Summary
I denna studie utvecklade vi en billig ytförbättrad Raman-spridning (SERS)-baserad fingeravtrycksnanosond med gynnsam biokompatibilitet för att visa etikettfri bioimaging av levande celler och detektera två bakteriestammar, vilket visar i detalj hur man får SERS-spektra av levande celler i en icke-destruktiv metod.
Abstract
Ytförstärkt Raman-spridningsteknik (SERS) har väckt mer och mer uppmärksamhet inom det biomedicinska området på grund av dess förmåga att tillhandahålla molekylär fingeravtrycksinformation av biologiska prover, liksom dess potential i encellsanalys. Detta arbete syftar till att upprätta en enkel strategi för etikettfri SERS-bioanalys baserad på Au@carbon dot nanoprobes (Au@CDs). Här används polyfenol-härledda CD-skivor som reduktionsmedel för att snabbt syntetisera kärnskal Au@CD nanostrukturer, vilket möjliggör kraftfull SERS-prestanda även när koncentrationen av metylenblått (MB) är så låg som 10-9 M, på grund av den kooperativa Raman-förbättringsmekanismen. För bioanalys kan Au@CDs fungera som en unik SERS-nanosensor för att identifiera cellkomponenterna i bioprover (t.ex. cancerceller och bakterier). De molekylära fingeravtrycken från olika arter kan särskiljas ytterligare efter kombination med huvudkomponentanalysen. Dessutom möjliggör Au@CDs etikettfri SERS-avbildning för att analysera intracellulära kompositionsprofiler. Denna strategi erbjuder en genomförbar, etikettfri SERS-bioanalys, vilket öppnar upp för nya möjligheter för nanodiagnos.
Introduction
Encellsanalys är avgörande för studier av avslöjande cellulär heterogenitet och bedömning av cellens omfattande tillstånd. Cellens omedelbara svar på mikromiljön motiverar också encellsanalys1. Det finns dock vissa begränsningar för de nuvarande teknikerna. Fluorescensdetektering kan tillämpas på encellsanalys, men den begränsas av låg känslighet. Andra utmaningar uppstår från den komplicerade fluorescensbakgrunden hos celler och fluorescensfotoblekningen under långvarig bestrålning2. Ytförstärkt Ramanspridning (SERS) kan kvalificera sig när det gäller encellsanalys på grund av dess fördelar, inklusive (1) återspeglar den inneboende molekylära fingeravtrycksinformationen och den momentana situationen, (2) ultrahög ytkänslighet, (3) bekväm multiplexdetektering, (4) hög fotostabilitet, (5) detektion kan kvantifieras för jämförande analys, (6) undvikande av cellulär autofluorescens med NIR-våglängdsexcitation, (7) detektion kan utföras i en cellulär vattenhaltig miljö och (8) detektion kan riktas till en specifik region i cellen 3,4,5.
Det finns två allmänt erkända mekanismer för att förstå SERS som ett grundläggande fenomen: elektromagnetisk förbättring (EM) som en dominerande orsak och kemisk förbättring (CM). EM hänvisar till, i en given frekvens av det spännande fältet, svängningen av kollektiva elektroner drivna av elektromagnetiska vågor när frekvensen för det infallande ljuset matchar frekvensen av fria elektroner som oscillerar i metallen, vilket ger upphov till ytplasmonresonans (SPR). När lokaliserad SPR (LSPR) inträffar genom den infallande lasern som träffar metallnanopartiklarna (NP), leder det till resonansabsorption eller spridning av det infallande ljuset. Följaktligen kan den elektromagnetiska fältintensiteten hos metall NP förbättras med två till fem ordningar4. Nyckeln till den enorma förbättringen av SERS är dock inte en enda metall-NP, utan klyftan mellan två NP, vilket skapar hot spots. CM genereras från två sidor, inklusive (1) interaktioner mellan målmolekyler och metall NP och (2) målmolekyler som kan överföra elektroner till / från metall NP 4,5. Mer uttömmande detaljer finns i dessa översiktsartiklar 4,5. Flera lovande metoder för SERS biosensing och avbildning i levande celler har presenterats i tidigare litteratur, till exempel detektion av apoptotiska celler6, proteiner i organeller7, intracellulära miRNA8, cellulära lipidmembran, 9cytokiner10 och metaboliter11 i levande celler, samt identifiering och övervakning av celler genom konfokal SERS-avbildning2, 11,12,13. Intressant nog presenterar etikettfri SERS den unika fördelen med SERS, som kan beskriva interna molekylära spektra5.
