Summary
Bu çalışmada, etiketsiz canlı hücre biyogörüntülemesini göstermek ve iki bakteri suşunu tespit etmek için uygun biyouyumluluğa sahip, düşük maliyetli, yüzeyde geliştirilmiş Raman saçılımı (SERS) tabanlı bir parmak izi nanoprobu geliştirdik ve canlı hücrelerin SERS spektrumlarının tahribatsız bir yöntemle nasıl elde edileceğini ayrıntılı olarak gösterdik.
Abstract
Yüzeyde geliştirilmiş Raman saçılımı (SERS) teknolojisi, biyolojik numunelerin moleküler parmak izi bilgilerini sağlama yeteneğinin yanı sıra tek hücreli analizdeki potansiyeli nedeniyle biyomedikal alanda giderek daha fazla ilgi görmüştür. Bu çalışma, Au@carbon noktalı nanoproblara (Au@CDs) dayalı etiketsiz SERS biyoanalizi için basit bir strateji oluşturmayı amaçlamaktadır. Burada, polifenolden türetilen CD'ler, işbirlikçi Raman geliştirme mekanizması sayesinde metilen mavisi (MB) konsantrasyonu 10-9 M kadar düşük olduğunda bile güçlü SERS performansına izin veren çekirdek-kabuk Au@CD nanoyapıları hızlı bir şekilde sentezlemek için indirgeyici olarak kullanılır. Biyoanaliz için Au@CDs, biyonumunelerin hücresel bileşenlerini (örneğin, kanser hücreleri ve bakteriler) tanımlamak için benzersiz bir SERS nanosensörü olarak hizmet edebilir. Farklı türlere ait moleküler parmak izleri, ana bileşen analizi ile birleştirildikten sonra daha da ayırt edilebilir. Ek olarak, Au@CDs hücre içi bileşim profillerini analiz etmek için etiketsiz SERS görüntülemeyi de mümkün kılar. Bu strateji, uygulanabilir, etiketsiz bir SERS biyoanalizi sunarak nanotanı için yeni bir olasılık sunar.
Introduction
Tek hücre analizi, hücresel heterojenliği ortaya çıkarma ve hücrenin kapsamlı durumunu değerlendirme çalışması için gereklidir. Hücrenin mikro çevreye anında tepki vermesi de tek hücreli analizigaranti eder 1. Bununla birlikte, mevcut tekniklerin bazı sınırlamaları vardır. Floresan algılama, tek hücreli analize uygulanabilir, ancak düşük hassasiyetle sınırlıdır. Diğer zorluklar, hücrelerin karmaşık floresan arka planından ve uzun süreli ışınlama altında floresan fotoağartmadankaynaklanmaktadır 2. Yüzeyde geliştirilmiş Raman saçılması (SERS), (1) içsel moleküler parmak izi bilgisini ve anlık durumu yansıtmak, (2) ultra yüksek yüzey hassasiyeti, (3) uygun multipleks algılama, (4) yüksek fotostabilite, (5) algılama, karşılaştırmalı analiz için ölçülebilir, (6) NIR dalga boyu uyarımı ile hücresel otofloresandan kaçınmak, (7) algılama hücresel bir suda gerçekleştirilebilir ortam ve (8) algılama,hücre 3,4,5 içindeki belirli bir bölgeye yönlendirilebilir.
SERS'i temel bir fenomen olarak anlamak için geniş çapta tanınan iki mekanizma vardır: baskın bir neden olarak elektromanyetik güçlendirme (EM) ve kimyasal güçlendirme (CM). EM, heyecan verici alanın belirli bir frekansında, gelen ışığın frekansı metalde salınan serbest elektronların frekansıyla eşleştiğinde elektromanyetik dalgalar tarafından yönlendirilen kolektif elektronların salınımını ifade eder ve yüzey plazmon rezonansına (SPR) yol açar. Lokalize SPR (LSPR), metal nanopartiküllere (NP'ler) çarpan gelen lazer yoluyla meydana geldiğinde, gelen ışığın rezonans absorpsiyonuna veya saçılmasına yol açar. Sonuç olarak, metal NP'lerin yüzey elektromanyetik alan yoğunluğu iki ila beş sıra4 ile arttırılabilir. Bununla birlikte, SERS'deki büyük gelişmenin anahtarı, tek bir metal NP değil, sıcak noktalar oluşturan iki NP arasındaki boşluktur. CM, (1) hedef moleküller ve metal NP'ler arasındaki etkileşimler ve (2) hedef moleküllerin metal NP'lere/NP'lerden elektron aktarabilmesi dahil olmak üzere iki taraftan üretilir 4,5. Bu inceleme makalelerinde daha ayrıntılı ayrıntılar bulunabilir 4,5. Canlı hücrelerde SERS biyoalgılama ve görüntüleme için birkaç umut verici yöntem önceki literatürde sunulmuştur, örneğin, apoptotik hücrelerin6, organellerdekiproteinlerin 7, hücre içi miRNA'ların8, hücresel lipid membranlarının,9 sitokinlerin10 ve metabolitlerin11 canlı hücrelerde saptanmasının yanı sıra konfokal SERS görüntüleme ile hücrelerin tanımlanması ve izlenmesi2, 11,12,13. İlginç bir şekilde, etiketsiz SERS, dahili moleküler spektrumlarıtanımlayabilen SERS'in benzersiz avantajını sunar 5.
