Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Herstellung von adhärenten Zellen in großem Maßstab durch ein vollständig geschlossenes System auf der Basis von auflösbaren Mikroträgern in GMP-Qualität zu erreichen. Die Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen, HEK293T Zellen und Vero-Zellen wurde validiert und erfüllte sowohl die Quantitätsanforderungen als auch die Qualitätskriterien für die Zell- und Gentherapieindustrie.
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Methodenartikel
Großtechnische Zellproduktion auf Basis von auflösbaren porösen Mikroträgern in GMP-Qualität
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Forscher in der Zell- und Gentherapie-Industrie (CGT) stehen seit langem vor einer gewaltigen Herausforderung bei der effizienten und großflächigen Vermehrung von Zellen. Um die primären Mängel des zweidimensionalen (2D) planaren Kultivierungssystems zu beheben, haben wir auf innovative Weise eine automatisierte Plattform für die geschlossene Zellproduktion im industriellen Maßstab (ACISCP) entwickelt, die auf einem GMP-tauglichen, auflösbaren und porösen Mikroträger für die 3D-Kultur adhärenter Zellen basiert, einschließlich humaner mesenchymaler Stamm-/Stromazellen (hMSCs), HEK293T Zellen und Vero-Zellen. Um eine großflächige Expansion zu erreichen, wurde eine zweistufige Expansion mit 5 L und 15 L Rührkessel-Bioreaktoren durchgeführt, um 1,1 x10 10 hMSCs mit einer insgesamt 128-fachen Expansion innerhalb von 9 Tagen zu erhalten. Die Zellen wurden geerntet, indem die Mikroträger vollständig aufgelöst wurden, konzentriert, gewaschen und mit einem auf einer kontinuierlichen Zentrifuge basierenden Zellverarbeitungssystem formuliert und dann mit einem Zellfüllsystem aliquotiert. Im Vergleich zu planaren 2D-Kulturen gibt es keine signifikanten Unterschiede in der Qualität von hMSCs, die aus 3D-Kulturen gewonnen werden. Wir haben diese auflösbaren porösen Mikroträger auch auf andere beliebte Zelltypen im CGT-Bereich angewendet; Insbesondere wurden HEK293T Zellen und Vero-Zellen zu Spitzenzelldichten von 1,68 x 10 7 Zellen/ml bzw. 1,08 x 107 Zellen/ml kultiviert. Diese Studie liefert ein Protokoll für den Einsatz einer bioverfahrenstechnischen Plattform, die die Eigenschaften von auflösbaren Mikroträgern in GMP-Qualität und fortschrittlichen geschlossenen Geräten nutzt, um die Herstellung adhärenter Zellen im industriellen Maßstab zu erreichen.
Einleitung
Die CGT-Branche hat in den letzten zwei Jahrzehnten eine exponentielle Expansion erlebt. Es wird erwartet, dass die Entwicklung von Medikamenten der nächsten Generation zahlreiche refraktäre Erkrankungen behandeln und heilen wird1. Seit der ersten Zulassung eines CGT-Produkts, Kymriah, durch die Food and Drug Administration (FDA) im Jahr 2017 ist die CGT-bezogene Forschung und Entwicklung weltweit weiterhin rasant gewachsen, wobei die FDA einen Anstieg der aktiven Anträge auf neue Prüfpräparate für CGT auf 500 im Jahr 2018 verzeichnete2. Es wurde prognostiziert, dass die Zahl der Zulassungen von CGT-Produkten in den Vere....
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Protokoll
Die menschliche Nabelschnur wurde aus dem Pekinger Tsinghua Changgeng Krankenhaus entnommen. Alle Verfahren und Protokolle in Bezug auf die Gewinnung, Isolierung und Kultur von mesenchymalen Stammzellen der menschlichen Nabelschnur (UCMSCs) wurden mit informierter Zustimmung und mit Genehmigung der Ethikkommission des Beijing Tsinghua Changgeng Hospital (Aktenzeichen 22035-4-02) durchgeführt, und die Verfahren und Protokolle entsprachen der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen oder vergleichbaren ethischen Standards.
