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Methodenartikel

Venöser Thrombose-Assay in einem Mausmodell für Krebs

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DOI:

10.3791/65518

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5. Januar 2024

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1Renal Section, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 2Vascular Biology Section, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 3Division of Interventional Radiology, Department of Radiology, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 4Department of Medicine, Whitaker Cardiovascular Institute, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 5Department of Biochemistry and Cell Biology, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 6Veterans Affairs Boston Healthcare System, 7Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology, 8Center of Cross-Organ Vascular Pathology, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel zielt darauf ab, eine optimierte Methode zur Beurteilung von Venenthrombosen in einem Mauskrebsmodell vorzustellen, bei der Gefäßclips verwendet werden, um eine venöse Ligatur zu erreichen. Die Optimierung minimiert die Variabilität bei thrombosebedingten Messungen und erhöht die Relevanz für krebsassoziierte Venenthrombosen beim Menschen.

Zusammenfassung

Diese methodische Arbeit beleuchtet die chirurgischen Nuancen eines Nagetiermodells der Venenthrombose, insbesondere im Zusammenhang mit der krebsassoziierten Thrombose (CAT). Eine tiefe Venenthrombose ist eine häufige Komplikation bei Krebsüberlebenden und kann potenziell tödlich sein. Bei den aktuellen murinen Venenthrombosemodellen kommt es in der Regel zu einem vollständigen oder teilweisen mechanischen Verschluss der Vena cava inferior (IVC) mittels Naht. Dieses Verfahren induziert eine vollständige oder teilweise Stauung von Blut und Endothelschäden, die eine Thrombogenese auslösen. Die aktuellen Modelle weisen Einschränkungen auf, wie z. B. eine höhere Variabilität der Gerinnselgewichte, eine signifikante Mortalitätsrate und eine verlängerte Lernkurve. In diesem Bericht werden chirurgische Verfeinerungen mit Gefäßklammern vorgestellt, um einige dieser Einschränkungen zu beheben. Unter Verwendung eines syngenen Dickdarmkrebs-Xenotransplantat-Mausmodells verwendeten wir maßgeschneiderte Gefäßclips, um die Hohlvene infrarenale Hohlvene zu ligieren. Diese Clips ermöglichen einen Restlippenraum, ähnlich wie bei einem 5-0-Polypropylen-Nahtmaterial nach IVC-Ligaturen. Mäuse mit der Nahtmethode dienten als Kontrollen. Die Gefäßclip-Methode führte zu einem konsistent reproduzierbaren partiellen Gefäßverschluss und höheren Gerinnselgewichten bei geringerer Variabilität als die Nahtmethode. Die größeren Gerinnselgewichte, die größere Gerinnselmasse und das Gerinnsel auf der luminalen IVC-Oberfläche wurden aufgrund des höheren Druckprofils der Gefäßclips im Vergleich zu einer 6-0-Polypropylennaht erwartet. Der Ansatz wurde durch eine Graustufensonographie validiert, die im Vergleich zur Nahtmethode eine durchweg größere Gerinnselmasse in der infrarenalen Hohlvene mit Gefäßclips zeigte. Diese Beobachtungen wurden durch die Immunfluoreszenzfärbung weiter untermauert. Diese Studie bietet eine verbesserte Methode zur Generierung eines venösen Thrombosemodells in Mäusen, die zur Vertiefung des mechanistischen Verständnisses der CAT und in der translationalen Forschung wie der Wirkstoffforschung eingesetzt werden kann.

Einleitung

Krebsassoziierte venöse Thromboembolie (VTE)
Das Risiko für venöse Thromboembolien (VTE) ist bei Krebsüberlebenden 4- bis 7-mal höher als in der Allgemeinbevölkerung 1,2,3. Dieser Zustand verläuft bei einem von sieben Krebspatienten tödlich. Die Inzidenz von VTE variiert je nach Krebsart und Tumorlast und ist bei Patienten mit Bauchspeicheldrüsen- und Magenkrebs am höchsten4.