Ett viktigt problem för etikettfri SERS är ett rationellt och pålitligt substrat. Typiska SERS-substrat är ädelmetall NP på grund av deras utmärkta förmåga att sprida mycket ljus14. Numera ägnas mer och mer uppmärksamhet åt nanokompositer på grund av deras anmärkningsvärda fysikaliska och kemiska egenskaper och biokompatibilitet. Mer betydelsefullt kan nanokompositer visa bättre SERS-aktivitet på grund av den intensiva EM som induceras av de heta fläckarna på nanohybriderna och ytterligare kemisk förbättring som härrör från andra icke-metalliska material15. Till exempel använde Fei et al. MoS 2 kvantprickar (QD) som reducerare för att syntetisera Au NP@MoS2QD nanokompositer för etikettfri nära infraröd (NIR) SERS-avbildning av mus 4T1 bröstcancercell (4T1-celler)16. Li et al. tillverkade också ett 2D SERS-substrat bestående av Au NP och 2D-hafniumditelluridnanoark för etikettfria SERS-mätningar av livsmedelsburna patogena bakterier17. Nyligen har kolprickar (CD), bra elektrondonatorer, använts som reduktionsmedel utan andra reduktionsmedel eller bestrålning för att syntetisera Au@carbon punktnanoprober (Au@CDs)18, som har rapporterats vara effektiva material för att förbättra SERS-aktiviteten baserat på laddningsöverföringseffekten (CT) mellan Au-kärnor och CD-skal 19,20. Mer än så erkänns CD-skivor som täckmedel och stabilisator för att förhindra att Au NP aggregerar21. Dessutom öppnar det fler möjligheter för reaktioner med analyter, eftersom det kan ge ett stort antal bindande och aktiva platser20. Genom att utnyttja ovanstående utvecklade Jin et al. en snabb och kontrollerbar metod för att tillverka Ag@CD NP med unika SERS-egenskaper och utmärkta katalytiska aktiviteter för övervakning av heterogena katalytiska reaktioner i realtid18.
Här demonstrerades en enkel och billig metod för tillverkning av kärnskal Au@CD SERS-substrat för att identifiera cellulära komponenter och etikettfri SERS-bioimaging, samt för att detektera och differentiera Escherichia coli (E. coli) och Staphylococcus aureus (S. aureus), vilket är lovande för tidig diagnos av sjukdom och en bättre förståelse av cellulära processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillverkning av Au@CDs
OBS: Figur 1 illustrerar ett tillverkningsförfarande för Au@CDs.
- Bered CD-lösning med citronsyra (CA) och gallinsyra (GA) via en typisk hydrotermisk behandlingsprocedur18. Tillsätt 100 μl 3,0 mg ml-1 av den beredda CD-lösningen i 200 μl 10 mM klorauriksyra (HAuCl4) (se materialtabell) vid rumstemperatur i 10 s tills en lila suspension produceras.
- Centrifugera den lila suspensionen vid 4 000 × g i 10 minuter vid rumstemperatur och avlägsna försiktigt supernatanten med en pipett om det är svårt att ta bort Au@CD kolloider.
- Återsuspendera Au@CDs med 200 μL avjoniserat vatten (resistivitet på 18,2 MΩcm) för att tvätta överflödiga CD-skivor.
- Upprepa steg 1.2 och få NP i kärnhöljet, återdispergerade i 100 μl avjoniserat vatten och lagra vid 4 °C. NP kan lagras i 1 månad.
2. Karakterisering av Au@CDs
- Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Låt CD-skivan och Au@CD proverna över natten vid -80 °C frysa ur en fryst lösning och krossa efter frystorkning till pulver.
- Sprid de erhållna pulverproverna i det avjoniserade vattnet på ett adekvat sätt genom ultraljudsbehandling, vid 100% effekt, i 5 min.
- Släpp några droppar av provsuspensionen på ett Cu-belagt TEM-galler täckt med en lacey kolfilm och ta bilder efter torkning med ett transmissionselektronmikroskop vid en 200 kV accelerationsspänning (se materialtabell).
- Fouriertransform infraröd spektroskopi (FT-IR)
- Upprepa steg 2.1.1 för att erhålla effektprover, mal några förtorkade Bcr-partiklar till pulver i en mortel, tillsätt en nypa av provet och blanda med Kbr-pulvret samtidigt för IR-karakterisering16.
