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Methodenartikel

Stabilisiertes Fenster für die intravitale Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse

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DOI:

10.3791/65498

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6. Oktober 2023

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1Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Integrated Imaging Program for Cancer Research, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 5Breast Center, Peking University People's Hospital, 6Department of Microbiology & Immunology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 7Montefiore Einstein Cancer Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 8Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 9Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 10Department of Cell Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll für die chirurgische Implantation eines stabilisierten optischen Bleibefensters für die subzellulär aufgelöste Bildgebung der murinen Bauchspeicheldrüse, das serielle und longitudinale Studien der gesunden und erkrankten Bauchspeicheldrüse ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Physiologie und Pathophysiologie der Bauchspeicheldrüse ist komplex. Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse, wie Pankreatitis und Pankreas-Adenokarzinom (PDAC), weisen eine hohe Morbidität und Mortalität auf. Die Intravital-Bildgebung (IVI) ist eine leistungsstarke Technik, die die hochauflösende Bildgebung von Geweben sowohl im gesunden als auch im erkrankten Zustand ermöglicht und eine Echtzeitbeobachtung der Zelldynamik ermöglicht. Die IVI der murinen Bauchspeicheldrüse stellt aufgrund der tiefen viszeralen und nachgiebigen Natur des Organs eine große Herausforderung dar, was es sehr anfällig für Schäden und Bewegungsartefakte macht.

Hier wird der Prozess der Implantation des Stabilisierten Window für die Intravitale Bildgebung des murinen P-Ankreas (SWIP) beschrieben. Das SWIP ermöglicht die IVI der murinen Bauchspeicheldrüse in normalen gesunden Zuständen, während der Transformation von der gesunden Bauchspeicheldrüse zu einer akuten Pankreatitis, die durch Cerulein induziert wird, und in malignen Zuständen wie Pankreastumoren. In Verbindung mit genetisch markierten Zellen oder der Verabreichung von Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht das SWIP die Messung der einzelligen und subzellulären Dynamik (einschließlich Einzelzell- und kollektiver Migration) sowie die serielle Bildgebung derselben interessierenden Region über mehrere Tage.

Die Fähigkeit, die Migration von Tumorzellen zu erfassen, ist von besonderer Bedeutung, da die Hauptursache für die krebsbedingte Mortalität bei PDAC die überwältigende Metastasierungslast ist. Das Verständnis der physiologischen Dynamik der Metastasierung bei PDAC ist ein kritischer ungedeckter Bedarf und entscheidend für die Verbesserung der Patientenprognose. Insgesamt bietet das SWIP eine verbesserte Bildgebungsstabilität und erweitert die Anwendung von IVI bei gesunden Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse und der bösartigen Bauchspeicheldrüse.

Einleitung

Gutartige und bösartige Erkrankungen der Bauchspeicheldrüse sind potenziell lebensbedrohlich und weisen erhebliche Lücken im Verständnis ihrer Pathophysiologie auf. Pankreatitis – eine Entzündung der Bauchspeicheldrüse – ist die dritthäufigste Ursache für Krankenhauseinweisungen und Wiedereinweisungen im Zusammenhang mit Magen-Darm-Erkrankungen in den USA und ist mit erheblicher Morbidität, Mortalität und sozioökonomischer Belastung verbunden1. Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC), das als dritthäufigste krebsbedingte Todesursache eingestuft wird 2, ist für die meisten Pankreasmalignomeverantwortlich 3 und weist eine schlechte 5-Jahres-Überlebensrate von nur 11 %2 auf2. Die Hauptursache für krebsbedingte Mortalität bei PDAC ist eine überwältigende metastasierende Belastung. Leider weisen die meisten Patienten eine metastasierende Erkrankung auf. Daher ist das Verständnis der Dynamik der Metastasierung bei PDAC ein kritischer ungedeckter Bedarf auf dem Gebiet der Krebsforschung.