Die krebsassoziierte VTE bei Krebspatienten hat eine prognostische Bedeutung. Sie ist mit einem ungünstigen Gesamtüberleben im ersten Jahr nach einer Krebsdiagnose verbunden, auch nach Anpassung an Alter, Rasse und Stadium der zugrunde liegenden Krebserkrankung5. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Untersuchung der krebsassoziierten VTE und die Notwendigkeit, ihren Mechanismus anhand eines Tiermodells zu untersuchen. Die translationale Relevanz dieses Bereichs wird auch dadurch unterstrichen, dass VTE bei Krebspatienten vermeidbar und mit Thromboprophylaxe und antithrombotischer Therapie behandelbar ist6.

Tiermodelle für Krebs und Venenthrombose
Krebsmodelle werden konventionell als Xenotransplantate bezeichnet, bei denen Mäusen Krebszellen injiziert werden. Die Injektion von Krebszellen an einer Stelle wie ihrem Ursprung wird als orthotopes Modell bezeichnet, während an einer anderen Stelle (subkutane Ebene über der Flanke) als heterotopes Modell bezeichnet wird. Die Ursprungsart von Krebszellen bestimmt sie als allogenes Modell, wie z.B. die HT-29-Zelllinie (menschlicher Darmkrebs)7,8,9. Im Gegensatz dazu verwenden syngene Modelle die murinen Krebszelllinien, einschließlich RenCa- und MC-38-Zelllinien 3,10.

In der Literatur werden arterielle, venöse und kapillare Thrombosemodelle bei Nagetieren beschrieben. Die Venenthrombose wird in der unteren Hohlvene (IVC) durch mechanische Verletzung (Führungsdraht) oder vollständige IVC-Ligatur, chemische (Eisenchlorid) oder elektrolytische Schädigung induziert. Die Eisenchlorid-induzierte Thrombose oder IVC-Ligatur stellt ein vollständiges Okklusionsmodell dar. Letzteres führt zur Stauung von Blut und entzündlichen Infiltraten in den Venen11,12,13. Das vollständige Ligationsmodell führt zu einer hohen Thrombosebildungsrate bei 95% bis 100% der Mäuse. Das partielle IVC-Ligaturmodell kann eine Unterbrechung der lateralen iliolumbalen Äste beinhalten, und der venöse Rückfluss wird durch die Anwendung von Nahtligaturen an den distalen Zielpunkten von IVC12 aufgehoben. Manchmal wird ein Platzhalter verwendet, um den venösen Rückfluss teilweise zu unterbrechen. Das Thrombusgewicht ist jedoch im aktuellen partiellen Okklusionsmodell inkonsistent, was zu einer hohen Variabilität der Gerinnselgewichte und -höhen führt12,14.

Beide großen mechanischen Modelle (partiell und vollständig) haben ihre Grenzen. Erstens führt die IVC-Ligatur (Stasismodell) häufig zu einer Hypotonie. Das Blut wird durch die Wirbelvenen geleitet. In erfahrenen Händen liegt die Sterblichkeit bei diesem Modell zwischen 5 % und 30 %, wobei die höhere Rate während der Lernkurve zu erwarten ist. Wichtig ist, dass das vollständige Okklusionsmodell keine tiefe Venenthrombose (TVT) beim Menschen reproduziert, bei der ein Thrombus in der Regel nicht okklusiv ist. Ein vollständiger Verschluss verändert wahrscheinlich hämorheologische Faktoren und pharmakodynamische Parameter, wodurch sich die Bioverfügbarkeit von Verbindungen an der lokalen Stelle verändert. Aufgrund dieser Einschränkungen sind vollständige Okklusionsmodelle möglicherweise nicht optimal für die Prüfung neuartiger chemischer Verbindungen für therapeutische Zwecke und Arzneimittelentdeckungen12.

Es sollte beachtet werden, dass zur Bereitstellung eines klinisch relevanteren murinen Modells der Venenthrombose mit vermindertem Fluss und endothelialer Schädigung ein venöses Thrombosemodell eingeführt wurde, bei dem die TVT durch die Einschränkung des Blutflusses ohne Endothelstörung ausgelöst wird. Das Modell wurde mittels Rasterelektronenmikroskopievalidiert 15. Ein bevorzugtes klinisch relevantes Thrombosemodell ist ein Modell mit nahezu vollständiger Thrombose, das die Entdeckung von Medikamenten ermöglicht. Die Gerinnselbildung in den aktuellen partiellen Okklusionsmodellen ist inkonsistent, was zu einer hohen Variabilität des Gerinnselgewichts und der Gerinnselhöhen führt12,16. Darüber hinaus ist das Gerinnselgewicht bei den herkömmlichen Methoden variabel, so dass mehr Mäuse pro Studie benötigtwerden 12.

