vulgaris als Negativkontrolle.
  3. Um zu bestätigen, dass keine A. tumerfaciens-Kontamination in der Probe vorhanden ist, verwenden Sie eine Kolonie-PCR. Eine kleine Menge transformierender Zellen wird in 10 μl steriles Wasser gegeben und bei 98 °C 15 Minuten lang gekocht. Verwenden Sie dies als Vorlage für die PCR.
    1. Design von Primern für das virE2-Gen, das auf dem AGL-1-Virulenzplasmid enthalten ist (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' und virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie wurden die folgenden Bedingungen verwendet: 94 °C für 3 min; 30 Zyklen (94 °C für 30 s, 53 °C für 30 s, 68 °C für 3 min); 68 °C für 7 Min. Verwenden Sie eine gekochte Kolonie von A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) als Positivkontrolle und eine gekochte Kolonie von Wildtyp C. vulgaris als Negativkontrolle.
  4. PCR-Proben werden auf einem DNA-Agarose-Gel zusammen mit einer Leiter (1 Kbp DNA-Leiter, siehe Materialtabelle) durchgeführt, um die Größe der resultierenden Fragmentezu bestätigen 16.

5. Messung der Fluoreszenz von Transformanten

  1. Jeder Transformant aus einer logarithmischen Erhaltungskultur oder einem TAP-Agar-Schräggang wird in 50 ml TAP, ergänzt mit 200 mg/L-1 Cefotaxim und 25 mg/L-1 Hygromycin B, geimpft, so dass der Ausgangs-OD 600 = 0,1 ist. Inokulieren Sie eine Kultur mit Wildtyp C. vulgaris und nur 200 mg/L-1 Cefotaxim als Negativkontrolle. Inkubieren bei 25 °C bei 150 U/min mit 150 μmol/m2s photosynthetisch aktivem Licht (siehe Materialtabelle).
  2. Entnehmen Sie alle 24 Stunden eine 300-μl-Probe und messen Sie die Absorption und Fluoreszenz (Anregung 488 nm, Emission 526 nm) in einem 96-Well-Plattenleser oder UV/Vis-Spektrometer und Fluorometer (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie eine schwarze Platte mit transparentem Boden für gleichzeitige Messungen.

6. Rohproteinextraktion, Proteinreinigung und SDS-PAGE-Elektrophorese

  1. Transformant (#50) aus einer Log-Phase-Erhaltungskultur in 300 ml TAP infizieren, ergänzt mit 200 mg/L-1 Cefotaxim und 25 mg/L-1 Hygromycin B, um den OD680 = 0,1 zu erreichen. Inokulieren Sie eine Kultur mit Wildtyp C. vulgaris und nur 200 mg/L-1 Cefotaxim als Negativkontrolle. Inkubieren bei 25 °C bei 150 U/min mit 150 μmol/m2s photosynthetisch aktivem Licht.
  2. Extrahieren Sie die Rohproteinprobe aus dem Transformanten (#50) und den Wildtyp-Stämmen unter Verwendung von 5 ml Lysepuffer (siehe Tabelle 1), gefolgt von einer 4-minütigen Beschallung.
  3. Reinigen Sie die Rohproteinprobe mit einem Ni-NTA-Harz durch 5-ml-Polypropylensäulen (siehe Materialtabelle).
  4. Gefrierophilisieren Sie die gereinigten 15-ml-Proteinproben und resuspendieren Sie sie in 1-ml-Lysepuffer für die SDS-PAGE-Analyse17.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Um eine erfolgreiche Transformation mit der oben genannten Methode zu zeigen, wurde C. vulgaris entweder mit AGL-1 kokultiviert, das das pCAMBIA1302-Plasmid enthielt, oder ohne das Plasmid (Wildtyp und plattiert auf TAP-Agar, ergänzt mit Hygromycin B und Cefotaxim (Abbildung 1A). Die linke Platte zeigt die transformierten Kolonien, die auf Hygromycin B/Cefotaxim-Platten wachsen können, und die mittlere Platte zeigt, dass Wildtyp-AGL-1 nicht auf den Hygromycin B/Cefotaxim-Platten wac...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Die Effizienz der Transformation ist mit mehreren verschiedenen Parametern verbunden. Die Wahl der A. tumefaciens-Stämme, die für AMT verwendet werden, ist entscheidend. AGL-1 ist einer der invasivsten Stämme, die entdeckt wurden, und wird aus diesem Grund routinemäßig in pflanzlichen AMT eingesetzt. Die Ergänzung des Induktionsmediums mit Glukose (15-20 mM) ist ebenfalls wichtig für die AMT-Effizienz. In Anbetracht der Tatsache, dass C. vulgaris sowohl unter phototrophen als auch unter heterotrophen Be...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Es wurden keine Interessenkonflikte gemeldet.