1. Monolayer-Kultur von hMSCs, HEK293T Zellen und Vero-Zellen
- Isolierun....
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Ergebnisse
Bei der ACISCP-Plattform handelt es sich um ein vollständig geschlossenes System, das eine Reihe von Rührkessel-Bioreaktoren für die Scale-up-Expansion, ein Zellverarbeitungssystem für die automatisierte Zellernte und -formulierung sowie ein Zellfüllsystem verwendet (Abbildung 1). Adhärente Zellen heften sich an die porösen Mikrocarrier, die in den Bioreaktor dispergiert werden können, wodurch die suspendierte Kultivierung adhärenter Zellen erreicht wird.
Dem besc.......
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Diskussion
Sowohl bei der Immuntherapie als auch bei der Stammzelltherapie werden lebende Zellen als Medikamente verwendet. Ihre Endprodukte sollten jedoch nicht auf die gleiche Weise gereinigt oder sterilisiert werden wie kleine Moleküle oder Viren. Daher sollte das Prinzip von Quality by Design (QbD) immer im Hinterkopf behalten und praktisch auf den Prozess der chemischen Herstellung und Kontrolle (CMC) während der Zellproduktion angewendet werden23. Ein vollständig geschlossenes Zellkultursystem sowie ei.......
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Offenlegungen
Y.D. ist wissenschaftlicher Berater, und H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. und X.Y. sind Mitarbeiter von Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. Die anderen Autoren haben kein kommerzielles, proprietäres oder finanzielles Interesse an den in diesem Artikel beschriebenen Produkten oder Unternehmen. Alle anderen Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation for Distinguished Young Scholars (82125018) finanziell unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsin EDTA | BasalMedia | S310JV | Wird für die 2D-Zellernte verwendet. |
| 3D FloTrix Digest | CytoNiche Biotech | R001-500 | Hierbei handelt es sich um ein Reagenz, das spezifisch 3D TableTrix Microcarrier auflöst. |
| 3D FloTrix MSC Serum Free | Medium CytoNiche Biotech | RMZ112 | Dies ist ein serumfreies, tierversuchsfreies Medium für die Expansion und Erhaltung mesenchymaler Stammzellen in 2D-Planarkulturen sowie in 3D-Kulturen auf 3D-TableTrix-Mikrocarriern. |
| 3D FloTrix Einweg-Filtrationsmodul | CytoNiche Biotech | R020-00-10 | Dieses Modul enthält 0,22 μ M Kapselfilter zur Filtration von Kulturmedium und Aufschlusslösung. |
| 3D FloTrix Einweg-Aufbewahrungstasche (10 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-03 | Wird als Futterbeutel für 5 L Bioreaktor verwendet. |
| 3D FloTrix Einweg-Aufbewahrungstasche (3 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-01 | Wird als Zellaussaat- oder Transferbeutel verwendet. |
| 3D FloTrix Einweg-Aufbewahrungstasche (50 L) | CytoNiche Biotech | R020-00-04 | Wird als Futterbeutel für 15 L Bioreaktor verwendet. |
| 3D FloTrix vivaPACK Einweg-Füllung & Finish Verbrauchsmaterial Kit | CytoNiche Biotech | PACK-01-01 | Dies ist ein Standard-Kit, das an das 3D-vivaPACK-Füll- und Finish-System angepasst ist. |