Etiketsiz SERS için önemli bir sorun, rasyonel ve güvenilir bir alt tabakadır. Tipik SERS alt tabakaları, çok fazla ışık saçma konusundaki mükemmel kapasiteleri nedeniyle asil metal NP'lerdir14. Günümüzde, dikkat çekici fiziksel ve kimyasal özellikleri ve biyouyumlulukları nedeniyle nanokompozitlere giderek daha fazla önem verilmektedir. Daha da önemlisi, nanokompozitler, nanohibritler üzerindeki sıcak noktaların neden olduğu yoğun EM ve diğer metal olmayan malzemelerden kaynaklanan ek kimyasal güçlendirme nedeniyle daha iyi SERS aktivitesi gösterebilir15. Örneğin, Fei ve ark. fare 4T1 meme kanseri hücresinin (4T1hücreleri) etiketsiz yakın kızılötesi (NIR) SERS görüntülemesi için Au NP@MoS2 QD nanokompozitleri sentezlemek için indirgeyici olarak MoS 2 kuantum noktalarını (QD'ler) kullandılar16. Ayrıca, Li ve ark. gıda kaynaklı patojenik bakterilerin etiketsiz SERS ölçümleri için Au NP'ler ve 2D hafniyum ditellürid nano tabakalardan oluşan bir 2D SERS substratı üretti17. Son zamanlarda, iyi elektron donörleri olan karbon noktaları (CD'ler), Au çekirdekleri ve CD kabukları arasındaki yük transferi (CT) etkisine dayalı olarak SERS aktivitesini arttırmak için etkili malzemeler olduğu bildirilen Au@carbon noktalı nanoprobları (Au@CDs)18 sentezlemek için başka indirgeyiciler veya ışınlama olmadan indirgeyiciler olarak kullanılmıştır19,20. Bunun da ötesinde, CD'ler, Au NP'lerin21 toplanmasını önlemek için kapatma maddesi ve bir dengeleyici olarak kabul edilir. Ek olarak, çok sayıda bağlanma ve aktif bölge20 sağlayabildiği için analitlerle reaksiyonlar için daha fazla olasılık açar. Yukarıdakilerden yararlanarak, Jin ve ark. heterojen katalitik reaksiyonları gerçek zamanlı olarak izlemek için benzersiz SERS özelliklerine ve mükemmel katalitik aktivitelere sahip Ag@CD NP'ler üretmek için hızlı ve kontrol edilebilir bir yöntem geliştirdi18.
Burada, hücresel bileşenleri tanımlamak ve etiketsiz SERS canlı hücre biyogörüntülemesinin yanı sıra Escherichia coli (E. coli) ve Staphylococcus aureus'u (S. aureus) tespit etmek ve ayırt etmek için çekirdek-kabuk Au@CD SERS substratlarının üretilmesi için kolay ve düşük maliyetli bir yöntem gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Au@CDs İmalatı
NOT: Şekil 1 , Au@CDs için bir üretim prosedürünü göstermektedir.
- Tipik bir hidrotermal işlem prosedürü ile sitrik asit (CA) ve gallik asit (GA) kullanarak CD çözeltisi hazırlayın18. Hazırlanan CD çözeltisinin 100 μL'sini 3.0 mg mL-1'i 200 μL 10 mM kloroaurik asit (HAuCl4) içine ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) mor bir süspansiyon üretilene kadar oda sıcaklığında 10 sn boyunca.
- Mor süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4.000 × g'da santrifüjleyin ve Au@CD kolloidlerin çıkarılması zorsa süpernatanı bir pipet kullanarak nazikçe çıkarın.
- Fazla CD'leri yıkamak için Au@CDs 200 μL deiyonize su (18.2 MΩcm direnç) ile yeniden süspanse edin.
- Adım 1.2'yi tekrarlayın ve 100 μL deiyonize su içinde yeniden dağılmış çekirdek kabuğu NP'lerini elde edin ve 4 °C'de saklayın. NP'ler 1 ay boyunca saklanabilir.