Die Mechanismen, die der Entzündung und der Metastasierung der Bauchspeicheldrüse zugrunde liegen, sind nur unzureichend verstanden. Ein wesentlicher Faktor für diese Wissenslücke ist die Unfähigkeit, die zelluläre Dynamik der Bauchspeicheldrüse in vivo zu beobachten. Die direkte Beobachtung dieser zellulären Dynamik verspricht, wichtige Ziele zu enthüllen, um die Diagnose und Behandlung von Menschen mit Bauchspeicheldrüsenerkrankungen zu verbessern und zu verbessern.

Intravital Imaging (IVI) ist eine Mikroskopietechnik, die es Forschern ermöglicht, biologische Prozesse in lebenden Tieren in Echtzeit zu visualisieren und zu untersuchen. IVI ermöglicht eine hochauflösende, direkte Visualisierung der intrazellulären und mikroumgebungsbezogenen Dynamik in vivo und in der nativen Umgebung des jeweiligen biologischen Prozesses. Daher ermöglicht die IVI die In-vivo-Beobachtung gesunder und pathologischer Prozesse.

Moderne Ganzkörper-Bildgebungsverfahren wie MRT, PET und CT bieten hervorragende Ansichten ganzer Organe und können Pathologien aufdecken, noch bevor klinische Symptome auftreten4. Sie sind jedoch nicht in der Lage, eine Einzelzellauflösung zu erreichen oder die frühesten Stadien der Krankheit – Pankreatitis oder Malignität – aufzudecken.

Frühere Forschungen haben die IVI mit Einzelzellauflösung verwendet, um gutartige und bösartige Erkrankungen der Haut5,6, der Brust7, der Lunge8, der Leber9, des Gehirns10 und der Bauchspeicheldrüsentumoren 11 zu beobachten, was zu Einblicken in die Mechanismen des Krankheitsverlaufs führte12. Die murine Bauchspeicheldrüse stellt jedoch erhebliche Hindernisse für das Erreichen einer Einzelzellauflösung mit IVI dar, vor allem aufgrund ihrer tiefen viszeralen Lage und ihrer hohen Compliance. Darüber hinaus ist es ein verzweigtes, diffus verteiltes Organ innerhalb des Mesenteriums, das mit der Milz, dem Dünndarm und dem Magen verbunden ist, was den Zugang erschwert. Das Gewebe reagiert auch sehr empfindlich auf Bewegungen, die durch angrenzende Peristaltik und Atmung verursacht werden. Die Minimierung der Bewegung der Bauchspeicheldrüse ist für die Einzelzellauflösung von entscheidender Bedeutung, da Bewegungsartefakte von nur wenigen Mikrometern die Bilder verwischen und verzerren können, was es unmöglich macht, die Dynamik einzelner Zellen zu verfolgen13.

Um eine IVI durchführen zu können, muss ein abdominelles Bildgebungsfenster (AIW) chirurgisch implantiert werden 9,11. Um die AIW operativ zu implantieren, wird ein Fensterrahmen aus Metall in die Bauchdecke eingenäht. Anschließend wird das gewünschte Organ mit Cyanacrylat-Kleber am Rahmen befestigt. Während dies für einige starre innere Organe (z. B. Leber, Milz, starre Tumore) ausreichend ist, werden Versuche, die gesunde murine Bauchspeicheldrüse abzubilden, durch suboptimale laterale und axiale Stabilität aufgrund der nachgiebigen Textur des Gewebes und der komplexen Architektur beeinträchtigt14. Um dieser Einschränkung zu begegnen, entwickelten Park et al.14 ein Bildgebungsfenster, das speziell für die gesunde Bauchspeicheldrüse entwickelt wurde. Dieses Pankreas-Bildgebungsfenster (PIW) minimiert den Einfluss der Darmbewegung und der Atmung, indem es ein horizontales Metallregal in den Fensterrahmen, direkt unter dem Deckglas, integriert, das Gewebe stabilisiert und seinen Kontakt mit dem Deckglas aufrechterhält. Während das PIW eine erhöhte laterale Stabilität bietet, haben wir festgestellt, dass dieses Fenster immer noch eine axiale Drift aufweist und zusätzlich die Bildgebung großer solider Tumore aufgrund des schmalen Spalts zwischen dem Metallregal und dem Deckglas15 verhindert.