| 3D FloTrix vivaPACK Füll- und Finish-System für Zellen | CytoNiche Biotech | vivaPACK | Dieses System ist ein geschlossenes Liquid-Handling-Gerät mit automatisierten Misch- und Gasabsaugfunktionen. Zellen, die in Kryokonservierungspuffer resuspendiert sind, können schnell und gleichmäßig in 20 Beutel pro Charge aliquotiert werden. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS Zellverarbeitungssystem | CytoNiche Biotech | vivaPREP PLUS | Bei diesem System handelt es sich um ein auf Zentrifuge basierendes Gerät mit kontinuierlichem Durchfluss. Zellen können unter vollständig geschlossenen Verfahren konzentriert, gewaschen und resuspendiert werden. |
| 3D FloTrix vivaPREP PLUS Einweg-Zellverarbeitungskit | CytoNiche Biotech | PREP-PLUS-00 | Dies ist ein Standard-Kit, das für die 3D vivaPREP PLUS-Zellverarbeitung geeignet ist. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Bioreaktor 15 L | CytoNiche Biotech | FTVS15 | Dieses Bioreaktorprodukt besteht aus einem Controller, einem 15-Liter-Rührbehälter aus Glas und Assessorien. Eine spezielle Perfusionssonde steht zur Verfügung. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Bioreaktor 5 L | CytoNiche Biotech | FTVS05 | Dieses Bioreaktorprodukt besteht aus einem Controller, einem 5-Liter-Glasrührbehälter und Assessorien. Eine spezielle Perfusionssonde steht zur Verfügung. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Verbrauchsmaterial mit geschlossenem System (10/15 L) | CytoNiche Biotech | R020-10-10 | Hierbei handelt es sich um ein Standard-Schlauchset, das an den 3D vivaSPIN Bioreaktor 15 L angepasst ist und Probenahmebeutel enthält. |
| 3D FloTrix vivaSPIN Verbrauchsmaterialpackung mit geschlossenem System (2/5 L) | CytoNiche Biotech | R020-05-10 | Hierbei handelt es sich um ein Standard-Schlauchset, das an den 3D-vivaSPIN-Bioreaktor 5 L angepasst ist und Probenahmebeutel enthält. |
| 3D TableTrix Microcarrier G02 | CytoNiche Biotech | G02-10-10g | Diese porösen und abbaubaren Microcarrier eignen sich für die HEK293T Zellkultur. Sie werden vorsterilisiert in 10 g/Flasche mit C-Flex-Schläuchen zum Anschweißen an Schläuche an Bioreaktoren geliefert. |
| 3D TableTrix Microcarrier V01 | CytoNiche Biotech | V01-100-10g | Diese porösen und abbaubaren Microcarrier eignen sich für adhärente Zellkulturen, sie werden als unsterilisierte Microcarrier geliefert, die vor der Verwendung in PBS autoklaviert werden müssen. Sie eignen sich besonders für die Herstellung von Impfstoffen. |
| 3D TableTrix Microcarrier W01 | CytoNiche Biotech | W01-10-10g (Einwegverpackung); W01-200 (Tabletten) | Diese porösen und abbaubaren Microcarrier eignen sich für adhärente Zellkulturen, insbesondere für Zellen, die als Endprodukte geerntet werden müssen. Sie werden vorsterilisiert in 10 g/Flasche mit C-Flex-Schläuchen zum Anschweißen an Schläuche an Bioreaktoren geliefert. Das Produkt hat vom CDE 2 Qualifikationen für pharmazeutische Hilfsstoffe mit den Registrierungsnummern [F20200000496; F20210000003]. Es hat auch die DMF-Qualifizierung für pharmazeutische Hilfsstoffe von der FDA erhalten, mit der Registrierungsnummer [DMF:35481] |
| APC Anti-Human-CD45-Antikörper | BioLegend | 368512 | Wird in der Durchflusszytometrie zur MSC-Identitätsbewertung verwendet |