2. Au@CDs karakterizasyonu
- Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)
- CD ve Au@CD numunelerini donmuş bir çözeltiden liyofilize etmek için gece boyunca -80 °C'de bırakın ve liyofilizasyondan sonra toz haline getirin.
- Elde edilen toz numunelerini, 5 dakika boyunca% 100 güçte sonikasyon ile deiyonize suya yeterince dağıtın.
- Numune süspansiyonundan birkaç damla dantelli bir karbon film ile kaplanmış Cu kaplı bir TEM ızgarasına damlatın ve 200 kV hızlanma voltajında bir transmisyon elektron mikroskobu kullanarak kuruduktan sonra görüntüleri yakalayın (bkz.
- Fourier dönüşümü kızılötesi spektroskopisi (FT-IR)
- Güç numuneleri elde etmek için adım 2.1.1'i tekrarlayın, önceden kurutulmuş birkaç KBr partikülünü bir havanda toz haline getirin, numuneden bir tutam ekleyin ve IR karakterizasyonu16 için KBr tozlarıyla aynı anda karıştırın.
- Ultraviyole-görünür-yakın kızılötesi (UV-vis-NIR) absorbans spektroskopisi
- Absorbansın birden az olduğundan emin olmak için CD'lerin ve Au@CDs süspansiyonunu uygun konsantrasyonda hazırlayın ve UV-vis-NIR karakterizasyonu16 gerçekleştirin.
- Raman spektrumları
- 10 mW lazer gücü ve 20x itiraz büyütme ile 785 nm yarı iletken lazeri açın. Pozlama süresini 5 sn'ye ve birikim sayısını üçe ayarlayın.
- 5 μL metilen mavisi (MB) çözeltisine eşit hacimde hazırlanmış Au@CDs numunesi ekleyin ve iyice karıştırın.
- SERS spektrumlarını toplamak için pirinç alt tabakaya bir damla süspansiyon yerleştirin.
3. Hücre kültürü
- Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle besiyerinde (DMEM) insan epitelyal akciğer karsinomu hücrelerini (A549 hücreleri, laboratuvarda pasajlı) %10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile destekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin.
- Hücreleri 96 oyuklu plakalara (1 × 105 hücre / kuyucuk) tohumlayın ve 20-100 μM aralığında farklı konsantrasyonlarda Au@CDs ile muamele edin. Hücre canlılığını ölçmek için bir CCK-8 test kiti kullanın (bkz. Her tedavide üç bağımsız kopya kullanılır.
- SERS deneylerini gerçekleştirmek için aşağıdaki adımları izleyin:
- 12 oyuklu plakalara steril bir safir çip (Malzeme Tablosuna bakınız) koyun ve ardından hücreleri 1 mL ortam ile tek bir oyuğa tohumlayın. Plakaları nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de %5 COile% 70-% 80 birleşmeye ulaşmak için gece boyunca inkübe edin.
- Au@CDs tek kuyucuğa ekleyin ve 4-6 saat inkübe edin.
NOT: İnkübasyondan önce, substratların, özellikle çözelti fazı NP'lerinin stabilitesini test edin. Bu malzemeler, depolama ve kullanım sırasında çözünme, agregasyon ve çökeltme süreçleri yoluyla bozunmaya karşı hassastır, bu da EM kayıplarını azaltabilir ve SERS aktivitesini azaltabilir. Daha da önemlisi, hücresel alım için, NP'lerin22'nin boyutundan büyük ölçüde etkilenebilir. - İnkübasyon sırasında, substratlar endositik alım yoluyla hücrelere girecektir. İnkübasyondan sonra, hücrelerin içinde birkaç siyah parçacık görülene kadar hücreleri optik mikroskop altında gözlemleyin.
NOT: SERS yoğunluğu zayıfsa, Au@CD konsantrasyonunu arttırmaya veya inkübasyon süresini uzatmaya çalışın. - Ortamı çıkarın, safir yongaları fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe durulayın ve SERS tespiti için PBS'ye batırın16.
4. Hücre SERS deneyleri
- Bilgisayarı açın, Raman spektrometresini açın, yazılımı başlatın ve ardından 785 nm lazeri açın (bkz.
- Yeni Ölçüm'e tıklayın ve yeni bir spektral alım başlatın. Numune ölçümünden önce17'yi silikon gofretlerle kalibre edin.
- Net bir hücresel görüntünün gözlemlendiğinden emin olmak için 20x objektif lens alın, ardından objektif lensi 50x olarak değiştirin. Lazer gücünü düşükten yükseğe ve uygun pozlama süresini ve birikimlerini ayarlayın.