Um diesen Einschränkungen zu begegnen, haben wir das Stabilisierte Window für die intravitaleBildgebung des murinen P-Ankras (SWIP) entwickelt, ein implantierbares Bildgebungsfenster, das in der Lage ist, eine stabile Langzeitbildgebung sowohl der gesunden als auch der erkrankten Bauchspeicheldrüse zu erreichen (Abbildung 1)15. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll für den chirurgischen Eingriff zur Implantation des SWIP zur Verfügung. Obwohl das primäre Ziel darin bestand, die dynamischen Mechanismen der Metastasierung zu untersuchen, kann diese Methode auch verwendet werden, um verschiedene Aspekte der Biologie und Pathologie der Bauchspeicheldrüse zu untersuchen.

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Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften für die Verwendung von Wirbeltieren durchgeführt, einschließlich der vorherigen Genehmigung durch das Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Passivierung von Fenstern

HINWEIS: Die Passivierung von Edelstahl reinigt das Metall von Verunreinigungen und erzeugt eine dünne Oxidschicht, die die Biokompatibilität des Metalls mit Weichgeweben erheblich erhöht, sogar über die von Titan16 hinaus.

  1. Beginnen Sie den Passivierungsprozess, indem Sie die optischen Fensterrahmen mit einer 1%igen (w/v) enzymatisch aktiven Reinigungsmittellösung waschen.
  2. Tauchen Sie die Rahmen in eine 5%ige (w/v) Natronlauge bei 70 °C für 30 Minuten in ein Glasgefäß.
  3. Nehmen Sie die Rahmen heraus und spülen Sie sie mit deionisiertem Wasser ab.
  4. Tauchen Sie die Rahmen in eine 7%ige Zitronensäurelösung bei 55 °C für 10 Minuten in einem neuen Glasgefäß.
  5. Entfernen Sie die Rahmen und spülen Sie sie erneut mit deionisiertem Wasser ab.
  6. Wiederholen Sie Schritt 1.2 und spülen Sie zum Schluss die Fensterrahmen ein letztes Mal mit entionisiertem Wasser ab.

2. Vorbereitung auf die Tumorimplantation oder Fensterchirurgie

HINWEIS: Für Untersuchungen von Pankreastumoren müssen Tumorzellen implantiert werden und zu manifesten Tumoren heranwachsen können. Um die Tumorzellen in vivo sichtbar zu machen, empfiehlt es sich, Zellen zu verwenden, die genetisch verändert wurden, um fluoreszierende Proteine wie Dendra2 zu exprimieren. Die Verwendung von fluoreszierenden Proteinmarkierungen, die hell sind, mindert potenzielle Probleme mit der Autofluoreszenz des Gewebes. Andere potentielle fluoreszierende Proteine, Farbstoffe und genetisch kodierte fluoreszierende Mausmodelle, die verwendet werden könnten, wurden an anderer Stelle diskutiert17,18. Um eine Kontamination des Operationsfeldes zu vermeiden, führen Sie den chirurgischen Eingriff in einer Haube oder einem Laminar-Flow-Schrank durch und stellen Sie sicher, dass unterschiedliche Bereiche für die Vorbereitung, Operation und Genesung verwendet werden.