Bisherige krebsassoziierte Thrombosemodelle konzentrierten sich auf Dickdarm-, Bauchspeicheldrüsen- und Lungenkrebs und waren alle vollständige Okklusionsmodelle17,18,19. Dieses Manuskript modifiziert das partielle Okklusionsthrombosemodell, um Gerinnsel mit geringerer Variabilität und Mausmortalität bereitzustellen (Abbildung 1). In früheren Studien wurden allogene Krebszelllinien an immungeschwächten athymischen Mäusen verwendet Hintergrund 19,20,21. In diesem Manuskript wird ein syngenes MC-38-Zell-Xenotransplantat in C57Bl6/J-Mäusen verwendet, das die Verwendung von immunkompetenten Mäusen und die Untersuchung von Immunkomponenten zur Thrombogenese ermöglicht.

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Protokoll

Für diese Studie wurden 16 weibliche C57Bl6/J-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und einem Körpergewicht von 20 bis 25 g verwendet. Die Mäuse wurden unter Standardbedingungen untergebracht und ad libitum mit Futter und Wasser gefüttert. Diese Studie wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Boston University durchgeführt. Die hier beschriebenen offenen Eingriffe wurden in sterilem Zustand durchgeführt.

1. Xenograft-Modell

  1. Zellkultur
    1. Vor der heterotopen subkutanen Implantation werden MC-38-Zellen als Monolayer bis zu 80 % Konfluenz gezüchtet.
    2. Nach Trypsinisierung und Resuspension in 10% FBS-haltigen Medien zentrifugieren die Zellen bei 277 x g, 4 °C für 5 min. Anschließend werden die Zellen in serumfreien Medien auf eine Konzentration von 1 x 104 MC-38-Zellen/μl serumfreiem Medium resuspendiert.
      1. Für die Trypsinisierung kultivieren Sie die MC-38-Zellen, bis sie einen gewünschten Zusammenfluss erreichen (normalerweise etwa 70%-80%) und saugen dann das Nährmedium aus der Petrischale ab.
      2. 1 ml Trypsin-EDTA-Lösung zugeben und die Zellen 1 Minute lang bei 37 °C mit Trypsin inkubieren, um eine Ablösung zu ermöglichen. Klopfen oder schütteln Sie vorsichtig auf die Petrischale, um eine gleichmäßige Ablösung zu gewährleisten.
      3. Fügen Sie ein Kulturmedium hinzu, das Serum oder einen Trypsin-Inhibitor enthält, um die Aktivität zu neutralisieren und eine weitere Zelldissoziation zu verhindern. Sammeln Sie die abgelösten Zellen zusammen mit der neutralisierten Trypsinlösung.
      4. Für die Resuspension bereiten Sie die Zellen, sobald sie durch Trypsinisierung abgetrennt sind, für die Transplantation oder weitere Experimente vor. Zentrifugieren Sie die gesammelte Zellsuspension bei 277 x g , um die Zellen zu pelletieren.
