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Polymerase-Kettenreaktion und Dot-Blot-Hybridisierung zum Nachweis von Leptospiren in Wasserproben

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DOI:

10.3791/65435

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14. Juni 2024

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1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Studie wurde eine Dot-Blot-Anwendung entwickelt, um Leptospira aus den drei Hauptkladen in Wasserproben nachzuweisen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung minimaler DNA-Mengen, die spezifisch auf eine Digoxigenin-markierte Sonde abzielen und von einem Anti-Digoxigenin-Antikörper leicht nachgewiesen werden können. Dieser Ansatz ist ein wertvolles und zufriedenstellendes Instrument für Screening-Zwecke.

Zusammenfassung

Der Dot-Blot ist eine einfache, schnelle, empfindliche und vielseitige Technik, die die Identifizierung minimaler DNA-Mengen ermöglicht, die spezifisch durch Sondenhybridisierung in Gegenwart von Träger-DNA anvisiert werden. Es basiert auf der Übertragung einer bekannten Menge an DNA auf einen inerten festen Träger, wie z. B. eine Nylonmembran, unter Verwendung der Dot-Blot-Apparatur und ohne elektrophoretische Trennung. Nylonmembranen haben den Vorteil einer hohen Nukleinsäurebindungskapazität (400 μg/cm2), einer hohen Festigkeit und sind positiv oder neutral geladen. Bei der verwendeten Sonde handelt es sich um ein hochspezifisches ssDNA-Fragment von 18 bis 20 Basen mit einer Länge, das mit Digoxigenin (DIG) markiert ist. Die Sonde wird mit der Leptospira-DNA konjugieren. Sobald die Sonde mit der Ziel-DNA hybridisiert ist, wird sie von einem Anti-Digoxigenin-Antikörper detektiert, was einen einfachen Nachweis durch ihre Emissionen ermöglicht, die in einem Röntgenfilm sichtbar sind. Die Punkte mit einer Emission entsprechen den interessierenden DNA-Fragmenten. Bei dieser Methode wird die nicht-isotopische Markierung der Sonde verwendet, die eine sehr lange Halbwertszeit haben kann. Der Nachteil dieser Standard-Immunmarkierung ist eine geringere Empfindlichkeit als Isotopensonden. Dennoch wird sie durch die Kopplung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Dot-Blot-Assays gemildert. Dieser Ansatz ermöglicht die Anreicherung der Zielsequenz und deren Detektion. Darüber hinaus kann es als quantitative Anwendung im Vergleich zu einer seriellen Verdünnung eines bekannten Standards verwendet werden. Eine Dot-Blot-Anwendung zum Nachweis von Leptospira aus den drei Hauptkladen in Wasserproben wird hier vorgestellt. Diese Methode kann auf große Wassermengen angewendet werden, sobald sie durch Zentrifugation konzentriert wurden, um den Nachweis des Vorhandenseins von leptospiraler DNA zu erbringen. Dies ist ein wertvolles und zufriedenstellendes Instrument für allgemeine Screening-Zwecke und kann für andere nicht kultivierbare Bakterien verwendet werden, die im Wasser vorhanden sein können, um das Verständnis des Ökosystems zu verbessern.

Einleitung

Die Leptospirose beim Menschen hat hauptsächlich ihren Ursprung in der Umwelt 1,2. Das Vorkommen von Leptospira in Seen, Flüssen und Bächen ist ein Indikator für die Übertragung von Leptospirose unter Wildtieren sowie Haus- und Nutztieren, die schließlich mit diesen Gewässern in Kontakt kommen können 1,3,4. Darüber hinaus wurde Leptospira in nicht-natürlichen Quellen wie Abwasser, stehendem Wasser und Leitungswasser nachgewiesen 5,6.

Leptospira ist ein weltweit verbreitetes Bakterium 7,8, und die Rolle der Umwelt bei ihrer Erhaltung und Übertragung ist allgemein anerkannt. Leptospira kann im Trinkwasser bei variablem pH-Wert und unterschiedlichen Mineralienüberleben 9 und in natürlichen Gewässern1. Es kann auch über lange Zeiträume in destilliertem Wasserüberleben 10, und bei konstantem pH-Wert (7,8) kann es bis zu 152 Tage überleben11. Darüber hinaus können Leptospiren in bakteriellen Konsortien interagieren, um unter rauen Bedingungen zu überleben12,13. Es kann Teil von Biofilmen im Süßwasser mit Azospirillum und Sphingomonas sein und ist sogar in der Lage, zu wachsen und Temperaturen von über 49 °C zu ertragen14,15. Sie kann sich auch in durchnässten Böden vermehren und bis zu 379 Tage lang lebensfähig bleiben16, wobei ihre Fähigkeit, die Krankheit zu verursachen, bis zu einem Jahr lang erhalten bleibt17,18. Über die Ökologie in Gewässern und deren Verteilung in den Gewässern ist jedoch nur wenig bekannt.

Seit ihrer Entdeckung basierte die Erforschung der Gattung Leptospira auf serologischen Untersuchungen. Erst in diesem Jahrhundert wurden molekulare Techniken bei der Erforschung dieser Spirochäten immer häufiger eingesetzt. Der Dot-Blot wurde bisher kaum für seine Identifizierung verwendet, wobei (1) eine Isotopensonde auf der Basis der 16S rRNA und ein Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR)19,20, (2) als Nanogold-basierter Immunoassay für humane Leptospirose, der auf Urin angewendet wurde21, oder (3) als Antikörper-basierter Assay für Rinderurinprobenverwendet wurde 22. Die Technik geriet in Vergessenheit, da sie ursprünglich auf Isotopensonden basierte. Es handelt sich jedoch um eine bekannte Technik, die in Verbindung mit der PCR verbesserte Ergebnisse liefert und aufgrund der Verwendung von nicht-isotopischen Sonden als sicher gilt. Die PCR spielt eine entscheidende Rolle bei der Anreicherung der Leptospira-DNA, indem ein spezifisches DNA-Fragment amplifiziert wird, das in Spuren in einer Probe vorkommen kann. Während jedes PCR-Zyklus wird die Menge des Ziel-DNA-Fragments in der Reaktion verdoppelt. Am Ende der Reaktion wurde das Amplikon mit dem Faktor von mehr als einer Millionmultipliziert 23. Das durch PCR amplifizierte Produkt, das in der Agaroseelektrophorese oft nicht sichtbar ist, wird durch spezifische Hybridisierung mit einer DIG-markierten Sonde im Dot-Blot 24,25,26 sichtbar.

Die Dot-Blot-Technik ist einfach, robust und für zahlreiche Proben geeignet, so dass sie auch für Labore mit begrenzten Ressourcen zugänglich ist. Es wurde in einer Vielzahl von Bakterienstudien eingesetzt, einschließlich (1) oraler Bakterien27, (2) anderer Probentypen wie Lebensmittel und Kot28 und (3) der Identifizierung von nicht kultivierbaren Bakterien29, oft in Übereinstimmung mit anderen molekularen Techniken. Zu den Vorteilen der Dot-Blot-Technik gehören: (1) Die Membran hat eine hohe Bindungskapazität und kann über 200 μg/cm2 Nukleinsäuren und bis zu 400 μg/cm2 binden; (2) Dot-Blot-Ergebnisse können visuell interpretiert werden, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind, und (3) sie können bequem jahrelang bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.