NOT: SERS ölçümünden önce, geri dönüşü olmayan hücre hasarını önlemek için uygun lazer gücünü kontrol edin ve alım parametrelerinin tutarlı olduğundan emin olun. SERS yoğunluğu, lazer gücü, nokta boyutu, birikim ve maruz kalma süresi ile ilgilidir. - Ölçmek için bir hücre noktası seçin ve Çalıştır'a tıklayın. Her hücre 20 nokta ile ölçülür ve ortalamayı almak için 10 hücre ölçülür.
NOT: Hücre içi bileşenler karmaşıktır ve geniş spektrum eşitsizliğine yol açar. Bu nedenle, benzer hücresel bölgelerdeki spektrumları alın ve mümkün olduğunca çok spektrum alın. - Spektrumları kaydedin.
- New Streamline görüntü alımına tıklayın, ardından Video İnceleme'ye tıklayın, fotoğrafı çekilecek aralığı seçin ve Tamam'a tıklayın. Parametreleri ayarlayın: 785 nm kenar akış çizgisi, 1.200 cm-1 merkez, 5 sn pozlama süresi, üç birikim sayısı ve lazer gücü %50'dir.
- Canlı görüntülemede Yeni'ye tıklayın, Taban Çizgisine Sinyal'i seçin, aralığı ilk sınır 625'ten ikinci sınır 1.700'e ayarlayın ve ardından Alan kurulumu'na tıklayın. Ardından uygun adımları ayarlayın ve Uygula ve Tamam'a tıklayın. Son olarak, SERS görüntülemeyi başlatmak için Çalıştır'a tıklayın.
5. Bakteri kültürü ve SERS ölçümleri
- Gece boyunca seyreltin E. coli ve S. aureus (1:100) yeni Luria-Bertani (LB) ortamının 5 mL'sinde (bkz. 37 ° C'de600 0.4 ila 0.6'da büyüdükten sonra, hücreleri peletlemek için kültürü 5.000 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Peletleri 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin, ardından iki kez 5 dakika 5.000 × g santrifüjleme (oda sıcaklığında) yapın.
- Bakteri kültürünü Au@CDs ile karıştırın ve karışımı doğrudan SERS platformunun altında gözlemleyin.
6. Veri analizi
- Spektrumları düzeltin ve taban çizgisini düzeltin.
- İşlenen verilerle temel bileşen analizi (PCA)16 gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Au@CDs imalatı Şekil 1'de gösterilmiştir. CD'ler, tipik bir hidrotermal işlemle CA ve GA'danhazırlandı 18. Au@CDs, oda sıcaklığında sulu ortamda CD'ler tarafından HAuCl4 indirgenerek hızla sentezlendi. CD'lerin ve Au@CDs boyutu ve morfolojisi TEM ve yüksek çözünürlüklü (HR) TEM23 ile gözlemlenebilir. Hazırlanan CD'ler, yaklaşık 2-6 nm'lik küçük boyutlarda monodispersizedir (Şekil 2A). Küresel Au çekirdeği, yaklaşık 2.1 nm'lik bir CD kabuğu tabakası ile kaplanmıştır (Şekil 2B, C ve Ek Şekil 1).
CD'lerin ve Au@CDs yapılarını doğrulamak için, organik fonksiyonel grupları analiz etmek için FT-IR spektrumları kaydedildi (Şekil 2D). 3,000-3,600/2,500-2,800 cm-1, 1,251/1,629 cm-1 ve 1,471 cm-1'deki bant sırasıyla OH germe titreşimine, C=O germe titreşimine ve CO germe titreşimine atanabilir24,25. Ayrıca, 1,741 cm-1'deki esneme titreşim bandı CC24 ile ilgilidir. GA ve CA'dan gelen bu fonksiyonel gruplardan birkaçı CD'lerde ve Au@CDs'larda da bulunur, bu da NP'lerin başarılı sentezini düşündürür. CD'lerin UV-vis absorpsiyon spektrumları, 265 nm'de karakteristik bir tepe noktasına sahiptir, bu da karbon çekirdeklerinde26 indirgeme üzerine kaybolan izole bir aromatik yapıyı gösterir. Au@CDs spektrumu, Au çekirdeğinin SPR absorpsiyon bandı ile ilişkili olan ve kompozit nanoyapının imalatını gösteren 545 nm'de karakteristik bir tepe noktası sergiler (Şekil 2E).