Danksagungen

Die Autoren danken Prof. Paul Hooykaas für die freundliche Bereitstellung des pCAMBIA1302-Vektors und des Agrobacterium tumefaciens AGL1 vom Institut für Biologie Leiden, Universität Leiden, Niederlande. Die Autoren danken auch Eva Colic für ihre Hilfe bei der Züchtung der fluoreszierenden Transformanten. Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada und dem Mitacs Accelerate-Programm finanziert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 Kb Plus DNA-LeiterFroggaBioDM015
AcetosyringonFisher ScientificD26665G
Agrobacterium tumefaciensGold BiotechnologiesStamm: AGL-1; Geschenk von Prof. Paul HooykaasGenotyp: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
BiotinEnzo Life Sciences89151-400
CaCl2· 2H2OVWRBDH9224-1KG
CefotaximAK ScientificJ90010
Chlorella vulgarisUniversity of Texas at Austin Culture Collection of Algae Strain: UTEX 395Wildtype
Stamm CoCl2· 6H2OSigma AldrichC8661-25G
CuSO4· 5H2OEMD MilliporeCX2185-1
FeCl3· 6H2OVWRBDH9234-500G
Gene Pulser Xcell ElektroporatorBio-Rad1652662Hauptgerät mit PC-Modul.
GeneJET Aufreinigungskit für PflanzengenomThermo ScientificK0791
EisessigVWRCABDH3093-2.2P
GlycerinBioBasicGB0232
HEPES PufferSigma AldrichH-3375
Hygromycin BFisher ScientificAAJ6068103
K2HPO4VWRBDH9266-500G
KanamycinGold BiotechnologiesK-250-25
KH2PO4VWRBDH9268-500G
MgSO4· 7H2OVWR97062-134
MnCl2· 4H2OJT BakerBAKR2540-01
Na2CO3VWRBDH7971-1
Na2EDTA· 2H2OJT Baker8993-01
Na2MoO4· 2H2OJT BakerBAKR3764-01
NaClVWRBDH7257-7
NaH2PO4 H2OMillipore SigmaCA80058-650
NaNO3  VWRBDH4574-500G
NEBExpress Ni ResinNewEngland BioLabsNEB #S1427
NH4ClVWRBDH9208-500G
pCAMBIA1302Universität LeidenGeschenk von Prof. Paul HooykaaspBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S Promotor/mgpf5-6xhis/NOS Säulen
Polypropylen (5 mL)QIAGEN34964
Precision Plus Protein Ungefärbte Proteinstandards, rekombinant mit Strep-Taggung, 1 mLBio-Rad1610363
RifampicinMilliporeSigma R3501-1G
SunBlaster LED-Streifenleuchte 48 Zoll SunBlaster210000000906
Synergy 4 Mikrotiterplatten-UV/Vis-Spektrometer BioTEKS4MLFPTA
TetracyclinThermo Scientific ChemicalsCAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamid Kit, 12%Bio-Rad1610185
ThiaminTCI AmericaT0181-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
TryptonBioBasicTG217(G211)
Vitamin B12 (Cyanocobalamin)Enzo Life Sciences89151-436
HefeextraktBioBasicG0961
ZnSO4· 7H2OJT Baker4382-01
aus

Referenzen

  1. Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
  2. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  3. De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
  4. Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
  5. Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
  6. Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
  7. Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
  8. de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
  9. Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
  10. Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
  11. Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, e0257089(2021).
  12. Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239(2021).
  13. Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
  14. Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36(2018).
  15. Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).
  17. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. , Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed March (2023).
  18. NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. , New England Biolabs Inc. Accessed March https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
  19. Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262(2019).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. Chapter 1: Unit 3D.1. , (2012).
  21. Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
  22. Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
  23. Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458(2021).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

MikroalgantransformationAMT Protokollgr n fluoreszierendes ProteinHygromycin B SelektionPflanzenexpressionsvektorstabile TransformationMikroalgenbiotechnologie

Verwandte Artikel