Die Gattung Leptospira wurde in pathogene, intermediäre und saprophytische Kladen eingeteilt 30,31. Die Unterscheidung zwischen diesen Kladen kann anhand spezifischer Gene wie lipL41, lipL32 und der 16S rRNA erreicht werden. LipL32 ist in den pathogenen Kladen vorhanden und zeigt eine hohe Sensitivität in verschiedenen serologischen und molekularen Werkzeugen, während es in Saprophytenspezies21 nicht vorhanden ist. Das Housekeeping-Gen lipL41 ist für seine stabile Expression bekannt und wird in molekularen Verfahren32 verwendet, während das16 S rRNA-Gen für ihre Klassifizierung verwendet wird.

Diese Methode kann auf große Wassermengen angewendet werden, sobald sie durch Zentrifugation konzentriert wurden. Es ermöglicht die Beurteilung verschiedener Punkte und Tiefen innerhalb eines Gewässers, um das Vorhandensein von leptospiraliger DNA und der Klade, zu der sie gehört, nachzuweisen. Dieses Instrument ist sowohl für ökologische als auch für allgemeine Screening-Zwecke wertvoll und kann auch zum Nachweis anderer nicht kultivierbarer Bakterien eingesetzt werden, die möglicherweise im Wasser vorhanden sind.

Darüber hinaus sind PCR- und Dot-Blot-Assays für eine Vielzahl von Laboren technisch und wirtschaftlich erschwinglich, selbst für solche, die nicht über hochentwickelte oder teure Geräte verfügen. Ziel dieser Studie ist es, den Digoxigenin-basierten Dot-Blot zur Identifizierung der drei Leptospira-Kladen in Wasserproben einzusetzen, die aus natürlichen Gewässern entnommen wurden.

Bakterienstämme
Zwölf Leptospira-Serovare (Autumnalis, Bataviae, Bratislava, Canicola, Celledoni, Grippothyphosa, Hardjoprajitno, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Pyrogenes, Tarassovi und Wolffi) wurden in diese Studie eingeschlossen. Diese Serovare sind Teil der Sammlung der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie der Fakultät für Veterinärmedizin und Tierzucht der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko und werden derzeit im Mikroagglutinationstest (MAT) verwendet.

Alle Leptospira-Serovare wurden in EMJH kultiviert, und ihre DNA wurde mit einem kommerziellen DNA-Extraktionskit extrahiert (siehe Materialtabelle). Ein genomischer DNA-Mix der zwölf Serovare wurde als Positivkontrolle für die pathogene Leptospira-Klade verwendet. Als Positivkontrolle der Leptospira-Intermediärklade wurde die genomische DNA von Leptospira fainei Serovar Hurstbridge Stamm BUT6 eingeschlossen, und als Positivkontrolle für die Leptospira Saprophytenklade wurde auch die genomische DNA von Leptospira biflexa serovar Patoc Stamm Patoc I eingeschlossen.

Die Negativkontrollen bestanden aus einem leeren Plasmid, DNA von nicht verwandten Bakterien (Ureaplasma urealyticum, Staphylococcus aureus, Brucella abortus, Salmonella typhimurium, Shigella boydii, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii und Escherichia coli) und Wasser in PCR-Qualität, das als Nicht-Template-Kontrolle diente.

Wasserproben
Zwölf Versuchsproben wurden unter Verwendung einer geschichtet-zufälligen Probenahmemethode vom Cuemanco Biological and Aquaculture Research Center (CIBAC) (19° 16' 54" N 99° 6' 11" W) entnommen. Diese Proben wurden in drei Tiefen entnommen: oberflächlich, 10 und 30 cm (Abbildung 1A, B). Die Wasserentnahmeverfahren hatten keine Auswirkungen auf gefährdete oder geschützte Arten. Jede Probe wurde in einem sterilen 15-ml-Mikrozentrifugenröhrchen entnommen. Um die Probe zu entnehmen, wurde jedes Röhrchen vorsichtig in das Wasser getaucht, in der gewählten Tiefe gefüllt und dann verschlossen. Die Proben wurden bei 22 °C gehalten und umgehend zur Verarbeitung ins Labor transportiert.

Jede Probe wurde durch Zentrifugation in sterilen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen bei 8000 x g für 20 min bei Raumtemperatur konzentriert. Dieser Schritt wurde wiederholt, bis alle Proben in einem Röhrchen konzentriert waren, das dann für die DNA-Extraktion verwendet wurde (Abbildung 1C).

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Abbildung 1: Konzentration der Wasserproben durch Zentrifugation. (A) Wasserprobenteiche und (B) Natürliche Bäche. (C) Zentrifugationsbasierte Verarbeitung von Wasserproben in wiederholten Schritten so oft wie nötig (n). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

DNA-Extraktion
Die Gesamt-DNA wurde mit einem handelsüblichen genomischen DNA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert (siehe Materialtabelle). DNA-Extraktionen wurden in 20 μl Elutionspuffer eluiert, und die DNA-Konzentration wurde mit einem UV-Spektrophotometer bei 260-280 nm bestimmt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.

PCR-Amplifikation
Die PCR-Ziele waren die 16Gene S rRNA, lipL41 und lipL32, die DNA der Gattung Leptospira identifizieren und die Unterscheidung zwischen den drei Kladen pathogen, saprophytisch und intermediär ermöglichen. Sowohl die Primer als auch die Sondendesigns basierten auf den früheren Arbeiten von Ahmed et al., Azali et al., Bourhy et al., Weiss et al. und Branger et al.33,34,35,36,37. Die Sequenz jeder Sonde, jedes Primers und jedes amplifizierten Fragments ist in Tabelle 1 beschrieben, und ihre Ausrichtung mit den Referenzsequenzen ist in der Zusatzdatei 1, der Zusatzdatei 2, der Zusatzdatei 3, der Zusatzdatei 4 und der Zusatzdatei 5 angegeben. Die PCR-Reagenzien und Thermocycling-Bedingungen werden im Abschnitt Protokoll beschrieben.

Die Amplifikationsprodukte wurden durch elektrophoretische Trennung an einem 1%igen Agarosegel in TAE (40 mM Trisbase, 20 mM Essigsäure und 1 mM EDTA; pH 8,3) bei 60 V für 45 min mit Ethidium-Bromid-Detektion visualisiert, wie in der ergänzenden Abbildung 1 gezeigt. Genomische DNA, die aus jedem Serovar gewonnen wurde, wurde mit Konzentrationen von 6 x 106 bis 1 x 104 genomischen Äquivalentkopien (GEq) in jeder PCR-Reaktion verwendet, basierend auf der Genomgröße von L. interrogans (4, 691, 184 bp)38 für pathogene Leptospira, der Genomgröße von L. biflexa (3, 956, 088 bp)39 für saprophytische Leptospira, und die Genomgröße des L . fainei Serovars Hurstbridge Stamm BUT6 (4, 267, 324 bp) mit der Zugangsnummer AKWZ00000000.2.

Die Sensitivität der Sonden wurde in jedem Experiment mit DNA aus jedem pathogenen Serovar, dem L . biflexa Serovar Patoc Stamm Patoc I und dem L. fainei Serovar Hurstbridge Stamm BUT6 bewertet. Um die Spezifität des PCR- und Dot-Blot-Hybridisierungsassays zu beurteilen, wurde DNA von nicht verwandten Bakterien einbezogen.