Şekil 3A,B'de gösterildiği gibi, MB konsantrasyonu 10-9 M kadar düşük olduğunda bile, Au@CDs Au NP'lere kıyasla mükemmel SERS performansı sergiler. Geliştirme faktörü (EF), I SERS ve I0'ın sırasıyla SERS spektrumunun ve normal Raman'ın Raman yoğunluklarına atıfta bulunduğu ve C SERSve C 0'ınsırasıyla SERSve Raman ölçümleri için kullanılan substrat moleküllerinin konsantrasyonlarına atıfta bulunduğu aşağıdaki denklem16 ile hesaplanabilir. Hesaplamak için 1.620 cm-1 MB alındığında, Au@CDs'nin EF'si yaklaşık 2.1 × 105'tir, bu da Au NP'lerinkinden yaklaşık üç kat daha güçlüdür (6.8 × 104).
770 cm-1 (C-H'nin düzlem içi bükülmesi), 1,398 cm-1 (C-N'nin simetrik gerilmesi) ve 1,625 cm-1 (C-C halkası gerilmesi) gibi birkaç karakteristik tepe noktası tespit edilebilir, bu da rapor edilen literatürle tutarlıdır27. Aynı zamanda, 10-5 M ila 10-9 M MB tespit edilir ve miktar tayini için 1.620 cm-1'de SERS bandı alınır; doğrusal ilişki y = 0.2437x + 2.1756 (R2 = 0.9922) olarak tanımlanır (Şekil 3B). Hassasiyete ek olarak, tekrarlanabilirlik ve uzun vadeli stabilite, SERS substratları için önemli göstergelerdir. Bu nedenle, SERS spektrumları rastgele 20 noktada elde edildi ve aralarında yüksek benzerlik görüldü (Şekil 3C,D); 1 ay boyunca dört spektrum toplandı, MB'nin karakteristik pikleri 4 ° C'de yerleştirildikten 1 ay sonra hala tespit edildi ve 950 cm-1, 1.185 cm-1 ve 1.620 cm-1'deki ortalama SERS aktivitesi sadece yaklaşık% 5.43,% 11.44 ve% 13.94'lük bir bozulma derecesi gösterdi, bu da Au@CD substratların iyi tekrarlanabilirliğini ve uzun vadeli stabilitesini gösterir.
Mevcut hücre SERS ölçümlerinde öncelikle NP'lerin sitotoksisitesi test edilmiştir. Au@CDs (20-100 μM) A549 hücrelerine zar zor sitotoksisite gösterdi (Şekil 3F). Yukarıdaki sonuçlar, canlı hücrelerde etiketsiz SERS ölçümlerine uygulanacak yüksek Au@CDs potansiyelini göstermektedir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, Au@CD monte edilmiş SERS substratı, hücresel bileşenlerin 800 ila 1.700 cm-1 arasında entegre SERS haritalamasını sağlar. A549 hücrelerinin SERS haritalamasında Au@CD NP agregatının gürültü arka planı olmadan belirgin SERS sinyalleri sergilediği gözlemlenmiştir (Şekil 4B). Şekil 4C'de farklı hücre noktalarından üç spektrum gösterilmiş olup, çeşitli sitoplazmik bölgelerdeki bileşenlerin heterojenliğini ve tek hücreli analiz için SERS probları olarak Au@CDs üstünlüğünü göstermektedir. A549 hücrelerinin ortalama spektrumu Şekil 4A'da gösterilmiştir ve bol miktarda hücresel bilgi gözlemlenebilir. Ayrıntılı karakteristik tepe atamaları Tablo 1'de verilmiştir.
Ek olarak, Au@CDs iki bakteri suşunu tespit etme ve ayırt etme konusunda iyi bir yetenek gösterirler. Elde edilen spektrumlar, 1.030 cm-1'de fenilalanin ve 741 cm-1'de nükleik asidin halka solunumu gibi E. coli ve S. aureus için yayınlanmış literatüre oldukça benzerdir (Şekil 5A, B), bu da SERS ölçümlerinin güvenilirliğini doğrulamaktadır28. Ayrıntılı karakteristik tepe atamaları28,29,30,31 Tablo 2'de verilmiştir. PCA modeli de iyi ayrımcılık yapar (Şekil 5C,D).
