In dieser Studie wurde eine Dot-Blot-Anwendung entwickelt, um Leptospira aus den drei Hauptkladen in Wasserproben nachzuweisen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung minimaler DNA-Mengen, die spezifisch auf eine Digoxigenin-markierte Sonde abzielen und von einem Anti-Digoxigenin-Antikörper leicht nachgewiesen werden können. Dieser Ansatz ist ein wertvolles und zufriedenstellendes Instrument für Screening-Zwecke.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Polymerase-Kettenreaktion und Dot-Blot-Hybridisierung zum Nachweis von Leptospiren in Wasserproben
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Dot-Blot ist eine einfache, schnelle, empfindliche und vielseitige Technik, die die Identifizierung minimaler DNA-Mengen ermöglicht, die spezifisch durch Sondenhybridisierung in Gegenwart von Träger-DNA anvisiert werden. Es basiert auf der Übertragung einer bekannten Menge an DNA auf einen inerten festen Träger, wie z. B. eine Nylonmembran, unter Verwendung der Dot-Blot-Apparatur und ohne elektrophoretische Trennung. Nylonmembranen haben den Vorteil einer hohen Nukleinsäurebindungskapazität (400 μg/cm2), einer hohen Festigkeit und sind positiv oder neutral geladen. Bei der verwendeten Sonde handelt es sich um ein hochspezifisches ssDNA-Fragment von 18 bis 20 Basen mit einer Länge, das mit Digoxigenin (DIG) markiert ist. Die Sonde wird mit der Leptospira-DNA konjugieren. Sobald die Sonde mit der Ziel-DNA hybridisiert ist, wird sie von einem Anti-Digoxigenin-Antikörper detektiert, was einen einfachen Nachweis durch ihre Emissionen ermöglicht, die in einem Röntgenfilm sichtbar sind. Die Punkte mit einer Emission entsprechen den interessierenden DNA-Fragmenten. Bei dieser Methode wird die nicht-isotopische Markierung der Sonde verwendet, die eine sehr lange Halbwertszeit haben kann. Der Nachteil dieser Standard-Immunmarkierung ist eine geringere Empfindlichkeit als Isotopensonden. Dennoch wird sie durch die Kopplung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Dot-Blot-Assays gemildert. Dieser Ansatz ermöglicht die Anreicherung der Zielsequenz und deren Detektion. Darüber hinaus kann es als quantitative Anwendung im Vergleich zu einer seriellen Verdünnung eines bekannten Standards verwendet werden. Eine Dot-Blot-Anwendung zum Nachweis von Leptospira aus den drei Hauptkladen in Wasserproben wird hier vorgestellt. Diese Methode kann auf große Wassermengen angewendet werden, sobald sie durch Zentrifugation konzentriert wurden, um den Nachweis des Vorhandenseins von leptospiraler DNA zu erbringen. Dies ist ein wertvolles und zufriedenstellendes Instrument für allgemeine Screening-Zwecke und kann für andere nicht kultivierbare Bakterien verwendet werden, die im Wasser vorhanden sein können, um das Verständnis des Ökosystems zu verbessern.
Einleitung
Die Leptospirose beim Menschen hat hauptsächlich ihren Ursprung in der Umwelt 1,2. Das Vorkommen von Leptospira in Seen, Flüssen und Bächen ist ein Indikator für die Übertragung von Leptospirose unter Wildtieren sowie Haus- und Nutztieren, die schließlich mit diesen Gewässern in Kontakt kommen können 1,3,4. Darüber hinaus wurde Leptospira in nicht-natürlichen Quellen wie Abwasser, stehendem Wasser und Leitungswasser nachgewiesen 5,6.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Vorbereitung der Probe
- Jede Wasserprobe wird in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 8.000 x g für 10 min bei 4 °C konzentriert. Wiederholen Sie diesen Schritt so oft wie nötig, um die Probe auf ein Volumen von 250 μl zu konzentrieren.
- Verwenden Sie das DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
- Führen Sie die spezifische PCR entsprechend der zu verwendenden Dot-Blot-Sonde durch (Tabelle 1).
- Führen Sie die Amplifikationen in PCR-Röhrchen mit einem Endvolumen von 25 μl durch, das 1 X Puffer, 2,5 Einheiten Taq-Po....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Um die Wirksamkeit der Technik zu bewerten, wurde genomische DNA aus Reinkulturen jedes Leptospira-Serovars zusammen mit der kladespezifischen Sonde verwendet. Die Membranen wurden mit 100 ng genomischer DNA pro PCR-Reaktion für jedes Serovar hergestellt, gefolgt von acht genomischen DNA-Partikeln von nicht verwandten Bakterien und variablen Konzentrationen genomischer DNA der Ad-hoc-Leptospira-Serovare. Jeder Assay umfasste Positiv-, Negativ- und Nicht-Template-Kontrollen. Diese nicht verwandte genomis.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Zu den kritischen Schritten der Dot-Blot-Technik gehören (1) DNA-Immobilisierung, (2) Blockierung der freien Bindungsstellen auf der Membran mit nicht-homologer DNA, (3) die Komplementarität zwischen der Sonde und dem Zielfragment unter Annealing-Bedingungen, (4) die Entfernung der nicht hybridisierten Sonde und (5) der Nachweis des Reportermoleküls41.