      5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand (Flüssigkeit über dem Zellpellet). Fügen Sie dem Zellpellet 9 ml Kulturmedium, Puffer oder Lösung hinzu, um die gewünschte Zellkonzentration für die Transplantation oder das Experimentieren zu erreichen.
      6. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie sie auf und ab pipettieren oder einen Kulturkolbenschüttler verwenden. Vermeiden Sie heftiges Pipettieren, das die Zellen beschädigen könnte.
        HINWEIS: Abhängig von der verwendeten Variante oder Zelllinie können Zellen in einem 1:1-Verhältnis von solubilisierter Basalmembranmatrix und serumfreien Medien resuspendiert werden, um das hochaggressive Wachstum und die Ausbreitung von Mauszellen nach der Implantation zu verlangsamen. Alle Zellkulturschritte sollten in einer vollständigen aseptischen Haube in einem speziell zugewiesenen Zellkulturraum durchgeführt werden und wurden regelmäßig auf Mykoplasmen getestet.
    3. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler gemäß dem bereitgestellten manuellen Protokoll.
  2. Zellimplantation
    1. Ordnen Sie der Versuchsgruppe nach dem Zufallsprinzip acht Mäuse und der Kontrollgruppe acht Mäuse wie folgt zu. Verwenden Sie in der Kontrollgruppe Mäuse mit MC38-Xenotransplantat und führen Sie eine IVC-Ligatur mit einem Polypropylen-5-0-Naht durch. Verwenden Sie in der Experimentalgruppe Mäuse mit MC38-Xenotransplantat und führen Sie eine IVC-Ligatur mit einem maßgeschneiderten Gefäßclip durch.
    2. Legen Sie die Maus in die linke Seitenlage und rasieren Sie die rechte Seite zwischen den Vorder- und Hintergliedmaßen. Tragen Sie Alkohol und Jod entlang des dorsalen Lendenwirbelbereichs auf, um den Bereich aseptisch für die Injektion vorzubereiten.
    3. Injizieren Sie 2 x 106 MC-38-Zellen, die in 200 μl Medium hergestellt wurden, subkutan in die Flanke, auf halbem Weg zwischen der distalsten Rippe des Tieres und der Beckeneminenz mit einer 27G-Nadel, während das Tier sanft in der nicht-dominanten Hand gehalten wird.
    4. Nach der Injektion sind die Tiere sorgfältig zu untersuchen und wieder in den Käfig zu setzen. Die Tiere sollten auf Folgendes untersucht werden: 1. Veränderungen des Verhaltens, des Aktivitätsniveaus und der allgemeinen Mobilität der Mäuse. Jede signifikante Veränderung kann auf Beschwerden oder gesundheitliche Probleme hinweisen. 2. Der allgemeine körperliche Zustand der Mäuse, einschließlich der Fellqualität, der Pflegegewohnheiten und aller sichtbaren Anzeichen von Stress oder Anomalien 3. Rückkehr zu Nahrungsaufnahme und Wasseraufnahme 4. Jegliche Veränderungen des Aktivitätsniveaus, der Körperhaltung oder der Interaktionen mit den Käfiggenossen. Lethargie oder erhöhte Aggression können Anzeichen für Stress sein.