Tabelle 1: PCR-Primer und -Sonden zur Amplifikation von Produkten zur Identifizierung der pathogenen, Saprophyten- und intermediären Kladen von Leptospira. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Dot-Blot-Hybridisierungs-Assay
Die Technik wird als Dot-Blot bezeichnet, da die Löcher, in die die DNA-Probe gelegt wird, eine Punktform haben, und wenn sie angesaugt werden, um durch Vakuumsaugen fixiert zu werden, erhalten sie diese Form. Diese Technik wurde von Kafatos et al.40 entwickelt. Die Technik ermöglicht die Semi-Quantifizierung von Leptospiren in jeder PCR-positiven Probe. Das Protokoll besteht aus einer Denaturierung mit NaOH 0,4 M bei Raumtemperatur, Proben mit Leptospira-DNA von 30 ng bis 0,05 ng, entsprechend 6 x 106 bis 1 x 104 Leptospiren, werden mit einem 96-Well-Dot-Blot-Gerät auf eine Nylonmembran blott. Nach der Immobilisierung wird die DNA durch Einwirkung von 120 mJ UV-Licht an die Membran gebunden. Jede DNA-Sonde wird durch einen terminalen Transferase-Katalyseschritt am 3'-Ende mit Digoxigenin-11 dUTP konjugiert (Digoxigenin ist ein pflanzliches Steroid, das aus Digitalis purpurea gewonnen wird und als Reporter41 verwendet wird). Nach der stringenten Hybridisierung der markierten DNA-Sonde (50 pmol) bei der spezifischen Temperatur auf die Ziel-DNA werden die DNA-Hybride durch die Chemilumineszenzreaktion mit dem anti-Digoxigenin-alkalischen Phosphatase-Antikörper, der kovalent mit seinem Substrat CSPD konjugiert ist, sichtbar gemacht. Die Lumineszenz wird durch Belichtung mit einem Röntgenfilm erfasst (Abbildung 2).

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Abbildung 2: Schritte des Ablaufs für den PCR-Dot-Blot-Assay. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protokoll

1. Vorbereitung der Probe

  1. Jede Wasserprobe wird in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen durch Zentrifugation bei 8.000 x g für 10 min bei 4 °C konzentriert. Wiederholen Sie diesen Schritt so oft wie nötig, um die Probe auf ein Volumen von 250 μl zu konzentrieren.
  2. Verwenden Sie das DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
  3. Führen Sie die spezifische PCR entsprechend der zu verwendenden Dot-Blot-Sonde durch (Tabelle 1).
    1. Führen Sie die Amplifikationen in PCR-Röhrchen mit einem Endvolumen von 25 μl durch, das 1 X Puffer, 2,5 Einheiten Taq-Polymerase, 1 μM jedes Primers, 0,2 mM jedes dNTP, 1,5 mM MgCl2 und 100 ng Ziel-DNA aus jeder Wasserprobe oder Referenz-Genom-DNA enthält.
    2. Programmieren Sie die PCR-Reaktion in einem Thermocycler entsprechend den Thermocycling-Bedingungen (Tabelle 2).
    3. Lagern Sie die Reaktionen bis zur Verwendung bei 4 °C.
  4. Geben Sie 10 μl jedes zu tupfenden PCR-Produkts in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte.
  5. Geben Sie 40 μl TE in jede Vertiefung und mischen Sie durch Pipettieren.
    HINWEIS: Die 96-Well-Platte kann versiegelt und über Nacht bei 4 °C gelagert werden. Befolgen Sie die Anweisungen in der Zusatzdatei 6 , um Puffer und Lösungen für das Protokoll vorzubereiten. Abbildung 3 zeigt die Schritte der Probenvorbereitung.

Tabelle 2: PCR-Thermocycling-Bedingungen für die Gene 16S, lipL41 und lipL32. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Abbildung 3: PCR und Probenvorbereitung. Unter Anwendung des spezifischen PCR-Protokolls wurde das PCR-Produkt auf eine Mikrotiterplatte überführt und 40 μl TE in jede Vertiefung gegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Zusammenbau des Dot-Blot-Geräts

HINWEIS: Der Zusammenbau des Dot-Blot-Geräts ist in Abbildung 4 dargestellt. Tragen Sie während des Eingriffs Handschuhe, um die Alkalilösungen zu handhaben und die Nylonmembran vor Verunreinigungen zu schützen.

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Abbildung 4: Zusammenbau des Dot-Blot-Geräts. Das Filterpapier und die Nylonmembran (zuvor in 10 X SSPE angefeuchtet) müssen in der richtigen Reihenfolge angeordnet werden. Die Baugruppe muss vor dem Anlegen des Vakuums mit den Schrauben fest befestigt werden. Jede Vertiefung muss mit TE gewaschen werden, und die PCR-Produkte werden in die jeweiligen Vertiefungen geladen. Nach dem Transfer des PCR-Produkts durch die Membran wird jede Vertiefung erneut mit TE gewaschen und trocknen gelassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Schneiden Sie die Nylonmembran (siehe Materialtabelle) und das Filterpapier in Blätter mit der Größe 12 x 8,5 cm zu.
  2. Markieren Sie die Membran mit einem Permanentmarker.
  3. Machen Sie mit einer Schere an einer Kante eine Kerbe, um die richtige Ausrichtung anzuzeigen. Verwenden Sie die Markierung, um sich die Musterreihenfolge zu merken.
  4. Befeuchten Sie die Membran und das Filterpapier mit 10 x Kochsalzlösung-Natriumphosphat-EDTA-Puffer (SSPE; 3 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4 und 0,02 M EDTA, pH 7,4) (Zusatzdatei 6). Fassen Sie die Membran mit einer sauberen, stumpfen Pinzette an.
  5. Bauen Sie die Dot-Blot-Kammer zusammen; Zuerst das Filterpapier, dann die Membran über der Kunststoffdichtung. Befestigen Sie die Abdeckung mit den Schrauben quer.
  6. Schließen Sie die Kammer an das Vakuum an, geben Sie 100 μl TE in jede Vertiefung, halten Sie das Vakuum 1 Minute lang und stoppen Sie es dann.
  7. Schalten Sie das Vakuum bei niedriger Geschwindigkeit ein und laden Sie 50 μl jeder Probe in die entsprechende Vertiefung auf der Membran des Dot-Blot-Apparats (gemäß der vorgegebenen Membranverteilung).
    HINWEIS: Homogenisieren Sie jede Probe in der Hämagglutinationsplatte mit 96 Vertiefungen, bevor Sie sie in die Dot-Blot-Kammer geben.
  8. Lassen Sie das Vakuum die Membran trocknen. Schlagen Sie bei Bedarf vorsichtig auf die Kammer, um die Blasen in der Probe freizusetzen.
  9. Waschen Sie jede Vertiefung, indem Sie 100 μl TE mit einem kontinuierlichen Vakuum hineingeben und trocknen lassen.
    HINWEIS: Nach Abschluss des Transfers ist es wichtig, die Pumpe zuerst auszuschalten und abzunehmen. Andernfalls kann Rückfluss in das Gerät gelangen. Bei der Verwendung einer positiv geladenen Nylonmembran ist kein Denaturierungsschritt erforderlich, bei Verwendung eines anderen inerten Trägers kann jedoch ein Vordenaturierungsschritt und eine alkalibasierte Denaturierung erforderlich sein41.

3. DNA-Denaturierung und -Fixierung

HINWEIS: Abbildung 5 veranschaulicht das Verfahren zur DNA-Membranfixierung.