Şekil 1: Au@CDs sentez yolunun şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CD'lerin temsili karakterizasyonu ve Au@CDs. (A) CD'lerin HRTEM görüntüsü. Ölçek çubuğu: 10 nm. (B) Au@CDs'in TEM görüntüsü. Ölçek çubuğu: 100 nm. (C) Au@CDs'in arayüz bölgesinin HRTEM görüntüsü. Ölçek çubuğu: 10 nm; İç: 2 nm. (D) Ham GA, CA ve hazırlanmış CD'lerin ve Au@CDs'nin FT-IR spektrumları. (E) CD'lerin, Au NP'lerin ve Au@CDs'lerin UV-vis absorpsiyon spektrumları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Au@CDs'in SERS faaliyetleri. (A) Toplu MB (10-5 M, siyah çizgi) ve 10-9 M MB (mavi çizgi ve yeşil çizgi) çözeltisinin SERS spektrumları. (B) Farklı konsantrasyonlarda (10-9-10-5 M) MB'nin SERS spektrumları. Ekle: SERS bandının 1,620 cm-1 MB'deki doğrusal ilişkisi, y = 0.2437x + 2.1756 (R2 = 0.9922). SERS substrat tekrarlanabilirliği (C), bağıl standart sapma (RSD) histogramı (10-7 M'de MB'nin 1.620 cm-1 zirvesi) (D) ve uzun süreli stabilite (E) deneylerinin sonuçları. (F) Au@CD konsantrasyon gradyanı ile 24 saatlik inkübasyondan sonra A549 hücrelerinin hücre canlılıkları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: A549 hücrelerinin parmak izi analizi ve etiketsiz SERS görüntülemesi. (A) A549 hücrelerinin ortalama SERS spektrumu. (B) A549 hücrelerinin parlak alanı, SERS eşlemesi ve birleştirilmiş görüntüleri. Ölçek çubukları: 20 μm. (C) 1, 2 ve 3'ün birleştirilmiş görüntüsünde işaretlenmiş farklı hücre noktalarının SERS spektrumları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: İki bakteri suşunun parmak izi analizi. E. coli (A) ve S. aureus'un (B) ortalama SERS spektrumları. İki bakteri suşunun diferansiyel analizinde 2D PCA (C) ve 3D PCA (D). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: A549 hücrelerinin Raman tepe noktaları için atamalar. Kısaltmalar: Pro = prolin; HYP = hidroksiprolin; Tyr = tirozin; Trp = tripotofan; Phe = fenilalanin; A = adenin; T = timin; C = sitozin; G = guanin; viraj = bükme; str = germe; def = deformasyon; büküm = büküm; nefes = nefes alma; wag = sallama; sym = simetrik; asym = asimetrik; bk = omurga. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 2: E. coli ve S. aureus'un Raman zirveleri için atamalar.Kısaltmalar: Tyr = tirozin; Phe = fenilalanin; A = adenin; G = guanin; str = germe; def = deformasyon; nefes = nefes alma; sym = simetrik. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Au@CDs'nin dinamik ışık saçılımı çalışması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Özetle, 2.1 nm'lik ultra ince CD kabuğuna sahip Au@CDs başarıyla üretilmiştir. Nanokompozitler, saf Au NP'lerden daha üstün SERS duyarlılığı gösterir. Ayrıca, tekrarlanabilirlik ve uzun vadeli stabilite açısından mükemmel performansa Au@CDs. Daha ileri araştırmalar, A549 hücrelerinin31 SERS görüntülemesini gerçekleştirmek ve iki bakteri suşunu32 tespit etmek için Au@CDs substrat olarak almayı içerir. Au@CDs'nin esas olarak Au NP'ler ve CD'ler arasındaki kimyasal güçlendirmeye dayalı olarak ultra hassas bir SERS probu olarak kullanılabileceği kanıtlanmıştır.
Önceki protokolde SERS ölçümleri sırasında birkaç önemli nokta vardır. İlk olarak, Au@CDs hücrelere ve bakteri örneklerine uygulanmadan önce, boya molekülleri tarafından doğrulanabilen doğru konsantrasyonun yanı sıra üstün bir SERS substrat formülünün sağlanması gerekir. Sonuç olarak, SERS spektrumu her hücresel noktada tutarsızdır çünkü biyolojik örnekler karmaşık ve dinamiktir.
Daha büyük bir lazer noktası çekiliyorsa, farklı noktalardan SERS spektrumu daha benzer olacaktır. Dikkat edilmesi gereken, aynı hücresel noktanın SERS spektrumu farklı lazer gücüne uygun olmayabilir. Biyolojik örneklerin ortalama SERS spektrumunun tutarlı olduğu iyi kabul edilmektedir; bu nedenle, SERS spektrumunu mümkün olduğunca aynı hücresel bölgelerde elde etmek ve daha sonra birkaç farklı hücresel bölgenin ortalamasını almak çok önemlidir. Ek olarak, hücre içi SERS algılama hassasiyeti, arka plan sinyallerinden kolayca etkilenir. Raman arka plan sinyalleri esas olarak (1) safir, silikon gofret vb. gibi bir substrat, (2) bir SERS probu ve (3) biyolojik numuneler dahil olmak üzere üç yönden gelir. Sonuç olarak, zor olsa da, mümkün olduğunda arka plan gürültüsü olmayan alt tabakaların seçilmesi önerilir.