2. Verlaufskontrolle des Tumorwachstums

  1. Überwachen Sie die Tiere alle zwei Wochen auf Tumorwachstumstrends für 3-4 Wochen. Messen Sie die Tumore mit einem Messschieber und erfassen Sie die Tumordimensionen.
    1. Messen Sie die Tumore entlang ihrer längsten Achse (L) und der Achse senkrecht zur Längsachse (W). Berechnen Sie das Tumorvolumen (V) mit der Gleichung L x (W2) = V. Wenn die Tumorgröße in jeder Dimension 20 mm überschreitet und/oder der Tumor Anzeichen von Ulzerationen aufweist, müssen die Tiere vor Beendigung des Versuchs eingeschläfert werden.
  2. Sobald das Tumorvolumen 400 mm3 erreicht hat, planen Sie, die Mäuse für die IVC-Ligatur zu verwenden.

3. Anästhesie und Vorbereitung

  1. Betäuben Sie die Maus in einer Isoflurankammer und injizieren Sie das Analgetikum subkutan: Halten Sie das Tier vom Schwanzansatz aus. Halten Sie das Tier auf der Rückenfläche der nicht-dominanten Hand.
  2. Bringen Sie das Tier in die Induktionskammer für kontinuierliche Anästhesie, die mit 3%-4% Isofluran gefüllt ist. Bestätigen Sie eine angemessene Vollnarkose ohne einen Zehenkneifreflex. Verwenden Sie eine Erhaltungsdosis von 1%-3% Isofluran. Tragen Sie Tiersalbe auf beide Augen auf.
  3. Subkutane Injektion mit Buprenorphin (Opioid zur Schmerzlinderung): Lösen Sie den Buprenorphin-Vorrat in einer Konzentration von 0,3 mg/ml in 0,9% Natriumchlorid (NaCl) auf, um die Konzentration von 0,03 mg/ml zu erreichen.
  4. Vor der Operation wird eine Dosierung von 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml Buprenorphin zusammen mit 500 μl sterilem 0,9% NaCl subkutan injiziert. Bei einer 20-g-Maus ist eine Menge von 2 μg oder 66 μl von 0,03 mg/ml Buprenorphin erforderlich.
  5. Hautvorbereitung: Legen Sie die vollnarkotierte Maus in Rückenlage über die Heizdecke. Desinfizieren Sie den vorderen Bauchbereich mit 0,5%iger Chlorhexidin-Tinktur, 2x. Kontrollieren Sie während des Eingriffs regelmäßig die Temperatur der Heizdecke und stellen Sie sicher, dass die Temperatur nicht sinkt.

4. IVC-Ligatur

  1. Laparotomie in der Mittellinie
    1. Schneiden Sie die Bauchhaut mit einer feinen Schere von der xiphoidalen Eminenz bis zur Blase ein. Kneifen Sie das Bauchfell mit einer atraumatischen Zange auf halber Höhe des Hautschnitts zusammen. Achten Sie auf einen ausreichenden Abstand zwischen dem Einschnitt und dem darüber liegenden Darm (Abbildung 2A).
    2. Öffnen Sie das Bauchfell in Längsrichtung zusammen mit der avaskulären Linea alba.
  2. Ausdehnung des Darms auf die rechte Bauchseite
    1. Ziehen Sie den Darm mit nassen Wattestäbchen ab. Bedecke den Darm mit einer vollständig feuchten, sterilen Gaze. Achten Sie darauf, dass sich der bedeckte Darm in einer traktionsfreien Richtung befindet, ohne dass es zu einer übermäßigen Zugkraft auf die mesenterialen Gefäße kommt.
  3. Vollständige Freilegung der IVC und der Äste, einschließlich des Zusammenflusses der linken Nierenvene in die IVC (Abbildung 2B).
    1. Tropfen Sie 200-300 μl normale Kochsalzlösung. Untersuchen Sie den Verlauf der Harnleiter, der IVC, der Aorta und der Nierenvenen (Abbildung 2).
  4. Avaskuläre Ebene am Konfluenzpunkt der infrarenalen IVC und der linken Nierenvene.
    1. Führen Sie das Polypropylen-6-0-Nahtmaterial vorsichtig 2x-3x mit kaudalen bis cephaladischen Bewegungen mit der geschlossenen atraumatischen Zange durch die avaskuläre Ebene.
    2. Stellen Sie sicher, dass minimales Nässen mit sanftem Druck kontrolliert wird, der mit einer Wattestäbchentamponade versehen ist. Erweitern Sie die vorgesehene Ebene, indem Sie die 6-0-Polypropylen-Naht mit sanften kaudalen bis kranialen Bewegungen durchführen.