  1. Sterilisieren Sie vor der Operation alle chirurgischen Instrumente in einem Autoklaven und verwenden Sie bei Bedarf einen Heißperlensterilisator für nachfolgende Eingriffe. Stellen Sie sicher, dass die Operation nur mit Tipps durchgeführt wird.
  2. Schalten Sie das beheizte OP-Pad und den Perlensterilisator ein und warten Sie, bis die entsprechende Betriebstemperatur erreicht ist. Die Temperatur des Heizkissens sollte mit einem Oberflächenthermometer überwacht werden, um mögliche Verbrennungen zu vermeiden. Legen Sie ein steriles Tuch über das Heizkissen, wenn die Temperatur nicht ausreichend kontrolliert werden kann.
    HINWEIS: Die Körpertemperatur bei kurzen Eingriffen (≤20 Minuten), wie z. B. Tumor- und Fensterimplantationen, wird bei Verwendung eines beheizten chirurgischen Pads minimal beeinflusst. Längere Anästhesiephasen, wie z. B. bei längeren Zeitrafferaufnahmen, erfordern jedoch, dass die Maus in eine beheizte Kammer gebracht wird, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
  3. Betäuben Sie die Maus mit 5% Isofluran in einer Anästhesiekammer.
  4. Kritischer Schritt: Senken Sie die Anästhesie auf 2%, sobald die Maus bewusstlos ist. Überwachen Sie sorgfältig den Anästhesiegrad und die Vitalwerte der Maus (z. B. mit einem Pulsoximeter)19.
  5. Geben Sie einen kleinen Tropfen Augengleitmittel auf jedes Auge der Maus, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
  6. Tragen Sie vor der Operation die Enthaarungscreme großzügig auf den linken Oberbauch auf, um die Haare zu entfernen. Nach 20 s mit angefeuchtetem Seidenpapier die Haare und die Enthaarungscreme fest abwischen. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, bis alle Haare aus dem Operationsbereich entfernt sind.
  7. Injizieren Sie 10 μl Buprenorphin (0,1 mg/kg), verdünnt in 90 μl PBS, subkutan, um eine präoperative Analgesie zu gewährleisten.