- Ultraviolett-synlig-nära infraröd (UV-vis-NIR) absorbansspektroskopi
- Bered suspensionen av CD-skivor och Au@CDs med rätt koncentration för att säkerställa att absorbansen är mindre än en och utför UV-vis-NIR-karakterisering16.
- Raman spektra
- Slå på 785 nm halvledarlaser, med en lasereffekt på 10 mW och invändningsförstoring på 20x. Ställ in exponeringstiden på 5 s och ackumuleringstalet på tre.
- Tillsätt en lika stor volym beredda Au@CDs prover till 5 μl lösning av metylenblått (MB) och blanda noggrant.
- Placera en droppe suspension på mässingssubstratet för att samla upp SERS-spektra.
3. Cellodling
- Odla humana epiteliala lungkarcinomceller (A549-celler, passerade i laboratoriet) i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin och inkubera i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5% CO2.
- Frö cellerna i 96-brunnsplattor (1 × 105 celler / brunn) och behandla med Au@CDs i olika koncentrationer i intervallet 20-100 μM. Använd ett CCK-8-analyskit för att mäta cellviabiliteten (se materialtabell). Tre oberoende dubbletter används i varje behandling.
- Fortsätt att utföra SERS-experimenten genom att följa stegen nedan:
- Lägg ett sterilt safirchip (se materialtabell) i plattorna med 12 brunnar och frö sedan cellerna på en enda brunn med 1 ml medium. Inkubera plattorna i en fuktad inkubator vid 37 °C med 5 %CO2över natten för att nå 70–80 % sammanflöde.
- Tillsätt Au@CDs i den enda brunnen och inkubera i 4-6 timmar.
OBS: Före inkubation, testa stabiliteten hos substrat, särskilt lösningsfas NP. Dessa material är känsliga för nedbrytning genom upplösnings-, aggregerings- och sedimenteringsprocesser under lagring och användning, vilket kan minska EM-förluster och minska SERS-aktiviteten. Mer betydelsefullt, för cellulärt upptag, kan det till stor del påverkas av storleken på NP22. - Under inkubationen kommer substrat in i cellerna genom endocytosiskt upptag. Efter inkubation, observera cellerna under ett optiskt mikroskop tills några svarta partiklar ses inuti cellerna.
OBS: Om SERS-intensiteten är svag, försök att öka Au@CD koncentration eller förlänga inkubationstiden. - Ta bort mediet, skölj försiktigt safirflisen med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och doppa dem i PBS för SERS-detektion16.
4. Cell SERS-experiment
- Öppna datorn, slå på Raman-spektrometern, starta programvaran och slå sedan på 785 nm-lasern (se materialtabell).
- Klicka på Ny mätning och starta en ny spektralförvärv. Kalibrera17 med kiselskivor före provmätning.
- Ta en 20x objektiv för att säkerställa att en tydlig mobilbild observeras och ändra sedan objektivlinsen till 50x. Ställ in lasereffekten från låg till hög och lämplig exponeringstid och ansamlingar.
OBS: Innan SERS-mätning, kontrollera lämplig lasereffekt för att förhindra irreversibel cellskada och se till att förvärvsparametrarna är konsekventa. SERS-intensitet är relaterad till lasereffekt, spotstorlek, ackumulering och exponeringstid. - Välj en punkt med celler som ska mätas och klicka på Kör. Varje cell mäts med 20 fläckar och 10 celler mäts för att ta medelvärdet.
OBS: Intracellulära komponenter är komplicerade, vilket leder till stor skillnad i spektra. Ta därför spektra i liknande cellulära regioner och ta så många spektra som möjligt. - Spara spektra.
- Klicka på Ny Streamline-bildförvärv, klicka sedan på Videogranskning, välj det intervall som ska fotograferas och klicka på OK. Ställ in parametrarna: 785 nm kantströmlinje, centrum på 1 200 cm-1, exponeringstid på 5 s, ansamlingar på tre och lasereffekt på 50 %.
- Klicka på New of Living imaging, välj Signal till baslinje, ställ in intervallet från första gränsen 625 till andra gränsen 1 700 och klicka sedan på Area setup. Ställ sedan in rätt steg och klicka på Apply och OK. Klicka slutligen på Kör för att börja utföra SERS-avbildning.
