Summary
여기에서 우리는 열로 사멸된 Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis를 포함하는 불완전한 Freund's adjuvant에 현탁된 면역원성 에피토프 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)35-55를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 실험적 자가면역 뇌척수염을 적극적으로 유도하는 대체 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG)에 의해 유도된 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)은 불활성화된 결핵균을 함유하는 완전 프로인트 보조제 (CFA)에서 유화된 MOG 펩티드에 의한 면역화를 필요로 한다. 마이코박테리움의 항원 성분은 수지상 세포를 활성화하여 T 세포를 자극하여 톨 유사 수용체를 통해 Th1 반응을 촉진하는 사이토카인을 생성합니다. 그러므로, 항원 챌린지 동안 존재하는 마이코박테리아의 양 및 종은 EAE의 발달과 직접적으로 관련된다. 이 방법 논문은 열-사멸된 Mycobacterium avium 아종 paratuberculosis 균주 K-10을 함유하는 변형된 불완전 프로인트 보조제를 사용하여 C57BL/6 마우스에서 EAE를 유도하는 대안적인 프로토콜을 제시한다.
Mycobacterium avium 복합체의 구성원인 M. paratuberculosis는 반추 동물에서 요네병의 원인 물질이며 다발성 경화증을 포함한 여러 인간 T 세포 매개 장애의 위험 인자로 확인되었습니다. 전반적으로, Mycobacterium paratuberculosis로 면역화 된 마우스는 동일한 용량의 M. tuberculosis H37Ra를 함유 한 CFA로 예방 접종 된 마우스보다 조기 발병 및 더 큰 질병 중증도를 보였다. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) 균주 K-10의 항원 결정인자는 훨씬 더 많은 수의 T-림프구(CD4+ CD27+), 수지상 세포(CD11c+ IA/I-E+) 및 단핵구(CD11b+ CD115+) CFA로 면역화 된 마우스와 비교하여 비장에서. 또한, MOG 펩티드에 대한 증식성 T 세포 반응은 M. paratuberculosis-면역화된 마우스에서 가장 높은 것으로 나타났다. 제형 중의 M. paratuberculosis를 함유하는 보조제에서 유화된 뇌파리토겐 (예를 들어, MOG35-55)의 사용은 EAE의 유도 단계 동안 미엘린 에피토프-특이적 CD4+ T-세포를 프라이밍하기 위한 수지상 세포를 활성화시키기 위한 대안적이고 검증된 방법일 수 있다.
Introduction
실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 인간 탈수초성 장애 연구를 위한 일반적인 모델이다1. EAE의 몇몇 모델들이 존재한다: 강력한 보조제와 조합된 상이한 미엘린 펩티드를 사용하는 능동 면역화, 미엘린-특이적 CD4+ 림프구의 시험관내 전달에 의한 수동 면역화, 및 자발적EAE2의 트랜스제닉 모델. 이들 모델 각각은 발병기, 이펙터 단계 또는 만성 단계와 같은 EAE의 상이한 양태가 연구될 수 있도록 하는 특정 특징을 갖는다. EAE의 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG) 모델은 단핵 염증 침윤, 말초 백질에서의 탈수초화, 및 질환 피크1 후 회복 감소를 특징으로 하기 때문에 만성 신경염증 및 탈수초화의 면역 매개 메커니즘을 연구하기에 좋은 모델이다.
MOG-EAE는 완전한 프로인트 보조제(CFA)에서 펩티드 MOG35-55 로 감수성 마우스를 면역화한 후, 백일해 독소를 복강내 주사함으로써 유도된다. 이것은 혈액뇌장벽의 투과성을 증가시키고 말초에서 활성화된 미엘린 특이적 T-세포가 중추신경계(CNS)에 도달하여 재활성화되도록 한다3. CFA는 항원 제시 세포에 의한 항원 흡수 및 체액 및 세포 매개 반응과 관련된 사이토카인의 발현을 향상시킴으로써 EAE의 유도에 핵심적인 역할을 한다4. 이 메커니즘은 주로 오일에 유화 된 사멸 된 Mycobacterium tuberculosis 의 존재에 기인하며, 그 성분은 면역계에 강한 자극을 제공한다5. 실제로, EAE의 유도는 항원 챌린지 동안 존재하는 마이코박테리움의 양과 직접적으로 관련된다6.