Der PCR-Dot-Blot weist bestimmte Einschränkungen auf, wie z.B. dass die Technik keine Informationen über die Größe des .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Wir sind der Leptospira-Sammlung der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie der Fakultät für Veterinärmedizin und Tierzucht der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko zu Dank verpflichtet. Wir danken für die großzügige Spende der Referenz-Leptospira-Stämme ; Leptospira fainei Serovar Hurstbridge Stamm BUT6 und Leptospira biflexa Serovar Patoc Stamm Patoc I an Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Wir danken Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, dem CIBAC-Koordinator, und dem Personal für ihre logistische Unterstützung. EDT war Teil des Terminal-Projektprogramms für Studenten im Grundstudium der Metropolitan Autonom....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Invitrogen | K182002 | ||
| Gotaq Flexi DNA Polimerase (Endpoint-PCR Taq-Polymerase-Kit) | Promega | M3001 | |
| Whatman Filterpapier, Klasse 1, | Merk | WHA1001325 | |
| Nylonmembranen, positiv geladen Rolle 30cm x 3 m | Roche | ||
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab-Fragmente Schafe Polyklonaler Primärantikörper | Roche | 11093274910 | |
| Medium Base EMJH | Difco | S1368JAA | |
| Leptospira Anreicherung EMJH | Difco | BD 279510 | |
| Blockierungsreagenz | Roche | 11096176001 | |
| CSPD gebrauchsfertiges Dinatrium-3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetan-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl)-phenylphosphat | Merk | 11755633001 | |
| Desoxyribonukleinsäure aus Heringssperma | Sigma Aldrich | D3159 | |
| Entwickler Carestream | Carestream Health Inc | GBX5158621 | |
| Digoxigenin-11-ddUTP | Roche | 11363905910 | |
| Dinatriumsalz (Dihydrat) | Promega | H5032 | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fixierer Carestream | Carestream Health Inc | GBX 5158605 | |
| Laurylsulfat Natriumsalz (Natriumdodecylsulfat; SDS) C12H2504SNa | Sigma Aldrich | L5750 | |
| N- Lauroylsarcosin-Natriumsalz CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONa | Sigma Aldrich | L-9150 | Es ist ein anionisches Tensid |
| Polivinylpyrrolidon (PVP-40) | Sigma Aldrich | PVP40 | |
| Polyethylenglykol Sorbitanmonolaurat (Tween 20) | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | Sigma Aldrich | 151-21-3 | |
| Natriumhydroxid (NaOH) | Sigma Aldrich | 1310-73-2 | |
| Natriumphosphat zweibasisch (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Endtransferase, rekombinant | Roche | 3289869103 | |
| Trishydrochlorid (Tris HCl) | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | |
| SSPE 20X | Sigma-Aldrich | S2015-1L | Es kann wie folgt selbst hergestellt werden Ergänzende Datei 6 |
| Primer | Sigma-Aldrich | Auf Anfrage | Tabelle folgen 1 |
| Sonden | Sigma-Aldrich | Auf Anfrage | Tabelle folgen 1 |
| Equipment | |||
| Nanodrop™ One Spektralphotometer | Thermo-Scientific | ND-ONE-W | |
| Gekühlte Mikrozentrifuge Sigma 1-14K, geeignet für die Zentrifugation von 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 14.000 U/min | Sigma-Aldrich | 1-14K | |
| Desinfizierte einstellbare Pipetten, Bereich 2-20 & Mikro; L, 20-200 &Mikro; l | Gilson | Artikelnummer:F167360 | |
| Einweg 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (autoklaviert) | Axygen | MCT-150-SP | |
| Einweg 600 & Mikro; l Mikrozentrifugenröhrchen (autoklaviert) | Axygen | 3208 | |
| Einweg-Pipettenspitzen 1-10 & Mikro; l | Axygen | T-300 | |
| Einweg-Pipettenspitzen 1-200 & Mikro; l | Axygen | TR-222-Y | |
| Dot-Blot-Gerät Bio-Dot | BIORAD | 1706545 | |
| Tragbarer Hergom Suction | Hergom | 7E-A | |
| Scientific Light Box (sichtbares Licht PH90-115V) | Hoefer | PH90-115V | |
| UV-Vernetzer | Hoefer | UVC-500 | |
| Thermo Hybaid PCR Express Thermocycler | Hybaid | ||
| Röntgenkassette mit IP-Platte14 x 17 | Fuji |
Referenzen
- Bierque, E., Thibeaux, R., Girault, D., Soupé-Gilbert, M. E., Goarant, C. A systematic review of Leptospira in water and soil environments. PLOS One. 15 (1), e0227055(2020).
- Haake, D. A., Levett, P. N. Leptospirosis in humans. Current Topics in Microbiology and Immunology. 387
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