| Calcein-AM/PI Doppelfärbekit | Dojindo | C542 | Das Calcein-AM/PI Doppelfärbekit wird für die gleichzeitige Fluoreszenzfärbung von lebensfähigen und toten Zellen verwendet. Dieses Kit enthält Calcein-AM- und Propidiumiodid (PI)-Lösungen, die lebensfähige bzw. tote Zellen färben. |
| Kappe für EZ Top Behälterverschlüsse für NALGENE-Behälter (500mL) | Saint-Gobain | CAP-38 | Marken und Katalognummern sind nur zum Beispiel, ähnliche Produkte sind von verschiedenen Anbietern erhältlich und solange sie die gleiche Funktionalität haben, können Artikel durch andere Marken ersetzt werden. |
| C-Flex Schläuche, Formulierung 374 (0,25 Zoll x 0,44 Zoll) | Saint-Gobain | 374-250-3 | Wird zum Schweißen und Trennen von Rohren verwendet. |
| CryoMACS Gefrierbeutel 50 | Miltenyi Biotec | 200-074-400 | Zur Erweiterung des 3D FloTrix vivaPACK Einweg-Füll- & Finish Verbrauchsmaterial-Kit. |
| Dimethylsulfat (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | Wird zur Herstellung von Kryokonservierungslösung verwendet. |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | BasalMedia | L120KJ | Wird für die Kultivierung von HEK293T- und Vero-Zellen verwendet. |
| DURAN Original GL 45 Laborflasche (2 L) | DWK Life Sciences | 218016357 | Wird für die Abfallsammlung aus dem 5 L Bioreaktor verwendet. |
| DURAN Original GL 45 Laborflasche (5 L) | DWK life sciences | 218017353 | Wird für die Abfallsammlung aus dem 15 L Bioreaktor verwendet. |
| DURAN Original GL 45 Laborflasche (500 mL) | DWK life sciences | 218014459 | Wird für eine Zusatzflasche mit 0,1 M NaOH verwendet. |
| EZ Top Behälterverschlüsse für NALGENE-Behälter (500mL) | Saint-Gobain | EZ500 ML-38-2 | Marken und Katalognummern sind nur zum Beispiel, ähnliche Produkte sind von verschiedenen Anbietern erhältlich und solange sie die gleiche Funktionalität haben, können Artikel durch andere Marken ersetzt werden. |
| Fötales Rinderserum (FBS) von höchster Qualität | Wisent | 086-150 | Wird für die Kultivierung von HEK293T Zellen verwendet. |
| FITC Anti-Human-CD14-Antikörper | BioLegend 301804 | Wird in der Durchflusszytometrie zur Bewertung der MSC-Identität verwendet. | |
| FITC Anti-Human-CD34-Antikörper | BioLegend | 343504 | Wird in der Durchflusszytometrie zur Bewertung der MSC-Identität verwendet. |
| FITC Anti-Human-CD90 (Thy1)-Antikörper | BioLegend 328108 | Wird in der Durchflusszytometrie zur Bewertung der MSC-Identität verwendet. | |
| Durchflusszytometrie | Beckman Coulter | CytoFLEX | Wird zur Beurteilung der Zellidentität verwendet. |
| Fluoreszenz-Zellanalysator | Alit life science | Countstar Rigel S2 | Wird für die Zellzählung verwendet. Die Zellviabilität kann durch Färben mit AO/PI-Farbstoffen berechnet werden. |
| GL 45 Multiport-Steckverbinder mit Schraubverschluss und 2 Anschlüssen | DWK Life Sciences | 292632806 | Marken und Katalognummern sind nur zum Beispiel, ähnliche Produkte sind von verschiedenen Anbietern erhältlich und solange sie die gleiche Funktionalität haben, können Artikel durch andere Marken ersetzt werden. |
| Glukosemessgerät | Sinocare | 6243578 | Wird zum Nachweis der Glukosekonzentration im Zellkulturmedium und Überstand verwendet. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), mit Calcium und Magnesium | Gibco | 14025092 | Wird zur Herstellung von Aufschlusslösung verwendet. |