불완전한 프로인트 보조제7 및 보조제 조합8의 효과에 마이코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum)과 같은 다른 사멸된 마이코박테리아를 첨가하는 것은 EAE의 임상 경과를 조절할 수 있고 결과적으로 결과의 재현성에 영향을 미칠 수 있다. 반추동물에서 요네병의 병인인 Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis(MAP)는 인간CNS의 염증성 질환과 관련이 있는데, 이는 항원 성분이 다발성 경화증 및 시신경 척수염 스펙트럼 장애 환자에서 강력한 체액 및 세포 매개 반응을 유도할 수 있기 때문이다9. 따라서 이 프로토콜에서는 CFA의 M. tuberculosis를 M. paratuberculosis로 대체하여 MOG-EAE를 유도하는 대안적이고 재현 가능한 방법을 보여줍니다.
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Protocol
모든 마우스 실험은 쥰텐도대학교 의과대학 제도적 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호 290238)의 승인을 받았으며, 국립 보건원 동물 실험 가이드라인에 따라 수행되었습니다.
1. 실험에 대한 일반적인 의견
- 50% ± 10% 습도로 23°C ± 2°C에서 통제되고 병원균이 없는 조건에서 동물 시설의 개별 케이지에 마우스를 수용하고 음식과 물에 대한 임의로 접근할 수 있는 12시간의 명암 주기.
- 항원과 CFA가 없는 인산염 완충 식염수(PBS)를 마우스에 주사하고 각각 음성 및 양성 대조군으로 사용합니다.
2. 마이코박테리아 항원의 제조
- 10% OADC(올레산, 알부민, 덱스트로오스, 카탈라아제), 0.005% 트윈 80 및 2mg/L의 마이코박틴 J가 풍부한 미들브룩 액체 배지 7H9에서 M. paratuberculosis K-10 균주를 37°C의 T25 조직 배양 플라스크에서 2주 동안 성장시킵니다. 육안 검사를 통해 정기적으로 식민지 성장을 평가하십시오.
주의 : 생물 안전 레벨 2 (BSL-2) 시설에서 M. paratuberculosis 를 다루십시오. - 농축 배양액 500mL 삼각 플라스크를 1주일 동안 진탕 배양기에서 200mL(단계 2.1과 동일한 배지)의 최종 부피로 1.7 ×10 5 집락 형성 단위(CFU)/mL의 현탁액으로 성장시킵니다.
참고: 오염된 유기체가 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 박테리아를 Middlebrook 7H10 고체 배지에 접종하여 집락 형태를 결정하고 M. paratuberculosis에 대한 기존 중합효소 연쇄 반응(PCR) 검출 키트로 순도를 확인해야 합니다. - 박테리아 현탁액을 70°C에서 5-10분 동안 비활성화하고 3,000× g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 칭량된 펠릿을 PBS로 2회 세척하고, 초음파 처리에 의해 파쇄하고, -20°C에서 보관하였다.
- 펠렛을 멸균 용기에 옮기고 드라이 아이스 또는 액체 질소로 동결시킵니다. 즉시 동결 건조 챔버로 옮깁니다.
- 동결 건조(진공 상태에서 -50°C에서 4시간) 기계 설명서에 따른 M. paratuberculosis.
- 동결건조가 끝나면 동결건조기에서 스테인리스 스틸 용기를 꺼내 바이오 클리닝 벤치로 옮깁니다. 스테인리스 스틸 주걱을 사용하여 스테인리스 스틸 용기의 내벽에 부착된 건조된 MAP 덩어리를 제거하고 가능한 한 곱게 분쇄합니다.
- 전자 저울을 사용하여 분쇄된 세포의 무게를 측정하고 10mg/mL 농도의 무균 10mL 바이알에 수동으로 넣습니다.
참고: 세포 밀도는 샘플 리터당 건조 중량의 그램으로 정량화되었습니다. 3주 후, 박테리아 세포 펠릿 1mg(습윤 중량)에는 약 2.5 × 108 CFU가 함유되어 있습니다.
3. MOG 35-55 에멀젼의 제조
- 건조된 M. paratuberculosis (10mg) 한 바이알의 내용물을 모르타르와 유봉으로 미세 분말로 분쇄하고 불완전한 프로인트 보조제에 10mL를 첨가하여 10mg/mL 원액을 얻습니다. -4 °C에서 보관하십시오.
- 예방 접종 전에 원액을 최종 농도 4mg/mL로 희석하십시오.
- 펩티드 MOG35-55 를 ddH 2O에 2mg/mL의 최종 농도로 희석하고 -20°C에서 보관합니다.
- 균질기를 사용하여 걸쭉한 에멀젼이 형성될 때까지35-55 용액(2mg/mL)을 4단계의 동일한 부피의 보조제(3.2mg/mL)와 5mL 튜브에 혼합합니다. 10초마다 혼합한 후 용액을 얼음 위에 20초 동안 놓고 튜브를 돌려 모든 용액을 회수합니다.
- 에멀젼을 1mL 주사기에 옮기고 모든 공기를 제거한 다음 27G 바늘을 추가합니다. 이제 에멀젼을 주입 할 준비가되었습니다.