3. Implantation von Bauchspeicheldrüsentumoren

  1. Präparation von Aliquoten von Tumorzellen in der gewünschten Konzentration (basierend auf der Verdopplungszeit der Tumorzellen). Geben Sie die Zellsuspension in eine Insulinspritze und lassen Sie sie auf Eis liegen. Um dieses Protokoll zu befolgen, verwenden Sie 106 syngene KPC-Tumorzellen 20, die in maximal 50 μl PBS suspendiert sind, gemäß dem orthotopen Injektionsprotokoll, das von Erstad et al. übernommenwurde.21
    HINWEIS: Diese Zelllinie, die in dieser Konzentration injiziert wurde, produzierte routinemäßig nach 10-14 Tagen tastbare oder entsprechend große Tumore. Subklone dieser Zelllinie und anderer Pankreas-Zelllinien müssten auf geeignete Konzentrationen und Zeiträume untersucht werden, um Tumore in angemessener Größe zu erzeugen.
  2. Waschen Sie sich die Hände mit antiseptischer Seife.
  3. Ziehen Sie vor jeder neuen Operation neue sterile Handschuhe an.
  4. Übertragen Sie die Maus auf die sterile OP-Haube und legen Sie sie in eine teilweise rechte laterale Dekubitusposition.
  5. Befestigen Sie die Gliedmaßen mit Klebeband.
    HINWEIS: Die richtige Verwendung der Instrumente ist während des gesamten Verfahrens wichtig. Beispiele für das Halten einer Pinzette, einer Castroviejo-Schere und des Vakuum-Aufnahmewerkzeugs sind in Abbildung 2A-C dargestellt.
  6. Sterilisieren Sie den Bauch mit einem Antiseptikum (Abbildung 2D).
  7. Stellen Sie sicher, dass das Tier vollständig betäubt ist, indem Sie einen Zehenkneiftest durchführen.
  8. Führen Sie mit einer Zange und einer Castroviejo-Schere einen 10-15 mm langen linken subkostalen Schnitt in die Haut ein (Abbildung 2E).
  9. Kontrollieren Sie die Hämostase mit Wattestäbchen oder einem Kauterstift, wenn dies als notwendig erachtet wird.
  10. Den darunter liegenden Muskel vorsichtig mit einer Pinzette und einer Castroviejo-Schere durchtrennen, um in das Bauchfell einzudringen (Abbildung 2F).
  11. Verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um die Bauchspeicheldrüse und die Milz atraumatisch zu externalisieren.
  12. Spreizen Sie die Bauchspeicheldrüse, so dass keine Falten entstehen (Abbildung 2G).
  13. Identifizieren Sie die gewünschte Tumorinjektionsstelle im Körper oder am Schwanz der Bauchspeicheldrüse (weg von den Blutgefäßen).
  14. Kritischer Schritt: Nach sorgfältiger Positionierung der Bauchspeicheldrüse das Gewebe mit einer Pinzette spannen und die Spitze der Insulinspritze mit der Fase nach oben bis zu einer Tiefe von 4-5 mm in die gewünschte Stelle der Bauchspeicheldrüse einführen (Abbildung 2H).
  15. Injizieren Sie langsam die Tumorzelllösung. Suchen Sie nach einer kleinen Blase, die eine erfolgreiche Injektion bestätigt (Abbildung 2I).
  16. Führen Sie die Bauchspeicheldrüse vorsichtig in den Bauchraum zurück, ohne die Injektionsblase der Tumorzellen zu stören (Abbildung 2J).
  17. Bei resorbierbaren 5-0-Polydioxanon-Nähten wird zuerst die Muskelschicht und dann die Haut mit unterbrochenen Nähten verschlossen (Abbildung 2K-N).
  18. Decken Sie den Einschnitt mit Cyanacrylatkleber ab (Abbildung 2O) und legen Sie die Maus dann zur Erholung in einen sauberen Käfig unter einer Heizlampe. Verabreichen Sie Antibiotika im Trinkwasser, um Infektionen zu verhindern. Überwachen Sie die Mäuse und lassen Sie sie sich vollständig von der Operation erholen.
    HINWEIS: Antibiotika werden gemäß den Anforderungen des IACUC-Protokolls verabreicht. Alle Tiere werden einzeln untergebracht.
  19. Lassen Sie den Tumor 10-14 Tage lang wachsen, bis er durch die Bauchdecke tastbar ist.