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Abbildung 5: Verfahren zur DNA-Membran-Fixierung. Die DNA wird in einer alkalischen Lösung denaturiert. Anschließend wird es mit 10 X SSPE neutralisiert und die Membran getrocknet. Als nächstes wird die Membran durchleuchtet. Die Membran wird mit 2 X SSPE rehydriert und über Nacht vorhybridisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

  1. Inkubieren Sie die Membran mit 0,4 M NaOH für 10 min bei Raumtemperatur.
  2. Äquilibrieren Sie die Membran mit 10 X SSPE für 10 min bei Raumtemperatur.
  3. Trocknen Sie die Membran bei 80 °C für 2 h.
  4. Transilluminate mit 120 mJ UV-Licht für 3 min. Stellen Sie sicher, dass die Proben mit der Vorderseite nach unten auf die UV-Lichtquelle ausgerichtet sind. Wenn Sie einen UV-Vernetzer verwenden, vergewissern Sie sich, dass die Proben nach oben zeigen, und wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
    HINWEIS: Die Membran muss vor der UV-Vernetzung vollständig trocken sein. Die DNA wird durch eine kovalente Bindung an die Nylonmembran immobilisiert. Jede Vernetzung dauert etwa 18'' bis 1' mit einer optimalen UV-Bestrahlungsdosis von etwa 0,6-0,8 kJ/m2 für die meisten Hybridisierungsexperimente.
    Die Exposition gegenüber UV-Strahlung ist schädlich für Augen und Haut. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung und vermeiden Sie den Kontakt mit nackter Haut.
  5. Waschen Sie die Membran mit 2 X SSPE für 10 min.
  6. Falten Sie die Membran vorsichtig und führen Sie sie in das Hybridisierungsröhrchen ein (verwenden Sie ein 15-ml-Mikrozentrifugenröhrchen).
  7. Geben Sie 10 mL der Prähybridisierungslösung (Ergänzende Datei 6) in das Röhrchen und inkubieren Sie sie über Nacht bei 42 °C. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch ordnungsgemäß abgedichtet wurde, um ein Auslaufen zu verhindern.

4. Hybridisierung

  1. Entfernen Sie 5 mL der Prähybridisierungslösung aus dem Hybridisierungsröhrchen. Um die 5 mL ein zweites Mal zu verwenden, bewahren Sie sie in einem anderen Röhrchen auf und lagern Sie sie bei -4 °C.
  2. Geben Sie 15 μl der markierten Sonde (Tabelle 1) in das Hybridisierungsröhrchen. Spülen Sie die Spitze in die Lösung, um sicherzustellen, dass die markierte Sonde gründlich in die Verdünnung eingeträufelt wurde.
    HINWEIS: Die Bindung der DNA-Sonde ist nicht so stark wie die der Antigen-Antikörper-Bindung. Daher können Änderungen der Konzentration der Sonde oder DNA in der Probe die Intensität der emittierten Fluoreszenz beeinflussen. DNA-Sonden sind stöchiometrisch, was bedeutet, dass die Anzahl der an die DNA gebundenen Sondenmoleküle der Anzahl der in der Lösung vorhandenen DNA-Moleküle entspricht. Abbildung 6 zeigt die Sondenhybridisierung.
  3. Über Nacht bei 42 °C inkubieren.
  4. Führen Sie eine DNA-Sonden-DIG-Markierung durch. Befolgen Sie die Anweisungen in Tabelle 3 , um die Reagenzien zu mischen, und inkubieren Sie die Mischung dann 1 h lang bei 37 °C. Fügen Sie anschließend 80 μl destilliertes Wasser hinzu und lagern Sie die Schwanzsonde bei 4 °C.

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Abbildung 6: Sonden-Hybridisierung. Das Volumen des Hybridisierungspuffers wird angepasst und die mit Digoxigenin markierte Sonde wird eingebaut, um die Hybridisierung der Sonde über Nacht zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 3: Reagenzien für die Sondenmarkierung mit Digoxigenin (DIG). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

5. Chemilumineszenz (Anti-DIG-Tagging)

  1. Waschen Sie die Membran zweimal mit 2 X SSPE/0,1% SDS bei Raumtemperatur für 10 min.
  2. Inkubieren Sie die Membran mit 5 X SSPE/0,1 % SDS bei der Glühtemperatur der Sonde für 15 min.
    HINWEIS: Verwenden Sie in diesem Schritt einen Behälter mit Deckel, um die Temperatur so lange wie möglich zu halten. Sorgen Sie für eine gleichmäßige und konstante Temperatur in der gesamten Membran. Das ungefähre Volumen in jeder Wäsche beträgt 100 ml der angegebenen Lösung.
  3. Waschen Sie die Membran einmal mit Puffer 1 (Ergänzungsdatei 6) bei Raumtemperatur für 5 min.
  4. Waschen Sie die Membran einmal mit Puffer 2 (Zusatzdatei 6) bei Raumtemperatur für 30 min.
  5. Waschen Sie die Membran mit Puffer 2 und fügen Sie den Anti-Digoxigenin-Antikörper (15 μl) hinzu (siehe Materialtabelle), dann inkubieren Sie 45 Minuten lang (die Inkubationszeit kann zwischen 30 und 60 Minuten variieren). Dieser Sekundärantikörper markiert die Sonde für den Nachweis.
    HINWEIS: Die Membran kann in Puffer 2 mit dem Anti-Digoxigenin-Antikörper über Nacht bei 4-8 °C gelagert werden. Das Anti-DIG-Tagging des Chemilumineszenzprozesses ist in Abbildung 7 dargestellt.

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Abbildung 7: Anti-DIG-Tagging des Chemilumineszenzprozesses. Die ungebundenen Nukleinsäuren werden mit Pufferlösungen entfernt. Die Sonde wird auf die Ziel-DNA ausgerichtet und der Überschuss wird entfernt. Die Membran wird mit dem blockierenden 1 X-Puffer blockiert und der Anti-DIG-Antikörper (1:10000) hinzugefügt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. Chemilumineszenz (Substratanwendung)

  1. Waschen Sie die Membran zweimal in Puffer 1 bei Raumtemperatur für 15 min.
  2. Einmal in Puffer 3 (siehe Zusatzdatei 6) bei Raumtemperatur 5 Minuten waschen, damit die Membran den größten Teil des Puffers ablassen kann und fast trocken bleibt.
  3. Geben Sie CSPD gebrauchsfertig (Dinatrium-3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetan-3,2′-(5′-chlor)tricyclo [3.3.1.13,7] decan}-4-yl)phenylphosphat, siehe Materialtabelle) hinzu und lassen Sie es 5 min ruhen (mit angefeuchteten Fingern das CSPD von einer Seite zur anderen homogenisieren).
  4. Legen Sie die Membran in eine durchsichtige Plastiktüte (12,5 x 9 cm), die dem Membranmaß entspricht. Entfernen Sie vorsichtig Luftblasen, verteilen Sie den CSPD gleichmäßig und versiegeln Sie den Beutel mit heißem Siegel.
  5. Inkubieren Sie die Membran 15 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 °C (es kann bis zu 30 Minuten dauern) und stellen Sie sicher, dass die Membran mit den Proben nach unten gelegt wird, so dass sie gut untergetaucht ist. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur konstant bleibt und gut über die Membran verteilt wird.
  6. Trocknen Sie die Plastiktüte und befestigen Sie sie mit Klebeband auf einer bereits verwendeten Röntgenfolie. Dies ermöglicht eine einfache Handhabung während des Belichtungsvorgangs.
    HINWEIS: Abbildung 8 zeigt die Substratanwendung des Chemilumineszenzprozesses.