5. Bakteriekultur och SERS-mätningar
- Späd över natten kulturer av E. coli och S. aureus (1:100) i 5 ml av det nya Luria-Bertani (LB) mediet (se materialtabell). Efter tillväxt vid 37 °C till A600 0,4 till 0,6, centrifugera kulturen vid 5 000 × g i 5 minuter för att pellet cellerna.
- Suspendera pelletsen igen i 1 ml PBS följt av en 5 min 5 000 × g centrifugering (vid rumstemperatur) två gånger.
- Blanda bakteriekulturen med Au@CDs och observera blandningen direkt under SERS-plattformen.
6. Analys av data
- Jämna ut spektra och korrigera baslinjen.
- Utför principalkomponentanalys (PCA)16 med bearbetade data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillverkning av Au@CDs illustreras i figur 1. CD-skivorna framställdes från CA och GA via en typisk hydrotermisk process18. Au@CDs syntetiserades snabbt genom att reducera HAuCl4 med CD-skivor i vattenhaltiga medier vid rumstemperatur. Storleken och morfologin hos CD-skivor och Au@CDs kan observeras med TEM och högupplöst (HR) TEM23. De förberedda CD-skivorna är monodispergerade med små storlekar på nästan 2-6 nm (figur 2A). Den sfäriska Au-kärnan är belagd med ett CD-hölje på cirka 2,1 nm (figur 2B, C och kompletterande figur 1).
För att bekräfta strukturerna hos CD-skivor och Au@CDs registrerades FT-IR-spektra för att analysera de organiska funktionella grupperna (figur 2D). Bandet vid 3 000-3 600/2 500-2 800 cm-1, 1 251/1 629 cm-1 och 1 471 cm-1 kan tilldelas O-H-sträckningsvibration, C = O-sträckningsvibration respektive C-O-sträckningsvibration 24,25. Det sträckande vibrationsbandet vid 1 741 cm-1 är också relaterat till C-C24. Några av dessa funktionella grupper från GA och CA finns också i CD-skivor och Au@CDs, vilket tyder på en framgångsrik syntes av NP. UV-visabsorptionsspektra av CD-skivor har en karakteristisk topp vid 265 nm, vilket indikerar en isolerad aromatisk struktur i kolkärnorna26, som försvinner vid reduktion. Spektrumet av Au@CDs uppvisar en karakteristisk topp vid 545 nm, vilket är associerat med SPR-absorptionsbandet för Au-kärnan, vilket indikerar tillverkning av den sammansatta nanostrukturen (figur 2E).
Som visas i figur 3A,B uppvisar Au@CDs utmärkta SERS-prestanda jämfört med Au NPs, även när koncentrationen av MB är så låg som 10-9 M. Förstärkningsfaktorn (EF) kan beräknas med följande ekvation16, där I SERS och I 0 avser Ramanintensiteterna för SERS-spektrumet respektive normal Raman, och C SERS och C0 avser koncentrationerna av substratmolekylerna som används för SERS- respektive Raman-mätningar. Om man tar 1 620 cm-1 MB att beräkna är EF för Au@CDs nästan 2,1 × 105, vilket är ungefär tre gånger starkare än för Au NP (6,8 × 104).
Några karakteristiska toppar kan detekteras, såsom 770 cm-1 (böjning av C-H i plan), 1 398 cm-1 (symmetrisk sträckning av C-N) och 1 625 cm-1 (C-C-ringsträckning), vilket överensstämmer med rapporterad litteratur27. Samtidigt detekteras 10-5 M till 10-9 M MB, med SERS-bandet vid 1,620 cm-1 för kvantifiering; det linjära förhållandet definieras som y = 0,2437x + 2,1756 (R2 = 0,9922) (figur 3B). Förutom känslighet är reproducerbarhet och långsiktig stabilitet båda viktiga indikatorer för SERS-substrat. Därför förvärvades SERS-spektra slumpmässigt på 20 punkter och uppvisade hög likhet mellan dem (figur 3C, D); fyra spektra samlades in under 1 månad, de karakteristiska topparna av MB detekterades fortfarande 1 månad efter placering vid 4 ° C, och den genomsnittliga SERS-aktiviteten vid 950 cm-1, 1 185 cm-1 och 1 620 cm-1 visade endast en grad av sönderfall på cirka 5,43%, 11,44% respektive 13,94% (figur 3E), vilket indikerar god reproducerbarhet och långsiktig stabilitet hos Au@CD substrat.