  5. Kauterisierung der Gonaden- und Lendenäste (Abbildung 2D)
    1. Es können bis zu 4 hintere oder lumbale Äste vorhanden sein. Um mögliche Komplikationen bei spinaler Ischämie und Claudicatio zu vermeiden, lassen Sie die Lendenäste im aktuellen Protokoll intakt.
    2. Überprüfen Sie, ob 2 bis 3 Seitenäste, einschließlich der bilateralen Gebärmutterhorn-Arterienversorgung und der hypogastrischen Gefäße, vorhanden sind. Sicherstellen einer konsequenten Unterbrechung der ersten bilateral vorhandenen Filialen. Kauterisieren Sie die bilateralen Äste direkt distal des Zusammenflusses der linken Nierenvene und der IVC (infrarenale IVC). Achten Sie darauf, dass die venösen Abflussgefäße des Gebärmutterhorns nicht gestört werden.
      HINWEIS: Die Kauterisierung mit Seitenzweigen wird gewählt, da diese Methode eine glatte und ununterbrochene Oberfläche bietet und das Potenzial für unkontrollierte Blutungen reduziert. Darüber hinaus ist die Kauterisierung schneller und praktikabler als die Nahtligatur mit 10:0-Nähten. Daher werden die Tiere einem kürzeren und sichereren Verfahren ausgesetzt.
  6. Überprüfen Sie den Verlauf der Harnleiter und des Gefäßsystems, um sicherzustellen, dass kein Nässen oder unbeabsichtigtes Kauterisieren auftritt (Abbildung 2C).
  7. IVC-Ligatur mit Gefäßclips in der Experimentalgruppe
    1. Passen Sie die Gefäßklammern mit einer Breite von 2-0 Nylonnähten mit einer atraumatischen Zange an. Die angepassten Gefäßklammern in der Experimentalgruppe werden umlaufend um die infrarenale IVC herum angebracht.
    2. Bringen Sie die Gefäßklammern über der Naht an. Die primäre Nahtpassage bietet eine ausreichende avaskuläre Ebene mit zwei bis drei akribischen kaudalen bis kranialen Bewegungen (Abbildung 2E-F).
    3. Führen Sie die Gefäßklammern weiter durch die vorbereitete Ebene. Bereiten Sie die Ebene am Zusammenfluss der linken Nierenvene und der IVC vor, die breit genug ist, um eine ereignislose Clippassage zu ermöglichen (Abbildung 2E).
    4. Platzieren Sie den angepassten Gefäßclip horizontal, senkrecht zum IVC-Verlauf, durch die vorbereitete Ebene. Platzieren Sie die Gefäßklammern über dem 5-0-Polypropylen-Nahtmaterial, um einen ausreichenden verbleibenden Platz zu gewährleisten (Abbildung 2G).
    5. Stellen Sie sicher, dass die oben genannten Schritte sanft durchgeführt werden, um eine Gefäßschädigung oder Blutung an der Stelle der Gefäßclips zu vermeiden. Beobachten Sie das Operationsfeld auf mögliches Nässen. Üben Sie bei Nässen sanften Druck mit der Wattestäbchen mit der Wattestäbchen auf das Operationsfeld aus.
  8. IVC-Ligatur mit Naht in der Kontrollgruppe
    1. Nahtligatur mit 6-0 Polypropylen-Naht. Machen Sie eine chirurgische quadratische Knotennaht um die infrarenale IVC in der vorbereiteten Ebene über einer 5-0-Seidennaht.
    2. Sobald die Naht abgeschlossen ist, entfernen Sie die Seidennaht vorsichtig, um ausreichend Restplatz zu gewährleisten.
  9. Führen Sie eine subkutane Injektion von 200 μl normaler Kochsalzlösung durch.
    HINWEIS: Um eine vergleichbare Technik für die partielle IVC-Okklusion mit Klemmenanwendung bereitzustellen, wird der Gefäßclip in der aktuellen Studie so angepasst, dass er Platz zwischen den Lippen bietet. Der Gefäßclip wird dann in der vorbereiteten avaskulären Ebene im Zusammenfluss der linken Nierenvene und der IVC platziert.
  10. Schließen Sie die Laparotomie mit kontinuierlich laufender 4-0 Vicryl-Naht.