4. Pankreasfenster-Chirurgie

  1. Wenn die Tiere für die Bildgebung bereit sind, beginnen Sie mit der Fensterimplantation. Waschen Sie sich zunächst die Hände mit antiseptischer Seife.
  2. Ziehen Sie vor jeder neuen Operation frische, sterile Handschuhe an.
  3. Legen Sie die Maus auf dem beheizten chirurgischen Ständer in die rechte seitliche Dekubitusposition, um den linken Bauch freizulegen.
  4. Verankern Sie die vorderen und hinteren Gliedmaßen der Maus mit Papierklebeband kranial und kaudal an der erhitzten Operationsstufe. Stellen Sie sicher, dass die Milz (unter der Haut) innerhalb des Operationsfeldes sichtbar ist (Abbildung 3A).
  5. Um die Sterilität zu wahren, packen Sie alle chirurgischen Instrumente in der Haube aus.
  6. Desinfizieren Sie die Operationsstelle, indem Sie die Haut der Maus mit einem großzügigen Antiseptikum abtupfen.
  7. Stellen Sie sicher, dass das Tier vollständig betäubt ist, indem Sie einen Zehenkneiftest durchführen.
  8. Kritischer Schritt: Heben Sie die Haut des linken oberen Quadranten des Bauches mit einer Zange an und machen Sie einen ~10 mm kreisförmigen Schnitt in Haut und Muskulatur mit einer Castroviejo-Schere (Abbildung 3B,C).
  9. Kontrollieren Sie die Blutung und halten Sie die Hämostase bei Bedarf mit Wattestäbchen oder dem Kauterstift aufrecht.
  10. Lokalisieren Sie die Bauchspeicheldrüse, die mit der Milz verbunden ist, und identifizieren Sie die Richtung, in der die Bauchspeicheldrüse innerhalb des Einschnitts liegt, um zu entscheiden, wo der unterstützende Kreuzstich platziert werden soll.
  11. Platzieren Sie mit 5-0 Seidennaht den ersten Stich an der gewünschten Stelle in der Muskelschicht. Binde dieses Ende mit 3-5 Knoten zusammen. (Abbildung 3D,E)
  12. Fahren Sie mit dem Nähen direkt über den Schnitt fort. Schneiden Sie ab und lassen Sie einen Schwanz von ~5 cm (Abbildung 3F).
  13. Wiederholen Sie die Schritte 4.11 und 4.12 senkrecht zur ersten Masche (Bild 3G,H).
  14. Kritischer Schritt: Heben Sie die Bauchspeicheldrüse vorsichtig an und positionieren Sie sie über dem Kreuzstich (Abbildung 3I,J). Achten Sie darauf, die Bauchspeicheldrüse während der Manipulation nicht zu beschädigen.
  15. Kritischer Schritt: Führen Sie mit der 5-0-Seidennaht einen Handtaschenstich ~1 mm vom Loch entfernt in Umfangsrichtung durch, wobei die Haut- und Muskelschicht miteinander verflochten werden (Abbildung 3K).
  16. Positionieren Sie den Fensterrahmen so, dass die Ränder des kreisförmigen Einschnitts in der Nut des Fensters sitzen (Abbildung 3L).
  17. Befestigen Sie das implantierte Fenster, indem Sie die 5-0-Seide fest festbinden.
  18. Geben Sie 100 μl flüssigen Cyanacrylat-Klebstoff in die 1-ml-Spritze.
  19. Trocknen Sie das Gewebe, indem Sie ~10 s lang einen sanften Druckluftstrom anwenden.
  20. Fassen Sie den Fensterrahmen mit einer Pinzette an der Außenkante fest und heben Sie ihn vorsichtig an, um die Trennung der Bauchspeicheldrüse von der Unterseite des Fensterrahmens zu gewährleisten.
  21. Kritischer Schritt: Tragen Sie eine dünne Schicht flüssigen Cyanacrylat-Klebstoffs entlang der Aussparung des Fensters auf (Abbildung 3M). Achten Sie darauf, dass der Klebstoff nicht auf das Bauchspeicheldrüsengewebe gelangt.
  22. Heben Sie das 5-mm-Deckglas mit Hilfe von Vakuum-Tonabnehmern an.
  23. Legen Sie das Deckglas vorsichtig in die Aussparung in der Mitte des optischen Fensterrahmens. Mit leichtem Druck halten, damit der Cyanacrylat-Kleber aushärten kann (~25 s).
  24. Trennen Sie das Deckglas mit einer Pinzette von den Vakuumaufnehmern.
  25. Ziehen Sie die Kreuzstichnähte fest, um die Bauchspeicheldrüse fest am Deckglas zu befestigen (Abbildung 3N,O). Hinweis: Ziehen Sie den Kreuzstich nicht zu fest an, da dies zu Schäden und Ischämie an der Bauchspeicheldrüse führen kann.
  26. Schneiden Sie die Enden der Naht ab.
  27. Ziehe das Klebeband von der Maus ab.
  28. Schalten Sie den Isofluran-Vaporizer aus.
  29. Bringen Sie die Maus in einen sauberen Käfig oder direkt in das intravitale Mikroskop.
  30. Halten Sie die Tiere nach der Fensteroperation einzeln und überwachen Sie sie bis zur vollständigen Genesung.
  31. Die Bildgebung erfolgt dann auf einem Zwei-Laser-Multiphotonenmikroskop, wie wir es bereits beschrieben haben 22,23,24 Für lange Bildgebungssitzungen wird die Maus in eine beheizte Kammer gelegt, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, und mit unterstützenden Flüssigkeiten gemäß IACUC-Standards versorgt.