I de aktuella SERS-mätningarna av celler testades först cytotoxiciteten hos NP. Au@CDs (20-100 μM) visade knappt cytotoxicitet för A549-celler (figur 3F). Ovanstående resultat tyder på den höga potentialen hos Au@CDs som ska tillämpas på etikettfria SERS-mätningar i levande celler. Som visas i figur 4 ger det Au@CD-monterade SERS-substratet integrerad SERS-kartläggning av cellkomponenterna från 800 till 1 700 cm-1. Det har observerats att Au@CD NP-aggregat uppvisar uppenbara SERS-signaler utan brusbakgrund i SERS-kartläggningen av A549-celler (figur 4B). Tre spektra från olika celpunkter visas i figur 4C, som visar heterogeniteten hos komponenter i olika cytoplasmatiska regioner och överlägsenheten hos Au@CDs som SERS-sonder för encellsanalys. Det genomsnittliga spektrumet för A549-celler visas i figur 4A, och riklig cellulär information kan observeras. Detaljerade karakteristiska topptilldelningar finns i tabell 1.
Dessutom visar Au@CDs också en god förmåga att upptäcka och differentiera två bakteriestammar. De erhållna spektra är ganska lika den publicerade litteraturen för E. coli och S. aureus, såsom fenylalanin vid 1 030 cm-1 och en ringandning av nukleinsyra vid 741 cm-1 (figur 5A, B), vilket verifierar tillförlitligheten hos SERS-mätningar 28. Detaljerade karakteristiskatopptilldelningar 28,29,30,31 finns i tabell 2. PCA-modellen diskriminerar också bra (figur 5C, D).
Figur 1: Schematisk illustration av syntesvägen för Au@CDs. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativ karakterisering av CD-skivor och Au@CDs. (A) HRTEM-bild av CD-skivor. Skalstång: 10 nm. (B) TEM-bild av Au@CDs. Skalstång: 100 nm. (C) HRTEM-bild av gränssnittsregionen Au@CDs. Skalstång: 10 nm; insats: 2 nm. (D) FT-IR-spektra för råa GA-, CA- och as-preparerade CD-skivor och Au@CDs. E) UV-vis-absorptionsspektra för CD-skivor, Au NP och Au@CDs. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: SERS-verksamhet Au@CDs. (A) SERS-spektra för bulk-MB (10-5 M, svart linje) och 10-9 M MB-lösningen (blå linje och grön linje). b) SERS-spektra för MB vid olika koncentrationer (10-9-10-5 M). Infoga: Det linjära förhållandet mellan SERS-bandet vid 1 620 cm-1 MB, y = 0,2437x + 2,1756 (R2 = 0,9922). Resultat av SERS-substratreproducerbarhet (C), histogram för relativ standardavvikelse (RSD) (1 620 cm-1 topp av MB vid 10-7 M) (D) och långsiktig stabilitet (E) experiment. F) A549-cellernas cellviabilitet efter 24 timmars inkubation med Au@CD koncentrationsgradient. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Fingeravtrycksanalys och etikettfri SERS-avbildning av A549-celler. (A) Genomsnittligt SERS-spektrum för A549-celler. (B) Det ljusa fältet, SERS-kartläggning och sammanslagna bilder av A549-cellerna. Skalstänger: 20 μm. (C) SERS-spektra för olika cellpunkter markerade i den sammanslagna bilden av 1, 2 och 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Fingeravtrycksanalys av två bakteriestammar. Medelvärdet av SERS-spektra för E. coli (A) och S. aureus (B). 2D PCA (C) och 3D PCA (D) på differentialanalys av två bakteriestammar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Uppgifter för Raman-topparna i A549-celler. Förkortningar: Pro = proline; HYP = hydroxiprolin; Tyr = tyrosin; Trp = trypotofan; Phe = fenylalanin; A = adenin; T = tymin; C = cytosin; G = guanin; böjning = böjning; str = sträckning; def = deformation; vridning = vridning; andning = andning; wag = viftning; sym = symmetrisk; asym = asymmetrisk; BK = ryggrad. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Uppgifter för Raman-topparna hos E. coli och S. aureus. Förkortningar: Tyr = tyrosin; Phe = fenylalanin; A = adenin; G = guanin; str = sträckning; def = deformation; andning = andning; sym = symmetrisk. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande figur 1: Dynamisk ljusspridningsstudie av Au@CDs. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammanfattningsvis har Au@CDs med ett ultratunt CD-skal på 2,1 nm framgångsrikt tillverkats. Nanokompositerna visar överlägsen SERS-känslighet än rena Au NP. Dessutom har Au@CDs utmärkt prestanda i reproducerbarhet och långsiktig stabilitet. Ytterligare forskning inkluderar att ta Au@CDs som substrat för att utföra SERS-avbildning av A549-celler31 och för att detektera två bakteriestammar32. Det har bevisats att Au@CDs kan användas som en ultrakänslig SERS-sond huvudsakligen baserat på den kemiska förbättringen mellan Au NP och CD-skivor.