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Abbildung 8: Substratapplikation des Chemilumineszenzprozesses. Der freie Antikörper wird entfernt und das Substrat CSPD (1:250) wird der Membran zugesetzt. Die Reaktion wird durch Inkubation bei 37 °C aktiviert und die Membran so angeordnet, dass sie die Chemilumineszenz in einem Röntgenfilm aufzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

7. Chemilumineszenz (Detektion)

  1. Führen Sie das Belichtungsverfahren durch. Bereiten Sie in der Dunkelkammer die Entwickler- und Fixierlösungen (siehe Materialtabelle) in den jeweiligen Fächern vor.
  2. Legen Sie die fixierte Membran im Dunkeln vorsichtig auf einen neuen Röntgenfilm und legen Sie ihn in eine Röntgenkassette ein (siehe Materialtabelle).
  3. Registrieren Sie die Expositionszeit. Die Expositionszeit kann zwischen 1 Minute und 30 Minuten oder mehr variieren. Beginnen Sie mit 5 min und passen Sie die Zeit entsprechend an.
  4. Den Röntgenfilm in der Entwicklerlösung 1-3 min anfeuchten und vorsichtig mit Leitungswasser (15-45 s) nachspülen.
  5. Den Röntgenfilm 1-3 min in Fixierlösung anfeuchten und vorsichtig mit Leitungswasser (45 s) nachspülen.
  6. Lassen Sie den Röntgenfilm an der Luft trocknen und dokumentieren Sie den Assay in einem sichtbaren weißen Leuchtkasten.
    HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Membran während der Röntgenbelichtungszeit zu schütteln. Der Erkennungsprozess ist in Abbildung 9 dargestellt.
  7. Fahren Sie mit der Ergebnisinterpretation fort. Im belichteten Röntgenfilm können die Punkte mit Emission visuell lokalisiert werden und entsprechen den DNA-Fragmenten mit der Hybridisierung der Sonde. Die Intensität des ausgesendeten Signals hängt von der Lumineszenz und der Dauer der Belichtung ab.
    HINWEIS: Membranen können zwischen Filterpapier getrocknet mehrere Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.

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Abbildung 9: Detektion des Chemilumineszenzprozesses. Unter dunklen Bedingungen wird die Membran einem Röntgenfilm in einer Röntgenkassette ausgesetzt. Anschließend ließ man ihn während der Belichtungszeit stehen, dann wurde der Röntgenfilm entwickelt und fixiert. Zum Schluss wurde es an der Luft getrocknet und interpretiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

8. Verfahren zur Dehybridisierung der Membran

  1. Waschen Sie die Membran zweimal für 10 Minuten mit destilliertem Wasser.
  2. Waschen Sie die Membran 20 min lang mit 0,4 M NaOH bei 53 °C (zweimal).
  3. Waschen Sie die Membran zweimal 10 Minuten lang mit 2 x SSPE.
  4. Lassen Sie die Membran bei Raumtemperatur trocknen.
  5. Bewahren Sie die Membran auf und kehren Sie zu Schritt 3.5 des Protokolls zurück.
    HINWEIS: Die Membran kann über Nacht bei 4-8 °C im Prähybridisierungspuffer gelagert werden. Am nächsten Tag wird die Inkubation bei 42 °C für 1 h neu gestartet, damit der Vorhybridisierungspuffer die Temperatur erreichen kann. Fahren Sie dann mit Schritt 3.5 des Protokolls fort.

Ergebnisse

Um die Wirksamkeit der Technik zu bewerten, wurde genomische DNA aus Reinkulturen jedes Leptospira-Serovars zusammen mit der kladespezifischen Sonde verwendet. Die Membranen wurden mit 100 ng genomischer DNA pro PCR-Reaktion für jedes Serovar hergestellt, gefolgt von acht genomischen DNA-Partikeln von nicht verwandten Bakterien und variablen Konzentrationen genomischer DNA der Ad-hoc-Leptospira-Serovare. Jeder Assay umfasste Positiv-, Negativ- und Nicht-Template-Kontrollen. Diese nicht verwandte genomische DNA zeigte keine Affinität zu den Dot-Blot-Sonden. Die Membranverteilung und die Dot-Blot-Membranen sind in der ergänzenden Abbildung 2, der ergänzenden Abbildung 3, der ergänzenden Abbildung 4, der ergänzenden Abbildung 5, der ergänzenden Abbildung 6 und der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt. In Bezug auf die Saprophytenklade unter Verwendung des DB_Saproprobe mit dem PCR-Produkt von 1059 bp, amplifiziert mit Primern DB_16SPathoREV und DB_16SPathoFWD, und des PCR-Produkts von 517 bp, amplifiziert mit Primern DB_16SSapREV und DB_16SSapFWD mit genomischer DNA von Leptospira biflexa Serovar Patoc Stamm Patoc I, Es war möglich, zwischen 0,05 und 0,1 ng Saprophyten-DNA nachzuweisen (Ergänzende Abbildung 2 und Ergänzende Abbildung 3). Ebenso für den Nachweis der intermediären Klade unter Verwendung des DB_Interprobe mit dem PCR-Produkt von 1059 bp, amplifiziert mit Primern DB_16SPathoREV und DB_16SPathoFWD, und des PCR-Produkts von 299-301 bp, amplifiziert mit den Primern DB_16SInterREV und DB_16SInterFWD mit genomischer DNA von Leptospira fainei Serovar Hurstbridge Stamm BUT6 (Ergänzende Abbildung 4 und Ergänzende Abbildung 5) konnten etwa 0,1 ng der intermediären DNA nachgewiesen werden. In ähnlicher Weise gilt für die pathogene Klade unter Verwendung der DB_16SPathoprobe mit dem PCR-Produkt von 1059 bp, amplifiziert durchPrimer DB_16 SPathoREV und DB_16S PathoFWD, oder der DBlipL41probe mit dem PCR-Produkt von 479 bp, amplifiziert durch Primer DB_lipL41REV und DB_lipL41FWD mit genomischem DNA-Mix aus pathogenen Leptospira-Serovaren, Es war möglich, DNA-Konzentrationen im Bereich von 0,3-0,6 ng pathogener DNA nachzuweisen (Ergänzende Abbildung 6 und Ergänzende Abbildung 7).

Die Assays, die zur Identifizierung der drei Kladen entwickelt wurden, können für jede Klade einzeln verwendet werden. Im Falle von wertvollen und knappen Proben kann jedoch eine einzelne Membran mit Primern DB_16SPathoREV und DB_16SPathoFWD hergestellt werden, die ein 1058-1069 bp-Produkt amplifizieren. Dieses Produkt kann dann mit der DB_Interprobe, der DB_Saproprobe und der DB_16SPathoprobe einzeln hybridisiert werden, wobei der De-Hybridisierungsschritt (Schritt 8) jeweils vor jedem von ihnen liegt. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung aller Kladen in derselben Membran.

In den Feldwasserproben wurde das lipL32-Sondenprotokoll angewendet. Die DNA jeder Wasserprobe wurde in einer Konzentration von 100 ng pro PCR-Reaktion verwendet. Zusätzlich wurde eine DNA-Extraktionsprotokollkontrolle eingeschlossen, die darin bestand, 100 ng genomische DNA von Leptospira in eine 15 mL destillierte Wasserprobe zu spicken. Negativ- und Positivkontrollen wurden ebenfalls einbezogen (Abbildung 10).