5. Nachsorge nach der Indexoperation

  1. Überwachen Sie das Tier nach der Operation kontinuierlich für 1 Stunde oder bis das Gleichgewicht und die Aufrichtfähigkeit wiederhergestellt sind, je nachdem, was zuerst kommt, in einem isolierten, sauberen Käfig, bis es sich vollständig erholt hat.
  2. Überwachen Sie das Tier täglich für 2 Tage. Wenn das Tier verzweifelt aussieht, überwachen Sie es 2 Tage lang zweimal täglich. Verabreichen Sie postoperative Analgesie und Flüssigkeiten gemäß Protokoll.
    1. Lösen Sie den Buprenorphin-Vorrat mit einer Konzentration von 0,3 mg/ml in 0,9%igem Natriumchlorid (NaCl) auf, um die Konzentration von 0,03 mg/ml zu erreichen.
    2. Injizieren Sie eine Dosierung von 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml Buprenorphin subkutan zusammen mit 500 μl sterilem 0,9%igem NaCl alle 8 bis 12 Stunden während der ersten 48 Stunden nach der Indexoperation. Bei einer 20-g-Maus wären 2 μg oder 66 μl von 0,03 mg/ml Buprenorphin erforderlich.

6. Euthanasie und Entnahme des IVC, das das Gerinnsel enthält

  1. Betäuben Sie die Maus in einer Isofluran-Kammer, halten Sie das Tier vom Schwanzansatz aus und halten Sie das Tier auf der Rückenfläche Ihrer Hand.
  2. Bringen Sie das Tier in die Induktionskammer für kontinuierliche Anästhesie, die mit 3%-4% Isofluran gefüllt ist. Bringen Sie das Tier in Rückenlage.
  3. Führen Sie eine lange Mittellinien-Laparotomie durch, beginnend vom Xiphoid bis zur Blase, wie beschrieben.
  4. Exteriorisieren Sie den Darm auf die rechte Seite des Abdomens und entnehmen Sie die eingeklemmte IVC distal der Beckenbifurkation im Ausmaß der infrarenalen IVC (Abbildung 2G).
  5. Nach dem Gerinnsel und der Tumorentnahme wird das Tier mit Gebärmutterhalsluxation eingeschläfert.

7. Statistische Analyse

  1. Präsentieren Sie die statistische Analyse als Mittelwert, Median und Standardabweichung (SD) oder Standardfehler des Mittelwerts (SEM), des 25. oder 75. Perzentils oder des gesamten Wertebereichs, einschließlich Minimal- und Maximalwerten. Führen Sie einen Schüler-t-Test und ggf. den F-Test durch. Bewerten Sie die statistische Signifikanz auf dem Niveau von p <0,05.

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Ergebnisse

Einer Gruppe weiblicher C57Bl6/J-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen wurden MC-38-Zellen in der logarithmischen Phase des Zellwachstums injiziert. Die Xenotransplantate wuchsen zwischen der dritten und vierten Woche nach der Injektion schnell18. Sobald die Tumore ein durchschnittliches Volumen von 400mm3 erreicht hatten, wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in die Kontroll- und Experimentalgruppe eingeteilt. Die Kontrollgruppe wurde einer IVC-Ligatur mit Naht unterzogen, während die Vers...

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Diskussion

In einem syngenen Xenotransplantat-Kolonkarzinommodell beobachten wir in der Experimentalgruppe eine höhere Thrombogenität und Expression von Gerinnungsmarkern im Vergleich zur Kontrollgruppe. Wichtig ist, dass die Varianz all dieser Parameter in der Experimentalgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe geringer war. Die Modifikation beinhaltete die Einführung eines Gefäßclips mit einem spezifischen Druckprofil am Konfluenzpunkt der IVC und der linken Nierenvene. Der Clip wurde über einen Abstandshalter gelegt, bei dem es s...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center Grant 857078 (KR, VCC, XY und SL) und R01HL166608 (KR und VCC) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Buprenorphin 0,3 mg/mlPAR Pharmazie NDC 42023-179-05
C57BL/6J MäuseThe Jackson LabIMSR_JAX:000664
MessschieberVWR International, Radnor, PA12777-830
CD31AbcamAb9498
ZellzählerMOXIEMXZ000
Klemme  Feine wissenschaftliche Werkzeuge    13002-10
Klammern ASSI. B2V Einzelklemme, universell einsetzbar,präzise chirurgisch & Scientific InstrumentsPR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF PinzettenFine Science Tools11252-00
FibrinMilliporeMABS2155-100UG
Feine Schere - Große SchlaufenFine Science Tools14040-10
Pinzetten  Fine Science Tools11002-12
Hill HemostatFine Science Tools13111-12
Isofluran, USP  CovetrusNDC 11695-6777-2
MC-38 ZelleSigma AldrichSCC172
MikroskopNikon Eclipse Inverses MikroskopTE2000
Schere  14079-10
Nahtmaterial- VicrylAD-Chirurgisches#L-G330R24
Nahtmaterial-Nylon 2-0Ethilon664H
Nahtmaterial-Prolene 5-0Ethicon8661G
Naht-Prolene 6-0EthiconPDP127
VEV03100VisualSonicsFujiFilm
Vitrogel Matrigel MatrixThe Well BioscienceVHM01 

Referenzen

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