Det finns några viktiga punkter under SERS-mätningar i föregående protokoll. För det första, innan Au@CDs appliceras i celler och bakterieprover, är det nödvändigt att säkerställa en överlägsen SERS-substratformel samt rätt koncentration, som kan verifieras av färgämnesmolekyler. Därefter är SERS-spektrumet inkonsekvent vid varje cellulär punkt eftersom de biologiska proverna är komplexa och dynamiska.
Om du tar en större laserfläck kommer SERS-spektrumet från olika punkter att vara mer lika. Observera att SERS-spektrumet för samma cellulära punkt kanske inte överensstämmer med olika lasereffekt. Det är väl accepterat att det genomsnittliga SERS-spektrumet av biologiska prover är konsekvent; därför är det viktigt att få SERS-spektrumet i samma cellulära regioner så mycket som möjligt och sedan i genomsnitt flera olika cellulära regioner. Dessutom påverkas intracellulär SERS-detekteringskänslighet lätt av bakgrundssignaler. Raman-bakgrundssignalerna kommer huvudsakligen från tre aspekter, inklusive (1) ett substrat, såsom safir, kiselskiva och så vidare, (2) en SERS-sond och (3) biologiska prover. Följaktligen rekommenderas att välja substrat utan bakgrundsbrus när det är möjligt, även om detta är svårt.
Jämfört med konventionell Raman-spektroskopi kan SERS avsevärt förbättra signalintensiteten med flera storleksordningar33. I detta arbete valdes guld för tillverkning av sammansatta NP eftersom det hade en bättre förmåga att optimera storlek och form, eftersom det var mindre cytotoxiskt samt mer kemiskt inert och robust än silver34. Samtidigt kan CD-skal fästa på Au-ytor minska interaktionerna mellan celler och metall NP33. Sammanfattningsvis visade ovanstående resultat etikettfri SERS som en icke-invasiv och icke-destruktiv teknik, som kan ge en inneboende kemisk sammansättning av analyter på en encellsnivå35.
Tidigare studier har visat att det är viktigt att kontrollera lämplig detektionsmiljö och tid i händelse av förvrängning av ursprunglig fingeravtrycksinformation5. Därför är det viktigt att se till att det inte finns några skador på cellerna, i syfte att erhålla tillförlitliga spektra. Andra utmaningar inkluderar: (1) för intracellulära SERS-mätningar kan SERS-aktiva Au NP interagera med intracellulära komponenter såsom proteiner, lipider eller nukleinsyror4. Därför måste biokompatibilitet och SERS-signaltilldelningar övervägas. (2) konstant laserexponering under SERS-detektion kan skada cellcytotoxiciteten eller bioproverna; och (3) som visas i figur 5A, B har den bärbara SERS-plattformen fortfarande vissa begränsningar - antingen Raman-intensitet eller signaler som kan detekteras är inte bra som det som visas i figur 4.