Tabelle 4: Beschreibung und Tiefe der Wasserproben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

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Abbildung 10: Dot-Blot-Assay jeder Wasserprobe. (A) Membranverteilung und (B) Dot-Blot der DB_lipL32probe und des Produkts (262 bp) der Primer DB_lipL32REV und DB_lipL32FWD der Feldwasserproben. Die Oberfläche von Teich 3 zeigt ein positives Ergebnis, und sowohl die Kontrolle des Extraktionsprotokolls als auch die Positivkontrollen haben ein intensives Signal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Beschreibung der Wasserprobe ist in Tabelle 4 dargestellt, und die Verteilung und das Bild der Dot-Blot-Membran sind in Abbildung 9 dargestellt. Der Punkt A7 zeigt, dass leptospirale DNA auf der Oberfläche von Teich 3 vorhanden war. Um die DNA-Konzentration zu bestimmen, die in Teich 3 vorhanden war, wurde ein Dot-Blot-Assay mit bekannten DNA-Konzentrationen einer Mischung aus Leptospira-Serovaren und der lipL32-Sonde durchgeführt (Abbildung 11). Die Membran wurde mit genomischer DNA präpariert, die von 100 ng bis 1 x 10-13 ng in jedem Punkt verteilt war. Die minimale Konzentration, die zweifelsfrei nachgewiesen werden kann, betrug etwa 0,3 ng, was 6 x 105 GEq in den Wasserproben entspricht.

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Abbildung 11: Dot-Blot-Assay mit bekannten DNA-Konzentrationen einer Mischung aus Leptospira-Serovaren und der lipL32-Sonde. (A) Membranverteilung und (B) Dot-Blot der DB_lipL32probe und des Produkts (262 bp) von Primern DB_lipL32REV und DB_lipL32FWD mit Verdünnungen (1:2) einer genomischen DNA-Mischung pathogener Leptospira-Serovare . Das Signal der Sonde kann bis zu einer Größe von 3,91 x 10-1 ng des Leptospira-DNA-Mixes leicht nachgewiesen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: PCR-Amplifikationsprodukte, die durch elektrophoretische Trennung sichtbar gemacht werden. Bahn 1. Molekulargewichtsmarker 100 bp DNA-Leiter. Bahn 2. PCR basierend auf dem lipL32-Gen mit pathogenem Leptospira-DNA-Mix als Vorlage; Bahn 3. PCR basierend auf dem lipL41-Gen mit pathogenem Leptospira-DNA-Mix als Vorlage; Bahn 4. PCR basierend auf dem 16S rRNA-Gen mit pathogenem Leptospira-DNA-Mix als Template; Bahn 5. PCR basierend auf dem 16S rRNA-Gen mit Primern DB_16SSapREV und DB_16SSapFWD und Leptospira biflexa serovar Patoc Stamm Patoc I DNA als Template; Bahn 6. PCR basierend auf dem 16S rRNA-Gen mit Primern DB_16SPathoREV und DB_16SPathoFWD und Leptospira biflexa Serovar Patoc Stamm Patoc I DNA als Template; Bahn 7. PCR basierend auf dem 16S rRNA-Gen mit Primern DB_16SInterREV und DB_16SInterFWD und Leptospira fainei, Serovar Hurstbridge Stamm BUT6 DNA als Template; Bahn 8. PCR basierend auf dem 16S rRNA-Gen mit Primern DB_16SPathoREV und DB_16SPathoFWD und Leptospira fainei, Serovar Hurstbridge Stamm BUT6 DNA als Vorlage. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: (A) Membranverteilung und (B) Dot-Blot des DB_Saproprobe und das Produkt (1059 bp) der Primer DB_16SPathoREV und DB_16SPathoFWD der genomischen DNA von Leptospira biflexa serovar Patoc, Patoc I. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: (A) Membranverteilung und (B) Dot-Blot des DB_Saproprobe mit dem Produkt (517 bp) der Primer DB_16SSapREV und DB_16SSapFWD der genomischen DNA von Leptospira biflexa Serovar Patoc, Patoc I. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: (A) Membranverteilung und (B) Dot-Blot des DB_Interprobe mit dem Produkt (1059 bp) von Primern DB_16SPathoREV und DB_16SPathoFWD und genomischer DNA von Leptospira fainei Serovar Hurstbridge Stamm BUT6. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: (A) Membranverteilung und B) Dot-Blot des DB_Interprobe und des Produkts (299-301 bp) der Primer DB_16SInterREV und DB_16SInterFWD mit genomischer DNA von Leptospira fainei Serovar Hurstbridge Stamm BUT6. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: (A) Membranverteilung und (B) Dot-Blot der DB_16SPathoprobe und des Produkts (1059 bp) der Primer DB_16SPathoREV und DB_16SPathoFWD mit genomischem DNA-Mix pathogener Leptospira-Serovare.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: (A) Membranverteilung und (B) Dot-Blot des DB_lipL41probe mit dem Produkt (479 bp) von Primern DB_lipL41REV und DB_lipL41FWD mit genomischem DNA-Mix pathogener Leptospira-Serovare.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: Ausrichtung der Saprophyten-Leptospira-Spezies mit den Primern und der Sonde auf der Grundlage der ribosomalen 16-S-RNA-Sequenz. Primer sind zur Identifizierung fett und schwarz hervorgehoben, wobei ihre Richtung durch schwarze Pfeile angezeigt wird. Die Sonde ist fett markiert und grau hervorgehoben, ihre Position ist mit einer grauen Linie markiert. Die ausgerichteten Sequenzen werden hellgrau hervorgehoben, während die nicht entsprechenden Sequenzen in Schwarzweiß dargestellt sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Ausrichtung der intermediären Leptospirenspezies mit den Primern und der Sonde auf der Grundlage der ribosomalen 16-S-RNA-Sequenz. Primer sind zur Identifizierung fett und schwarz hervorgehoben, wobei ihre Richtung durch schwarze Pfeile angezeigt wird. Die Sonde ist fett markiert und grau hervorgehoben, ihre Position ist mit einer grauen Linie markiert. Die ausgerichteten Sequenzen sind in hellgrau dargestellt, während die nicht entsprechenden Sequenzen in Schwarzweiß dargestellt sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: Alignment der pathogenen Leptospira-Spezies mit den Primern und der Sonde auf der Grundlage der lipL32-Gensequenz. Primer sind zur Identifizierung fett und schwarz hervorgehoben, wobei ihre Richtung durch schwarze Pfeile angezeigt wird. Die Sonde ist fett markiert und grau hervorgehoben, ihre Position ist mit einer grauen Linie markiert. Die ausgerichteten Sequenzen sind in hellgrau dargestellt, während die nicht entsprechenden Sequenzen in Schwarzweiß dargestellt sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: Alignment der pathogenen Leptospira-Spezies mit den Primern und der Sonde auf der Grundlage der lipL41-Gensequenz. Zur Identifizierung sind die Primer fett gedruckt und schwarz hervorgehoben, wobei ihre Richtung durch schwarze Pfeile angezeigt wird. Die Sonde ist fett dargestellt und dunkelgrau hervorgehoben, ihre Position ist mit einer grauen Linie markiert. Die ausgerichteten Sequenzen sind in hellgrau, während die nicht entsprechenden Sequenzen in Schwarzweiß dargestellt sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 5: Ausrichtung der Leptospira-Spezies mit den Primern, die auf die ribosomale 16-S-RNA-Sequenz abzielen, und den Sonden für Saprophyten, intermediäre und pathogene Spezies. Zur Identifizierung sind die Primer fett markiert und schwarz hervorgehoben, wobei ihre Richtung durch schwarze Pfeile markiert ist. Die Sonden sind fett gedruckt und grau hervorgehoben, wobei ihre Positionen durch graue Linien dargestellt werden. Die ausgerichteten Sequenzen sind in Hellgrau und die nicht entsprechenden Sequenzen in Weiß und Schwarz. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 6: Puffer und Lösungen für den Dot-Blot-Assay. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Zu den kritischen Schritten der Dot-Blot-Technik gehören (1) DNA-Immobilisierung, (2) Blockierung der freien Bindungsstellen auf der Membran mit nicht-homologer DNA, (3) die Komplementarität zwischen der Sonde und dem Zielfragment unter Annealing-Bedingungen, (4) die Entfernung der nicht hybridisierten Sonde und (5) der Nachweis des Reportermoleküls41.