| Humanalbumin 20% Behring (HSA) | CSL Behring | N/A | Wird zur Herstellung von Waschpuffer verwendet. |
| Inverses Fluoreszenzmikroskop | OLYMBUS | CKX53SF | Wird für die Beobachtung und Bildgebung im Lichtfeld- und Fluoreszenzbereich verwendet. |
| Nalgene Messzylinder (500 mL) | Thermo Scientific | 3662-0500PK | Wird zur Kalibrierung der Liquid-Handling-Volumengeschwindigkeit von Schlauchpumpen verwendet. |
| Neugeborenes Kälberserum (NBS) superfein | MINHAI BIO | SC101.02 | Wird zur Kultivierung von Vero-Zellen verwendet. |
| OriCell humane mesenchymale Stammzellen zur adipogenen Differenzierung und Charakterisierung | Cyagen | HUXUC-90031 | Wird für die Tri-Lineage-Differenzierung von hUCMSCs verwendet. |
| OriCell chondrogene Differenzierungs- und Charakterisierungskit für humane mesenchymale Stammzellen | Cyagen | HUXUC-90041 | Wird für die Tri-Linien-Differenzierung von hUCMSCs verwendet. |
| OriCell Kit zur osteogenen Differenzierung und Charakterisierung von humanen mesenchymalen Stammzellen | Cyagen | HUXUC-90021 | Wird für die Differenzierung von hUCMSCs in drei Linien verwendet. |
| PE Anti-Human-CD105-Antikörper | BioLegend 800504 | Wird in der Durchflusszytometrie zur Bewertung der MSC-Identität verwendet. | |
| PE-Anti-Human-CD19-Antikörper | BioLegend 302208 | Wird in der Durchflusszytometrie zur Bewertung der MSC-Identität verwendet. | |
| PE Anti-Human-CD73 (Ecto-5'-Nukleotidase) Antikörper | BioLegend | 344004 | Wird in der Durchflusszytometrie zur Bewertung der MSC-Identität verwendet. |
| PE Anti-Human-HLA-DR-Antikörper | BioLegend 307605 | Wird in der Durchflusszytometrie zur Bewertung der MSC-Identität verwendet. | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Wisent | 311-010-CL | Wird zum Autoklavieren von Glasgefäßen und V01-Mikrocarriern sowie zum Ersatz von Kulturmedium verwendet. |
| Sani-Tech Platinum Cured Sanitärsilikonschlauch (0,13 Zoll x 0,25 Zoll) | Saint-Gobain | ULTRA-C-125-2F | Wird für den Lösungstransfer verwendet, der von Schlauchpumpen angetrieben wird. |
| Sterile Kochsalzlösung | Hopebiol | HBPP008-500 | Wird zur Vorbereitung von Waschpuffer verwendet. |
| Trypzym Rekombinantes Trypsin | BasalMedia | S342JV | Dieses Reagenz wird für den Bead-to-Bead-Transfer von HEK293T- und Vero-Zellen verwendet. |
| Tube Sealer | Yingqi Biotech | Tube Sealer I | Dieser Sealer ist sowohl mit C-Flex-Schläuchen als auch mit PVC-Schläuchen kompatibel. |
| Rohrschweißgerät für PVC-Schläuche | Chu Biotech | Rohrschweißgerät Micro I | Wird zum Schweißen von PVC-Schläuchen verwendet. |
| Rohrschweißgerät für TPE-Schläuche | Yingqi Biotech | Rohrschweißgerät I-V2 | Wird zum Schweißen von TPE-Schläuchen verwendet. |
| ViaStain AO / PI Viabilitätsfärbungen | Nexcelom | CS2-0106-25mL | Dual-Fluoreszenz-Viabilität unter Verwendung von Acridinorange (AO) und Propidiumiodid (PI) ist die empfohlene Methode für die genaue Viabilitätsanalyse von Primärzellen, wie z. B. PBMCs, und Stammzellen in Proben, die Trümmer enthalten. |
Referenzen
- Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
- Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R.
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Nachdrucke und Genehmigungen