Dessutom, i kombination med andra tekniker som droppmikrofluidik 36, djupinlärning37, maskininlärning 38, katalytisk hårnålsmonteringsförstärkningsteknik39 och fluorescensteknik40, kan dessa integrerade strategier utveckla SERS: s överlägsenhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (32071399 och 62175071), Science and Technology Program of Guangzhou (2019050001), Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2021A1515011988) och Open Foundation of the Key Laboratory of Optoelectronic Science and Technology for Medicine (Fujian Normal University), utbildningsministeriet, Kina (JYG2009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS buffer (Cell culture) | Langeco Technology | BL316A | |
| 6 well cell culture plate | LABSELECT | 11110 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | GLPBIO | GK10001 | |
| Citric acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | C108869 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Constant temperature magnetic agitator | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Cryogenic high speed centrifuge | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| DMEM high glucose cell culture medium | Procell | PM150210 | |
| Electronic balance | Sartorius Scientific Instruments | SQP | |
| Enzyme marker | Thermo Fisher Technologies | 3111 | |
| Fetal bovine serum | Zhejiang Tianhang Biological Technology | 11011-8611 | |
| Figure 1 | Figdraw. | ||
| Fourier infrared spectrometer | Thermo, America | Nicolet 380 | |
| Freeze dryer | Tecan | Infinite F50 | |
| Gallic acid | Shanghai Aladdin Biochemical Technology | G104228 | |
| Handheld Raman spectrometer | OCEANHOOD, Shanghai, China | Uspectral-PLUS | |
| HAuCl4 | Guangzhou Pharmaceutical Company (Guangzhou) | ||
| High resolution transmission electron microscope | Thermo Fisher Technologies | FEI Tecnai G2 Spirit T12 | |
| High temperature autoclave | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S  |
|
| Inverted microscope | Nanjing Jiangnan Yongxin Optical | XD-202 | |
| LB Broth BR | Huankai picoorganism | 028320 | |
| Medical ultra-low temperature refrigerator | Thermo Fisher Technologies | ULTS1368 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | ||
| Pancreatin Cell Digestive Solution | beyotime | C0207 | |
| Penicillin streptomycin double resistance | Shanghai Boxun | YXQ-LS-50S |
|
| Pure water meter | Millipore, USA | Milli-Q System | |
| Raman spectrometer | Renishaw | ||
| Sapphire chip | beyotime | ||
| Thermostatic water bath | Changzhou Noki | ||
| Ultra-clean table | Shanghai Boxun | SW-CJ-2FD | |
| Uv-visible light absorption spectrometer | MADAPA, China | UV-6100S | |
| Wire 3.4 | Renishaw |
References
- Zenobi, R. Single-cell metabolomics: analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
- Dong, C., et al. Simultaneous visualization of dual intercellular signal transductions via SERS imaging of membrane proteins dimerization on single cells. ACS Nano. 16 (9), 14055-14065 (2022).
- Lane, L. A., Qian, X., Nie, S. SERS nanoparticles in medicine: from label-free detection to spectroscopic tagging. Chemical Reviews. 115 (19), 10489-10529 (2015).
- Langer, J., et al. Present and future of surface-enhanced Raman scattering. ACS Nano. 14 (1), 28-117 (2020).
- Zong, C., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy for bioanalysis: reliability and challenges. Chemical Reviews. 118 (10), 4946-4980 (2018).
- Jiang, X., et al. Surface-enhanced Raman scattering-based sensing in vitro: facile and label-free detection of apoptotic cells at the single-cell level. Analytical Chemistry. 85 (5), 2809-2816 (2013).
- Qi, G., Diao, X., Hou, S., Kong, J., Jin, Y. Label-free SERS detection of protein damage in organelles under electrostimulation with 2D AuNPs-based nanomembranes as substrates. Analytical Chemistry. 94 (43), 14931-14937 (2022).
- Wang, J., et al. Trimer structures formed by target-triggered AuNPs self-assembly inducing electromagnetic hot spots for SERS-fluorescence dual-signal detection of intracellular miRNAs. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115051 (2023).
- Živanović, V., Milewska, A., Leosson, K., Kneipp, J. Molecular structure and interactions of lipids in the outer membrane of living cells based on surface-enhanced Raman scattering and liposome models. Analytical Chemistry. 93 (29), 10106-10113 (2021).
- Cong, L., et al. Microfluidic droplet-SERS platform for single-cell cytokine analysis via a cell surface bioconjugation strategy. Analytical Chemistry. 94 (29), 10375-10383 (2022).
- Tan, Z., Zhu, C., Han, L., Liao, X., Wang, C. SERS and dark-field scattering dual-mode detection of intracellular hydrogen peroxide using biocompatible Au@ COF nanosensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 373, 132770 (2022).
- Pan, X. T., et al. Super-long SERS active single silver nanowires for molecular imaging in 2D and 3D cell culture models. Biosensors. 12 (10), 875 (2022).
- Liu, Z., et al. A two-dimensional fingerprint nanoprobe based on black phosphorus for bio-SERS analysis and chemo-photothermal therapy. Nanoscale. 10 (39), 18795-18804 (2018).
- Bruzas, I., Lum, W., Gorunmez, Z., Sagle, L. Advances in surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) substrates for lipid and protein characterization: sensing and beyond. Analyst. 143 (17), 3990-4008 (2018).