Der PCR-Dot-Blot weist bestimmte Einschränkungen auf, wie z.B. dass die Technik keine Informationen über die Größe des hybridisierten Fragments37 liefert, dass sie die Dehybridisierung einer einzelnen Membran vor der Rehybridisierung mit einer zweiten oder dritten Sonde erfordert und dass sie bis zum Endergebnis erhebliche Zeit und Mühe erfordert.

Diese Technik hat sich als konsistent mit anderen molekularen Techniken 42,43 und ihren Anwendungen erwiesen. Reverse Dot-Blot, Nanogold Dot-Blot21 und Dot-ELISA42 wurden für den Nachweis spezifischer Gene in Organismen wie Treponema44, Borrelia burgdorferi45, E. coli46, Helicobacter pylori47 und Mycobacterium tuberculosis48,49 basierend auf der 16S rRNA29,43 und für den Nachweis von DNA oder RNA von Pflanzen eingesetzt Viren41. Die Nachweisgrenze (LOD), definiert als die niedrigste Konzentration des Mikroorganismus, die mit dieser Technik50 konsistent und zuverlässig gemessen werden kann, reichte von 100 pg (5 x 104 Bakterien) für H. pylori47 bis zu einer Einzelzelle von B. burgdorferi in klinischen Proben45 und einer fg, die kleiner als eine Zelle ist. von M. tuberculosis48,49.

Ein wertvoller Aspekt dieser kombinierten Methodik ist ihre Fähigkeit, die Nachweisgrenze um eine Größenordnung zu verlängern und so falsch negative Ergebnisse aufgrund von zwei Probenbedingungen zu überwinden, die zu inkonsistenten Ergebnissen führen können: (1) Proben mit unzureichender DNA oder (2) Probenkontamination, die einen 100%igen Nachweis positiver Proben ermöglicht 25,45,47,48,49. Der PCR-Dot-Blot ist in der Lage, geringere Mengen an amplifizierten Produkten zu detektieren als bei der Agarose-Gelelektrophorese und vermeidet eine Kontamination als Folge zweiter Amplifikationsschritte, wie bei der nested und semi-nested PCR. Diese Vorteile sind besonders wichtig bei der Arbeit mit Umweltproben mit einer geringen bakteriellen Ladung, die ein breiteres Spektrum an Inhibitoren und DNA aus nicht verwandten Quellen enthalten können, die die molekularen Techniken beeinträchtigen können.

Frühere Arbeiten deuten darauf hin, dass Leptospiren durch DNA-Sonden identifiziert werden können, die mit Photobiotin markiert sind und eine LOD von 5 pg (5 x 10,3 Leptospiren) erreichen51. DIG-markierte Sonden detektieren 0,1-1 pg (102 Leptospire), während 32P-markierte Sonden 1-5 pg (750 bis 1000 Leptospire)51 und Biotin-markierte Sonden 5 pg (2500 Leptospire)52 detektieren. Des Weiteren erreichten 32P-markierte Sonden für Saprophyten Leptospira eine LOD von 1,95 ng und für pathogene Leptospiren 3,9 ng53. In dieser Studie wurden ähnliche LODs für die drei Kladen festgelegt. Die LOD für pathogene Spezies betrug etwa 0,3 ng genomischer DNA (6-8 x 104 GEq) (Abbildung 11), und für die Saprophyten und intermediären Spezies sank sie auf 0,1 ng (2 x 104 GEq). Bemerkenswert ist, dass frühere Forschungen mit reinen Leptospira-Kulturen 51 und Seren von experimentell infizierten Goldhamstern durchgeführt wurden, mit dem Ziel, pathogene Leptospira54,55 nachzuweisen und die DNA-Hybridisierung mit 32P als Werkzeug zur Identifizierung und Klassifizierung von Leptospira56 anzuwenden. Diese Sonden weisen eine hohe Spezifität auf und zeigen keine Kreuzhybridisierung mit nicht-homologen DNA aus anderen Mikroorganismen 19,51,54,55,56,57 und können sogar zwischen eng verwandten Spezies wie Leptonema57 unterscheiden. Ebenso wurde in dieser Arbeit keine Hybridisierung mit nicht-homologer DNA beobachtet. Obwohl nicht-isotopische Sonden nicht so empfindlich sind wie Isotopensonden58 oder andere Techniken43, kann erwartet werden, dass die PCR-Dot-Blot-Kombination eine bis zu zehnfache Steigerung der Sensitivität im Vergleich zu anderen PCR-basierten Techniken ermöglicht, wie beim Nachweis von Leishmaniose und dem bovinen Herpesvirus 4 (BHV4)24,26 zu sehen ist.

Auf der anderen Seite wurde der Dot-Blot-Assay zur Identifizierung von Leptospiren häufiger mit Antikörpern und in letzter Zeit mit monoklonalen Antikörpern als Alternative zur Diagnose von Menschen und Tieren in Urinproben eingesetzt 59,60,61,62. In diesen Studien wird die Probe ohne vorherige Schritte direkt auf die Membran aufgebracht, und die Antikörper richten sich gegen spezifische Leptospira-Oberflächenproteine, die mit der Pathogenese assoziiert sind. Der Mab-Dot-Blot-ELISA beispielsweise weist eine hohe Sensitivität und Spezifität auf und weist nur 1 μg bakterielles Homogenat62 nach. Die Ergebnisse des Mab-Dot-Blot-Assays können mit PCR-Assays vergleichbar sein, die typischerweise eine LOD von etwa 103 Leptospiren/ml Urin oder 9,3 ng Leptospira-Homogenat 63 aufweisen. Die Menge an genomischer DNA, die durch PCR amplifiziert werden kann, beträgt 100 Zellen (500 fg DNA)61. Diese früheren Studien verwendeten Reinkulturen oder klinische Proben ohne Anreicherungsverfahren und waren auf eine bessere Diagnose ausgerichtet. Angesichts der Tatsache, dass infizierte Ratten bis zu 107 Leptospiren/ml Urin64 ausscheiden können und Hunde zwischen 102 und 106 Leptospiren/ml Urin65 ausscheiden können, die als Kontaminationsquellen für Gewässer dienen, müssen die Umweltproben leptospiralisch angereichert werden. Die in vitro PCR-Amplifikation der Ziel-DNA vor dem Blotting ermöglicht eine Verbesserung der Verfahrenssensitivität um das bis zu Zehnfache52,55. Normalerweise wird das durch eine Endpunkt-PCR amplifizierte Produkt nicht in einer Agarose-Gelelektrophorese visualisiert; Nichtsdestotrotz wird es durch die spezifische Hybridisierung der DIG-markierten Sonde im Dot-Blot deutlich.

Während sich ein Großteil der Forschung zu Leptospiren und Leptospirose auf die Diagnose von Krankheiten konzentriert hat, ist wenig über ihre Ökologie in Gewässern und ihre Verteilung in ihnen bekannt. Die PCR-Dot-Blot-Technik erweitert den Werkzeugkasten für die Untersuchung von Leptospiren und Leptospirose und bietet den Vorteil, eine große Anzahl von Proben zu screenen und die Ergebnisse und Interpretation zu beschleunigen. PCR-Dot-Blot ist eine relativ kostengünstige, einfache und nicht-radioaktive Technik, die mehrere Sonden auf einer einzigen Membran unterbringen kann. Außerdem entfallen ausgeklügelte Geräte und komplexe Arbeitsabläufe, die in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen eine Herausforderung darstellen können.