5. Cerulein-Behandlung zur Induktion einer Pankreatitis

  1. Um den Beginn einer Pankreatitis zu untersuchen, behandeln Sie gesunde Mäuse nach der Implantation des SWIP mit Cerulein. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse 14-18 Stunden lang nüchtern sind und vor der Verabreichung von Cerulein ad libitum Wasser erhalten.
  2. Injizieren Sie 50 μg/kg Cerulein in 100 μl steriles 1x DPBS intraperitoneal in Abständen von 1 h für bis zu acht Injektionen. Den Kontrollmäusen wurde ein äquivalentes Volumen von 1x DPBS allein, intraperitoneal injiziert, verabreicht.
  3. Nach der Bildgebung werden die Mäuse 24 Stunden nach der ersten Injektion durch Zervixluxation gemäß IACUC-Standards getötet.
  4. Führen Sie die Bildgebung mit einem Zwei-Laser-Multiphotonenmikroskop durch, wie zuvor beschrieben22,23,24. Legen Sie die Maus bei langen Bildgebungssitzungen in eine beheizte Kammer, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, und versorgen Sie sie mit unterstützenden Flüssigkeiten gemäß den IACUC-Standards.

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Ergebnisse

Abbildung 1, adaptiert von Du et al.15, zeigt Standbilder aus einem Zeitraffer-IVI-Film der murinen Bauchspeicheldrüse. Innerhalb der anfänglichen Eingewöhnungsphase (erste Stunde der Bildgebung, Abbildung 1A) kann eine gewisse Gewebebewegung beobachtet werden. Bei fortgesetzter Bildgebung nach dieser Eingewöhnungsphase (>75 min) beobachteten wir jedoch eine Zunahme der lateralen und axialen Stabilität (Abbildung 1...