- Li, D., et al. SERS analysis of carcinoma-associated fibroblasts in a tumor microenvironment based on targeted 2D nanosheets. Nanoscale. 12 (3), 2133-2141 (2020).
- Fei, X., et al. Synthesis of Au NP@MoS2quantum dots core@shell nanocomposites for SERS bio-analysis and label-free bio-imaging. Materials. 10 (6), 650 (2017).
- Li, Y., et al. Rapid label-free SERS detection of foodborne pathogenic bacteria based on hafnium ditelluride-Au nanocomposites. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 13 (5), 2041004 (2020).
- Jin, J., et al. Precisely controllable core-shell Ag@ carbon dots nanoparticles: application to in situ super-sensitive monitoring of catalytic reactions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (41), 27956-27965 (2016).
- Luo, P., Li, C., Shi, G. Synthesis of gold@ carbon dots composite nanoparticles for surface enhanced Raman scattering. Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (20), 7360-7366 (2012).
- Li, L., et al. Accurate SERS monitoring of the plasmon mediated UV/visible/NIR photocatalytic and photothermal catalytic process involving Ag@carbon dots. Nanoscale. 13 (2), 1006-1015 (2021).
- Wang, X., et al. Reduced state carbon dots as both reductant and stabilizer for the synthesis of gold nanoparticles. Carbon. 64, 499-506 (2013).
- Zhu, M., et al. Physicochemical properties determine nanomaterial cellular uptake, transport, and fate. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 622-631 (2013).
- Li, L., et al. SERS monitoring of photoinduced-enhanced oxidative stress amplifier on Au@ carbon dots for tumor catalytic therapy. Light: Science & Applications. 11 (1), 286 (2022).
- Fiori, F., et al. Highly photostable carbon dots from citric acid for bioimaging. Materials. 15 (7), 2395 (2022).
- Chen, X., et al. Preparation of carbon dots-based nanoparticles and their research of bioimaging and targeted antitumor therapy. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 110 (1), 220-228 (2022).
- Chen, M., et al. Red, green, and blue light-emitting carbon dots prepared from gallic acid for white light-emitting diode applications. Nanoscale Advances. 4 (1), 14-18 (2022).
- Byram, C., Moram, S. S. B., Shaik, A. K., Soma, V. R. Versatile gold based SERS substrates fabricated by ultrafast laser ablation for sensing picric acid and ammonium nitrate. Chemical Physics Letters. 685, 103-107 (2017).
- Efrima, S., et al.
- Movasaghi, Z., Rehman, S., Rehman, I. U.
- Mushtaq, A., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) for monitoring colistin-resistant and susceptible E. coli strains. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 278, 121315 (2022).
- Mosier-Boss, P. A., Sorensen, K. C., George, R. D., Obraztsova, A. SERS substrates fabricated using ceramic filters for the detection of bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 153, 591-598 (2016).
- Zhang, P., et al. Dynamic insights into increasing antibiotic resistance in Staphylococcus aureus by label-free SERS using a portable Raman spectrometer. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 273, 121070 (2022).
- Li, J. F., Zhang, Y. J., Ding, S. Y., Panneerselvam, R., Tian, Z. Q.
- Bodelon, G., Montes-Garcia, V., Perez-Juste, J., Pastoriza-Santos, I. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy for label-free analysis of P. aeruginosa quorum sensing. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 143 (2018).
- Weiss, R., et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy of microorganisms: limitations and applicability on the single-cell level. Analyst. 144 (3), 943-953 (2019).
- Oliveira, K., et al. Multiplex SERS phenotyping of single cancer cells in microdroplets. Advanced Optical Materials. 11 (1), 2201500 (2023).
- Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nature Communications. 10 (1), 4927 (2019).
- Spedalieri, C., Kneipp, J. Surface enhanced Raman scattering for probing cellular biochemistry. Nanoscale. 14 (14), 5314-5328 (2022).
- Weng, S. Y., et al. Highly sensitive and reliable detection of microRNA for clinically disease surveillance using SERS biosensor integrated with catalytic hairpin assembly amplification technology. Biosensors & Bioelectronics. 208, 114236 (2022).
- Wang, J. W., et al. Target-triggered nanomaterial self-assembly induced electromagnetic hot-Spot Generation for SERS-fluorescence dual-mode in situ monitoring MiRNA-guided phototherapy. Analytical Chemistry. 93 (41), 13755-13764 (2021).