Die Bedeutung dieser Studie liegt in ihrer zukünftigen Anwendung zur Untersuchung großer Gewässer in verschiedenen Tiefen sowie anderer ökologischer Nischen und Probentypen, einschließlich Boden, stehendes Wasser, Kot, Blut und Gewebe.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit die Anwendung der PCR-Dot-Blot-Technik demonstriert, die auf der Digoxigenin-Markierung von DNA-Sonden zur Identifizierung der drei Kladen innerhalb der Gattung Leptospira basiert. Diese Methode rationalisiert den Identifizierungsprozess, indem sie ihn auf einen einzigen Amplifikationsschritt reduziert und ermöglicht entweder drei gleichzeitige Hybridisierungen oder drei aufeinanderfolgende Hybridisierungen mit einer einzigen Membran. Die mit dieser Technik erreichten Nachweisgrenzen sind ähnlich wie bei radioaktiven Sonden53, was sie zu einem wertvollen Werkzeug für die Identifizierung von Leptospiren in Wasserproben aus natürlichen Quellen macht. Folglich bietet diese Technik eine erhöhte Empfindlichkeit und liefert genaue und konsistente Ergebnisse bei der Auswertung von Proben mit minimalen Mengen an bakterieller DNA. Es dient als alternativer Ansatz zur Untersuchung der Dynamik von Leptospiren in Gewässern und kann die Bewertung und Überwachung breiterer Umweltproben unterstützen, indem es bei der Umsetzung von Präventionsmaßnahmen gegen die Übertragung dieses Mikroorganismus hilft.

Bei Schwierigkeiten mit der Technik sollten Sie die folgenden Highlights zur Fehlerbehebung berücksichtigen: (1) Wenn die Punkte unregelmäßige Formen haben, überprüfen Sie, ob das Vakuumsystem kreuzweise sicher geschlossen ist, und wiederholen Sie dann die Übertragung. (2) Falls der Hybridisierungsschlauch während des Nachtvorgangs reißt und die Membran den Hybridisierungspuffer verliert, lesen Sie den Abschnitt "Dehybridisierungsverfahren" und starten Sie den Prozess neu. (3) Wenn keine Punkte sichtbar sind, entsorgen Sie die Membran nicht. Fahren Sie mit dem Abschnitt "De-Hybridisierungsverfahren" fort, um die Hybridisierungsschritte zu wiederholen. (3) Wenn auf dem entwickelten Röntgenfilm ungleichmäßige weiße Bereiche festgestellt werden, stellen Sie sicher, dass während des Versiegelungsprozesses des Beutels keine Luftblasen eingeschlossen werden. (5) Wenn auf dem entwickelten Röntgenfilm ungleichmäßige schwarze Bereiche beobachtet werden, bestätigen Sie, dass der CSPD mit den angefeuchteten Fingern gründlich verteilt wurde. (6) Wenn der Röntgenfilm Schatten der Punkte zeigt, ist darauf zu achten, dass der Film während der Belichtungszeit nicht bewegt wird.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Wir sind der Leptospira-Sammlung der Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie der Fakultät für Veterinärmedizin und Tierzucht der Nationalen Autonomen Universität von Mexiko zu Dank verpflichtet. Wir danken für die großzügige Spende der Referenz-Leptospira-Stämme ; Leptospira fainei Serovar Hurstbridge Stamm BUT6 und Leptospira biflexa Serovar Patoc Stamm Patoc I an Dr. Alejandro de la Peña Moctezuma. Wir danken Dr. José Antonio Ocampo Cervantes, dem CIBAC-Koordinator, und dem Personal für ihre logistische Unterstützung. EDT war Teil des Terminal-Projektprogramms für Studenten im Grundstudium der Metropolitan Autonomous University-Campus Cuajimalpa. Wir weisen auf die Biorender.com Software für die Erstellung der Abbildungen 1 und 3 bis 9 hin.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
REAGENTS
InvitrogenK182002
Gotaq Flexi DNA Polimerase (Endpoint-PCR Taq-Polymerase-Kit)PromegaM3001
Whatman Filterpapier, Klasse 1,MerkWHA1001325
Nylonmembranen, positiv geladen Rolle 30cm x 3 mRoche
Anti-Digoxigenin-AP, Fab-Fragmente Schafe Polyklonaler PrimärantikörperRoche11093274910
Medium Base EMJHDifcoS1368JAA
Leptospira Anreicherung EMJHDifcoBD 279510
BlockierungsreagenzRoche11096176001
CSPD gebrauchsfertiges Dinatrium-3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetan-3,2′-(5′-chloro) tricyclo [3.3.1.13,7] decan}8-4-yl)-phenylphosphatMerk11755633001
Desoxyribonukleinsäure aus HeringsspermaSigma AldrichD3159
Entwickler CarestreamCarestream Health IncGBX5158621
Digoxigenin-11-ddUTPRoche11363905910
Dinatriumsalz (Dihydrat)PromegaH5032
Ficoll 400Sigma AldrichF8016
Fixierer CarestreamCarestream Health IncGBX 5158605
Laurylsulfat Natriumsalz (Natriumdodecylsulfat; SDS) C12H2504SNaSigma AldrichL5750
N- Lauroylsarcosin-Natriumsalz CH3(CH2)10CON(CH3) CH2COONaSigma AldrichL-9150Es ist ein anionisches Tensid
Polivinylpyrrolidon (PVP-40)Sigma AldrichPVP40
Polyethylenglykol Sorbitanmonolaurat (Tween 20)Sigma Aldrich9005-64-5
Natriumchlorid (NaCl)Sigma Aldrich7647-14-5
Natriumdodecylsulfat (SDS)Sigma Aldrich151-21-3
Natriumhydroxid (NaOH)Sigma Aldrich1310-73-2
Natriumphosphat zweibasisch (NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-79-4
Endtransferase, rekombinantRoche3289869103
Trishydrochlorid (Tris HCl)Sigma-Aldrich1185-53-1
SSPE 20XSigma-AldrichS2015-1LEs kann wie folgt selbst hergestellt werden Ergänzende Datei 6
PrimerSigma-AldrichAuf AnfrageTabelle folgen 1
SondenSigma-AldrichAuf AnfrageTabelle folgen 1
Equipment
Nanodrop™ One SpektralphotometerThermo-ScientificND-ONE-W
Gekühlte Mikrozentrifuge Sigma 1-14K, geeignet für die Zentrifugation von 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen bei 14.000 U/minSigma-Aldrich1-14K
Desinfizierte einstellbare Pipetten, Bereich 2-20 & Mikro; L, 20-200 &Mikro; lGilsonArtikelnummer:F167360
Einweg 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (autoklaviert)AxygenMCT-150-SP
Einweg 600 & Mikro; l Mikrozentrifugenröhrchen (autoklaviert)Axygen3208
Einweg-Pipettenspitzen 1-10 & Mikro; lAxygenT-300
Einweg-Pipettenspitzen 1-200 & Mikro; lAxygenTR-222-Y
Dot-Blot-Gerät Bio-DotBIORAD1706545
Tragbarer Hergom SuctionHergom7E-A
Scientific Light Box (sichtbares Licht PH90-115V)HoeferPH90-115V
UV-VernetzerHoeferUVC-500
Thermo Hybaid PCR Express ThermocyclerHybaid
Röntgenkassette mit IP-Platte14 x 17Fuji
Purelink DNA-Extraktionskit 11417240001 EDTA, HBPX110

Referenzen

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