메모. 준비 과정에서 MOG35-55 의 점성 에멀젼이 약간 손실되기 때문에 필요한 양의 1.5 배를 준비하는 것이 가장 좋습니다.
4. 동물 예방 접종
- 동물에 대한 스트레스를 최소화하기 위해 이소플루란을 흡입하여 동물을 마취합니다.
- 에멀젼(MOG35-55의 마우스 200μg당 200μg을 포함하는 200μL)을 허리에 피하 주사합니다.
- 예방 접종 후 0일과 2일에 백일해 독소(200ng/마우스 함유 100μL)를 복강 내 투여합니다.
주의: 백일해 독소는 면역 체계에 다중 억제 효과가 있습니다. 섭취 및 눈과 피부와의 접촉을 피하십시오.
5. 임상 평가
- 체중과 임상 징후에 대해 매일 마우스를 모니터링하십시오. 다음 점수 시스템을 사용하십시오: 0 = 임상 징후 없음; 1 = 흐릿한 꼬리; 2 = 오른쪽 반사의 손상 및 뒷다리의 약점; 3 = 뒷다리의 완전한 마비; 4 = 앞다리의 부분 마비와 함께 뒷다리의 완전한 마비; 5 = 빈사 상태.
참고: 임상 징후가 처음 관찰되면 동물에게 물과 음식에 대한 접근성이 높아집니다. 설치류 차우를 부드럽게하고 축축하게한 다음 음식 호퍼에서 케이지 바닥에 놓습니다. 탈수 된 동물의 경우, 피하 수액 보충이 투여되거나 설치류 차우 슬러리가 경구 위관 영양을 통해 투여됩니다. 쥐가 3일 이상 이러한 유형의 도움이 필요한 경우 안락사가 수행됩니다. - 동물의 고통과 고통을 피하거나 최소화하려면 체중 감소 20% 이상, 임상 점수 ≥4.0, 점수 3에서 교정 반사 부재, 동물이 24시간 동안 사료나 물에 접근할 수 없는 경우와 같은 인간 종점을 사용하십시오.
참고: 마우스를 EAE 유도 후 30일째에 펜토바르비탈(≥150 mg/kg)의 복강내 주사에 의해 안락사시켰다.
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Representative Results
C57BL/6 마우스 그룹(총 n = 15/그룹)을 M. paratuberculosis를 포함하는 에멀젼에서 또는 CFA를 사용한 일반적인 방법으로 MOG35-55로 면역화했습니다. 모든 그룹의 마우스는 14-17 일에 관찰 된 단일 피크의 장애를 특징으로하는 급성 단상 질환을 나타 냈으며, 이후 10 일 동안 증상이 부분적으로 회복되었습니다 (그림 1A). 성별에 관계없이 M. paratuberculosis를 함유하는 보조제로 면역화된 마우스는 CFA로 면역화된 마우스보다 면역화 후 8일에서 9일 사이에 더 일찍 발병하고 급성기에서 더 큰 중증도를 보였다(그림 1B). 그룹 간에 체중에 유의한 차이는 없었다(그림 1C). EAE 마우스로부터의 비장 세포의 세포형광 분석 및 이전에 발표된 바와 같이, 3H-티미딘 혼입에 의해 평가된 T-림프구의 증식 활성을 수행하였다11. EAE 마우스의 모든 비장 세포는, 사용된 애쥬번트와 상관없이, 펩티드 MOG35-55에 대해 강한 증식 반응을 보인 반면, 대조군 펩티드 오브알부민에 대해서는 증식하지 않았다 (도 1D). M. paratuberculosis-면역화된 EAE 마우스는 EAE의 급성기 동안 CFA-면역화된 마우스에 비해 비장에서 T-림프구 (CD4+, CD27+), 수지상 세포 (CD11c+I-A/I-E+), 및 단핵구 (CD11b+CD115+)의 증가된 비율을 나타내었다 (도 1E). 헤마톡실린-에오신에 의한 조직학적 분석은 뇌와 척수에서 전형적인 혈관주위 및 수막 단핵 염증 침윤을 나타냈다(그림 1F).