Konvansiyonel Raman spektroskopisi ile karşılaştırıldığında, SERS sinyal yoğunluğunu33 kat artırabilecek kadar önemli ölçüde artırabilir. Bu çalışmada, kompozit NP'lerin üretimi için altın seçildi, çünkü boyut ve şekli optimize etme konusunda daha iyi bir yeteneğe sahipti, daha az sitotoksik ve ayrıca gümüşten daha kimyasal olarak inert ve sağlamdı34. Bu arada, Au yüzeylerine tutturulmuş CD kabukları, hücreler ve metal NP'ler arasındaki etkileşimleri azaltabilir33. Sonuç olarak, yukarıdaki sonuçlar, tek hücre seviyesinde analitlerin içsel bir kimyasal bileşimini sağlayabilen, invaziv olmayan ve tahribatsız bir teknik olarak etiketsiz SERS'yigöstermiştir 35.
Önceki çalışmalar, yerel parmak izi bilgilerinin bozulması durumunda uygun algılama ortamının ve zamanının kontrol edilmesinin gerekli olduğunu göstermiştir5. Bu nedenle, güvenilir spektrumlar elde etmek amacıyla hücrelerde herhangi bir hasar olmadığından emin olmak önemlidir. Diğer zorluklar şunları içerir: (1) hücre içi SERS ölçümleri için, SERS aktif Au NP'ler proteinler, lipitler veya nükleik asitler gibi hücre içi bileşenlerle etkileşime girebilir4. Bu nedenle, biyouyumluluk ve SERS sinyal atamalarının dikkate alınması gerekir; (2) SERS tespiti sırasında sürekli lazer maruziyeti hücre sitotoksisitesine veya biyonumunelere zarar verebilir; ve (3) Şekil 5A,B'de gösterildiği gibi, taşınabilir SERS platformunun hala bazı sınırlamaları vardır - Raman yoğunluğu veya tespit edilebilen sinyaller Şekil 4'te gösterildiği gibi iyi değildir.
Ek olarak, damlacık mikroakışkanları 36, derin öğrenme 37, makine öğrenimi38, katalitik firkete montajı amplifikasyon teknolojisi39 ve floresan teknolojisi 40 gibi diğer teknolojilerle birleştirildiğinde, bu entegre stratejiler SERS'nin üstünlüğünü geliştirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32071399 ve 62175071), Guangzhou Bilim ve Teknoloji Programı (2019050001), Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (2021A1515011988) ve Tıp için Optoelektronik Bilim ve Teknoloji Anahtar Laboratuvarı (Fujian Normal Üniversitesi), Çin Eğitim Bakanlığı (JYG2009) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
References
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Dong, C., et al. Simultaneous visualization of dual intercellular signal transductions via SERS imaging of membrane proteins dimerization on single cells. ACS Nano. 16 (9), 14055-14065 (2022).
- Lane, L. A., Qian, X., Nie, S. SERS nanoparticles in medicine: from label-free detection to spectroscopic tagging. Chemical Reviews. 115 (19), 10489-10529 (2015).
- Langer, J., et al. Present and future of surface-enhanced Raman scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
- Zong, C., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy for bioanalysis: reliability and challenges. Chemical Reviews. 118 (10), 4946-4980 (2018).
- Jiang, X., et al. Surface-enhanced Raman scattering-based sensing in vitro: facile and label-free detection of apoptotic cells at the single-cell level. Analytical Chemistry. 85 (5), 2809-2816 (2013).
- Qi, G., Diao, X., Hou, S., Kong, J., Jin, Y. Label-free SERS detection of protein damage in organelles under electrostimulation with 2D AuNPs-based nanomembranes as substrates. Analytical Chemistry. 94 (43), 14931-14937 (2022).
- Wang, J., et al. Trimer structures formed by target-triggered AuNPs self-assembly inducing electromagnetic hot spots for SERS-fluorescence dual-signal detection of intracellular miRNAs. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115051 (2023).
- Živanović, V., Milewska, A., Leosson, K., Kneipp, J. Molecular structure and interactions of lipids in the outer membrane of living cells based on surface-enhanced Raman scattering and liposome models. Analytical Chemistry. 93 (29), 10106-10113 (2021).
- Cong, L., et al. Microfluidic droplet-SERS platform for single-cell cytokine analysis via a cell surface bioconjugation strategy. Analytical Chemistry. 94 (29), 10375-10383 (2022).
- Tan, Z., Zhu, C., Han, L., Liao, X., Wang, C. SERS and dark-field scattering dual-mode detection of intracellular hydrogen peroxide using biocompatible Au@ COF nanosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 373, 132770 (2022).
- Pan, X. T., et al. Super-long SERS active single silver nanowires for molecular imaging in 2D and 3D cell culture models. Biosensors. 12 (10), 875 (2022).
