Methoden zur Elektroporation und Transformationsbestätigung in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Zusammenfassung

Hier stellen wir Protokolle für die Arbeit mit Limosilactobacillus reuteri DSM20016 vor, die das Wachstum, die Plasmidtransformation, die Kolonie-PCR, die fluoreszierende Reporterproteinmessung und die begrenzte Plasmid-Minivorbereitung detailliert beschreiben, sowie häufige Probleme und Fehlerbehebung. Diese Protokolle ermöglichen die Messung von Reporterproteinen in DSM20016 oder die Bestätigung durch Kolonie-PCR, wenn kein Reporter beteiligt ist.

Zusammenfassung

Lactobacillus waren eine unglaublich große, vielfältige Bakteriengattung mit 261 Arten, von denen einige kommensale Stämme waren, die das Potenzial hatten, als Chassis für synthetische biologische Unternehmungen im Magen-Darm-Trakt verwendet zu werden. Die große phänotypische und genotypische Variation, die innerhalb der Gattung beobachtet wurde, führte zu einer kürzlichen Neuklassifizierung und der Einführung von 23 neuen Gattungen.

Aufgrund der Breite der Variationen innerhalb der alten Gattungen kann es vorkommen, dass Protokolle, die in einem Mitglied nachgewiesen wurden, bei anderen Mitgliedern nicht so funktionieren, wie es angekündigt wurde. Der Mangel an zentralisierten Informationen darüber, wie bestimmte Stämme genau manipuliert werden können, hat zu einer Reihe von Ad-hoc-Ansätzen geführt, die oft von anderen Bakterienfamilien übernommen wurden. Dies kann die Sache für Forscher, die auf diesem Gebiet beginnen, erschweren, da sie möglicherweise nicht wissen, welche Informationen auf die von ihnen gewählte Sorte zutreffen und welche nicht.

In diesem Artikel wollen wir eine Reihe von Protokollen mit nachgewiesenem Erfolg zentralisieren, insbesondere in der Limosilactobacillus reuteri-Stammbezeichnung F275 (andere Sammlungsnummern: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), zusammen mit Ratschlägen zur Fehlerbehebung und häufigen Problemen, auf die man stoßen kann. Diese Protokolle sollten es einem Forscher mit wenig bis gar keiner Erfahrung in der Arbeit mit L. reuteri DSM20016 ermöglichen, ein Plasmid zu transformieren, die Transformation zu bestätigen und die Systemrückkopplung in einem Plattenleser über ein Reporterprotein zu messen.

Einleitung

Die Gattung Lactobacillus wurde historisch als grampositive, stäbchenförmige, nicht sporenbildende Anaerobier oder Mikroaerophile klassifiziert, die Zucker abbauen, um hauptsächlich Milchsäure zu produzieren¹. Diese lockeren Kriterien führten dazu, dass Lactobacillus phänotypisch und genotypisch eine äußerst vielfältige Gattung ist. Diese breite Kategorisierung führte dazu, dass die Gattung neu klassifiziert wurde und im Jahr 2020 23 neue Gattungen eingeführt wurden².

Die alte, breitere Gattung umfasste wichtige kommensale und probiotische Arten, die allgemein als sicher für ....

Protokoll

1. Herstellung von L. reuteri DSM20016 elektrokompetente Zellen

HINWEIS: Dies basiert auf einem Protokoll von Berthier et ^al.17, wobei die Zentrifugationsgeschwindigkeiten von Rattanachaikunsopon et al.¹⁸. Der Teufel

1. In einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen L. reuteri aus dem Glycerinvorrat in 6 ml deMan Rogosa Sharpe (MRS)-Brühe beimpfen. Aerob über Nacht bei 37 °C in einem statischen Inkubator inkubieren.
2. Am nächsten Morgen werden 4 ml der Nachtkultur in 200 ml MRS-Brühe (1:50 Verdünnung) geimpft.
3. In einem statischen Inkubat....

Ergebnisse

Effizienz der Transformation
L. reuteri benötigt kein dcm-/dam-nicht-methyliertes Plasmid, wie es bei anderen Lactobacillaceae^{beobachtet wurde 19,20} (siehe Abbildung 1). Die Elektroporation von L. reuteri DSM20016 mit 10 μL des 8,5 kb Plasmids pTRKH3_mCherry2 (pAMβ1 Theta-Ursprung der Replikation) sollte Transformationseffizienzen von etwa 80 koloniebildenden Einhei.......

Diskussion

Der kritischste Schritt für die Transformation von L. reuteri DSM20016 ist die Erzeugung von anaeroben Wachstumsbedingungen nach der Transformation; Kolonien, die unter aeroben Bedingungen gewonnen werden, sind nur sehr selten und wachsen im Allgemeinen nicht, wenn sie in MRS-Brühe geimpft werden. Die Beschichtung des gesamten Erholungsvolumens sollte ebenfalls geübt werden, um die Wahrscheinlichkeit des Koloniewachstums zu maximieren. Selbst mit diesen beiden kritischen Schritten ist die Transformationseffizien.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spektralphotometer Küvetten	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (gekühlte Zentrifuge)	Beckman Allegra	N/A	Nicht mehr in Produktion
AnaeroGen 2,5 L Beutel	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 Elektroporationssystem	VWR	58017-984
Zentrifugenröhrchen (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA-Gel x6 Ladefarbstoff	NEB	B7024S
Elektroporationsküvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel Elektroporation Bad/Dock	VWR	76314-748
Glycerin	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz-Institut DSMZ	DSM20016	Stammbezeichnung F275
Lysozym	BioShop	LYS702.5
Mikrozentrifugenröhrchen (1,7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep Kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP ersetzt durch konstitutiven, codonoptimierten, mCherry2 Reporter Eiweiß
MRS Bouillon (dehydriert)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR-Röhrchen	FroggaBio	STF-A120S
Persönliche Tisch-Mikrozentrifuge	Genlantis	E200100
Petrischalen	VWR	25384-088
PTC-150 Thermocycler	MJ Research	N/A	mehr in Produktion
pTRKH3_slpGFP (modifiziert)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spektralphotometer	Thermo Scientific	840-281700
Lagerung Mikrotiterplatte	Fisher Scientific	14-222-225
Saccharose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	Nicht mehr in Produktion
VWR 1500E Inkubator	VWR	N/A	mehr in Produktion

Nicht Nicht