도 1: 대표적인 EAE 결과. (a) 매일 평가된 마우스의 임상 점수; (b) 질병 경과의 차이; (c) 체중; (d) MOG35-55 펩티드에 대한 T 세포 증식 반응; (e) 급성기 동안 비장세포에서의 면역 세포 집단; (F) 급성기 동안 헤마톡실린-에오신(눈금 막대 = 200μm)으로 염색된 척수 절편(4배 배율)의 조직학적 이미지. 화살표는 염증성 침윤을 나타냅니다. 데이터는 3개의 독립적인 실험(n = 5마리의 마우스/그룹/실험)의 결합된 결과를 보여줍니다. 데이터는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 계산된 평균 ± 표준 편차로 표현되며, 그 후 Bonferroni의 사후 검정 또는 Mann-Whitney U 검정이 뒤따릅니다. 약어: EAE = 실험적 자가면역 뇌척수염; MOG = 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질; PBS = 인산염 완충 식염수; CFA = 완전한 프로인트 보조제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 발명자들은 M. paratuberculosis10을 함유하는 보조제에서 에멀젼화된 펩티드 MOG35-55를 사용하여 C57BL/6J 마우스에서 중증 EAE를 능동적으로 유도하는 강력한 대안 프로토콜을 입증하였다. 이 방법에 의한 EAE의 유도는 CFA와의 일반적인 프로토콜에 의해 유도된 것보다 더 심각한 질환을 초래하였다. 이 차이는 마이코박테리아11의 세포벽에 있는 다른 지질 성분 때문일 수 있습니다. 사실, 다른 마이코박테리아와 달리, M. paratuberculosis는 세포벽 표면에 글리코펩티도리피드 대신 리포펜타펩타이드 항원을 생성한다11. 이 리포펜타펩타이드는 밀접하게 관련된 다른 종과 교차 반응하지 않았으며, 자가면역 질환 환자에서 강력한 특이적 체액성 반응의 표적이 되는 것으로 나타났다12. 마이코박테리아는 면역 반응에서 다양한 역할을 하는 병원체 관련 분자 패턴을 가지고 있습니다9. 예를 들어, 우리는 최근에 M. paratuberculosis에 의한 경구 면역이 MOG-EAE13의 중증도를 증가시키는 반면, Bacillus Calmette-Guerin (BCG)-Tokyo-172에 의한 백신 접종은 활성 및 자발적 EAE 모델14의 진행에 보호 역할을하는 것으로 나타났다.
상기 프로토콜의 잠재적 한계는 EAE의 자가-제한적 단상 과정을 포함하며, 이는 보조제 및 백일해 독소 중의 마이코박테리움의 농도가 배가되는 경우 만성화될 수 있다. 이러한 측면은, 특히 녹아웃 마우스를 사용하여 EAE의 신경퇴행성 측면을 연구할 때, 회복기의 부재는 특정 유전자의 기능의 결여에 의해서가 아니라 사용된 시약의 고용량에 의해 야기될 수 있기 때문에 고려하는 것이 매우 중요하다. 또한, 상술한 프로토콜이 마우스의 균주 및 연령 또는 단백질의 유형 및 양을 변화시킴으로써 다른 EAE 프로토콜에 적용될 수 있지만, EAE 실험이 방법론적으로 올바른 방식으로 수행되도록 하기 위해, 실험 그룹은 연령 및 성별에 대해 매칭되어야 한다.
질병의 발병률이 다양할 수 있기 때문에 문제 해결을 위한 권장 사항은 다음과 같습니다. 최적 M. paratuberculosis 농도는 2에서 4 mg/mL까지 다양할 수 있으며 수성상에서 소량의 항원을 혼합하는 데 3방향 커넥터를 사용할 수 있습니다. 균질기를 사용하여 에멀젼을 제조하는 방법을 설명하였다; 그러나, 오일상에서 수성상에서 소량의 항원을 혼합하기위한 대안적이고 간단한 방법은 두 개의 유리 주사기가 연결된 3 방향 커넥터 피팅을 사용하는 것을 포함한다. 결론적으로, 본 발명자들은 활성 EAE의 유도에서 강력한 보조제 후보로서 M. paratuberculosis 를 확인하였다. 다른 동물 종에서 유도 된 작용 방식과 면역 유형에 대한 추가 연구는 신경 염증의 메커니즘을 이해하기 위해이 대체 방법을 채택 할 가능성에 대한 확신을 높일 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 일본 과학 진흥 협회 (보조금 번호)의 지원을 받았다. JP 23K14675)를 참조하십시오.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | for cytofluorimetry 1:1,000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | for isolation and cultivation of mycobacteria |
| C57BL/6J mice | Charles River Laboratory, Japan | 3 weeks old, male and female | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Techologies, USA | 42F9155K | for cell culture, warm at 37 °C before use |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | for bacteria lyophilization |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | for use in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | help in the growth of Mycobacteria |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteria from bovine origin |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | for use in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | growth promoter | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalotigenic peptide |
| Ovalbumin (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negative control antigen for proliferative assay |
| pertussis toxin solution | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability |
| Polytron homogenizer PT 3100 | Kinematica | for mixing the antigen with the adjuvant | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Gibco Life Techologies, USA | 11875093 | For cell culture |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | for proliferation assay, use (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetry, for cell viability |
References
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