- Liu, Z., et al. A two-dimensional fingerprint nanoprobe based on black phosphorus for bio-SERS analysis and chemo-photothermal therapy. Nanoscale. 10 (39), 18795-18804 (2018).
- Bruzas, I., Lum, W., Gorunmez, Z., Sagle, L. Advances in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrates for lipid and protein characterization: sensing and beyond. Analyst. 143 (17), 3990-4008 (2018).
- Li, D., et al. SERS analysis of carcinoma-associated fibroblasts in a tumor microenvironment based on targeted 2D nanosheets. Nanoscale. 12 (3), 2133-2141 (2020).
- Fei, X., et al. Synthesis of Au NP@MoS2quantum dots core@shell nanocomposites for SERS bio-analysis and label-free bio-imaging. Materials. 10 (6), 650 (2017).
- Li, Y., et al. Rapid label-free SERS detection of foodborne pathogenic bacteria based on hafnium ditelluride-Au nanocomposites. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 13 (5), 2041004 (2020).
- Jin, J., et al. Precisely controllable core-shell Ag@ carbon dots nanoparticles: application to in situ super-sensitive monitoring of catalytic reactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (41), 27956-27965 (2016).
- Luo, P., Li, C., Shi, G. Synthesis of gold@ carbon dots composite nanoparticles for surface enhanced Raman scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (20), 7360-7366 (2012).
- Li, L., et al. Accurate SERS monitoring of the plasmon mediated UV/visible/NIR photocatalytic and photothermal catalytic process involving Ag@carbon dots. Nanoscale. 13 (2), 1006-1015 (2021).
- Wang, X., et al. Reduced state carbon dots as both reductant and stabilizer for the synthesis of gold nanoparticles. Carbon. 64, 499-506 (2013).
- Zhu, M., et al. Physicochemical properties determine nanomaterial cellular uptake, transport, and fate. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 622-631 (2013).
- Li, L., et al. SERS monitoring of photoinduced-enhanced oxidative stress amplifier on Au@ carbon dots for tumor catalytic therapy. Light: Science & Applications. 11 (1), 286 (2022).
- Fiori, F., et al. Highly photostable carbon dots from citric acid for bioimaging. Materials. 15 (7), 2395 (2022).
- Chen, X., et al. Preparation of carbon dots-based nanoparticles and their research of bioimaging and targeted antitumor therapy. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 110 (1), 220-228 (2022).
- Chen, M., et al. Red, green, and blue light-emitting carbon dots prepared from gallic acid for white light-emitting diode applications. Nanoscale Advances. 4 (1), 14-18 (2022).
- Byram, C., Moram, S. S. B., Shaik, A. K., Soma, V. R. Versatile gold based SERS substrates fabricated by ultrafast laser ablation for sensing picric acid and ammonium nitrate. Chemical Physics Letters. 685, 103-107 (2017).
- Efrima, S., et al.
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U.
- Mushtaq, A., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) for monitoring colistin-resistant and susceptible E. coli strains. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 278, 121315 (2022).
- Mosier-Boss, P. A., Sorensen, K. C., George, R. D., Obraztsova, A. SERS substrates fabricated using ceramic filters for the detection of bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 153, 591-598 (2016).
- Zhang, P., et al. Dynamic insights into increasing antibiotic resistance in Staphylococcus aureus by label-free SERS using a portable Raman spectrometer. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 273, 121070 (2022).
- Li, J. F., Zhang, Y. J., Ding, S. Y., Panneerselvam, R., Tian, Z. Q.
- Bodelon, G., Montes-Garcia, V., Perez-Juste, J., Pastoriza-Santos, I. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy for label-free analysis of P. aeruginosa quorum sensing. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 143 (2018).
- Weiss, R., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy of microorganisms: limitations and applicability on the single-cell level. Analyst. 144 (3), 943-953 (2019).
- Oliveira, K., et al. Multiplex SERS phenotyping of single cancer cells in microdroplets. Advanced Optical Materials. 11 (1), 2201500 (2023).
- Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nature Communications. 10 (1), 4927 (2019).
- Spedalieri, C., Kneipp, J. Surface enhanced Raman scattering for probing cellular biochemistry. Nanoscale. 14 (14), 5314-5328 (2022).
- Weng, S. Y., et al. Highly sensitive and reliable detection of microRNA for clinically disease surveillance using SERS biosensor integrated with catalytic hairpin assembly amplification technology. Biosensors & Bioelectronics. 208, 114236 (2022).
- Wang, J. W., et al. Target-triggered nanomaterial self-assembly induced electromagnetic hot-Spot Generation for SERS-fluorescence dual-mode in situ monitoring MiRNA-guided phototherapy. Analytical Chemistry. 93 (41), 13755-13764 (2021).