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Diskussion

Das hier beschriebene SWIP-Protokoll bietet eine verbesserte Methode zur Stabilisierung des Bauchspeicheldrüsengewebes unter Verwendung einer Kreuzstichkorbtechnik. Frühe abdominale Bildgebungsfenster (AIWs) ermöglichten die intravitale Bildgebung (IVI) der inneren Organe des Abdomens, schränkten aber die Bewegung von Weichteilen wie der Bauchspeicheldrüse nicht ausreichend ein. Als Reaktion darauf entwickelten Park et al. ein Pankreas-Bildgebungsfenster (PIW), das eine horizontale Metallablage enthält und eine verbesser...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Evelyn Lipper Charitable Foundation, das Gruss-Lipper Biophotonics Center, das Integrated Imaging Program for Cancer Research, ein NIH T-32 Fellowship (CA200561) und ein Zuschuss des Department of Defense Pancreatic Cancer Research Program (PCARP) PA210223P1.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1%ige (w/v) Lösung eines enzymaktiven DetergensAlconox IncNAKonzentriertes, anionisches Detergens mit Proteaseenzymen für die manuelle und Ultraschallreinigung
5%ige (w/v) Lösung von NatriumhydroxidSigma-AldrichS8045Passivierungsreagenz
5 mm DeckglasElektronenmikroskopie Sciences72296-05Rundglas-Deckgläser 
7%ige (w/v) Lösung der ZitronensäureSigma-Aldrich 251275Passivierungsreagenz
28G 1 mL BD InsulinspritzeBD329410Spritze zur Zellinjektion
Baytril 100 (Enrofloxacin)Bayer (Santa Cruz Biotechnology)sc-362890RxAntibiotikum
Wärmelampe für die TischmontageMcMaster-Carr3349K51Wärmelampe
Buprenorphin 0,3 mg/mlCovetrus Nordamerika059122Buprenorphin Analgesie
Castroviejo Gebogene SchereWorld Precision InstrumentsWP2220Schere zum Schneiden von Gewebe
C57BL/6J MausJackson Laboratory000664 C57BL/6J Maus
ChlorhexidinlösungDurvet7-45801-10258-3Chlorhexidin-Desinfektionslösung
DruckluftkanisterFalconDPSJB-12Druckluft zum Trocknen
von Gewebe Cyanacrylat - Gel Sekundenkleber Klammern234790-6Hautkleber
Cyanacrylat - Flüssiger SekundenkleberKlammernLOC1647358Deckglaskleber
DPBS 1xCorning21-031-CVDPBS für Cerulein-/Zellinjektionen
Gemini Cautery KitHarvard Apparat726067Cautery Pen
Germinator 500CellPoint ScientificDER  5287-120VBead-Sterilisator
Graefe Mikro-Präparierzange; Gezahnt; Leichte Kurve; 0,8 mm Spitzenbreite; 4" LängeRoboz SurgicalRS-5135 Graefe Mikro-Präparierzange
Bildgebendes MikroskopNANASiehe Entenberg et al. 2011 [27]
BildgebungssoftwareNANASiehe Entenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (Isofluran)Henry Schein Animal Health50033Isofluran Anästhesie
Kim WipesFisher Scientific06-666-A Kim Tücher
LaborbandFisher Scientific159015RLaborband
Maus PräpariersetWorld Precision InstrumentsMOUSEKITChirurgische Instrumente
Maus Pfote Pulsoximeter SensorKent Scientific CorpoMSTAT Sensor-Pulsoximeter
Maus SurgisuiteKent ScientificSURGI-M04Beheizte Plattform
Nair Haarentfernung LotionAmazonB001RVMR7KEnthaarungslotion
OxygenTechAirOX TMOxygen
PERMA-HAND Schwarz Geflochtene Seidennähte, ETHICON Größe 5-0VWR95056-872Seidennaht
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1xLife Technologies10010-023PBS
PhysioSuite SystemKent ScientificPhysioSuitebeheizte Plattform Controller
PuralubeHenry Schein Tiergesundheit008897Augengleitmittel
Puritan Unsterile Wattestäbchen mit Wattespitze Fisher Scientific867WCNOGLUEWattestäbchen
SHARP Präzisions-Barrierespitzen, für P-100, 100 & Mikro; LDenville Scientific Inc.P1125100 & Mikro; L Pipettenspitzen
Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat– DextranSigma-AldrichT1287-500MGGefäßetikett
FensterbefestigungsplatteNANA MaßgeschneidertePlatte für die Fensterplatzierung auf dem Mikroskoptisch. Die Platte besteht aus 0,008 mm Unterlegscheibe aus Edelstahl. Zu den Abmessungen der Platte siehe Entenberg et al., 2018 [8].
FensterrahmenNANADas Fenster besteht aus einem Stahlrahmen mit einer zentralen Öffnung, der ein 5 mm Deckglas aufnimmt. Eine Rille von 1,75 mm um den Umfang des Rahmens bietet Platz für die Bauchfellmuskulatur und die Hautschichten, an denen sie haften können. Vgl. Entenberg et al., 2018 [8].

Referenzen

  1. Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).
  3. Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338(2017).
  4. Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
  5. Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
  6. Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
  7. Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  9. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145(2012).
  10. Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
  11. Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773(2016).
  12. Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
  13. Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
  14. Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
  15. Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273(2022).
  16. DeBold, T. A. M., James, W. How To Passivate Stainless Steel Parts. , https://www.mmsonline.com/articles/how-to-passivate-stainless-steel-parts (2003).
  17. Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
  18. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  19. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563(2011).
  20. Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
  21. Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793(2018).
  22. Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042(2016).
  23. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
  24. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  25. Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603(2016).
  26. Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115(2018).
  27. Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
  28. Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
  29. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
  30. Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
  31. Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).

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