Analyse von Wirtszellproteinen unter Verwendung von Anreicherungskügelchen in Verbindung mit begrenztem Verdau

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll zur Anreicherung von Wirtszellproteinen (HCPs) aus Arzneimitteln (DP) und zum Nachweis von Peptiden mit Hilfe von Proteom-Anreicherungskügelchen vorgestellt. Die Methode wird anhand eines selbst hergestellten monoklonalen Antikörpers (mAb) Drug Substance (DS) demonstriert, der ein gut charakterisiertes Referenzmaterial für die Bewertung und den Vergleich verschiedener Methoden in Bezug auf die Leistung darstellt.

Zusammenfassung

Wirtszellproteine (HCPs) sind Verunreinigungen, die sich bereits in geringen Mengen negativ auf therapeutische Proteine auswirken können. Um die potenziellen Risiken im Zusammenhang mit Arzneimitteln zu bewerten, wurden Methoden entwickelt, um HCPs mit geringer Häufigkeit zu identifizieren. Ein entscheidender Ansatz für die Entwicklung einer sensitiven HCP-Nachweismethode besteht darin, HCPs anzureichern und gleichzeitig monoklonale Antikörper (mAbs) vor der Analyse mit Hilfe der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) zu entfernen.

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Anreicherung von Wirtszellproteinen mit kommerziell erhältlichen Proteom-Anreicherungskügelchen. Diese Kügelchen enthalten eine vielfältige Bibliothek von Hexapeptid-Liganden mit spezifischen Affinitäten für verschiedene Proteine. Das Protokoll umfasst auch einen begrenzten Aufschluss und die anschließende Peptiddetektion mittels Nano-LC-MS/MS. Durch den Einsatz dieser Techniken können HCPs mit geringer Häufigkeit über 7000-fach angereichert werden, was zu einer beeindruckenden Nachweisgrenze von nur 0,002 ppm führt. Bezeichnenderweise ermöglicht dieses Protokoll die Erkennung von 850 HCPs mit einem hohen Maß an Zuverlässigkeit unter Verwendung eines NIST-mAbs. Darüber hinaus ist es benutzerfreundlich gestaltet und enthält eine Videodemonstration, die bei der Implementierung hilft. Durch die Befolgung dieser Schritte können Forscher HCPs effektiv anreichern und nachweisen und so die Sensitivität und Genauigkeit der Risikobewertung für Arzneimittel verbessern.

Einleitung

Wirtszellproteine (HCPs) sind Verunreinigungen, die aus der Zellkultur des Wirtsorganismus freigesetzt und mit monoklonalen Antikörpern (mAb) gereinigt werden1,2,3,4. Spurenkonzentrationen von HCPs können sich negativ auf die Qualität des Arzneimittels^auswirken 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, und daher ist eine empfindliche HCP-Analysemethode erforderlich, um HCPs in Sub-ppm- bis ppm-Konzentrationen nachzuweisen.

Orthogonale Methoden können angewendet werden, um HCPs in geringer Häufigkeit zu detektieren. Der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) wird im Allgemeinen zur Quantifizierung der gesamten HCPs verwendet und kann auch einzelne HCPs nachweisen und quantifizieren, wenn die entsprechenden Antikörper verfügbar sind¹⁶. Die Herstellung von HCP-spezifischen Antikörpern ist jedoch zeit- und arbeitsintensiv. Im Gegensatz dazu kann die Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie (LC-MS) umfassende Informationen über einzelne HCPs in mAb-Arzneimitteln liefern und wird häufig für die HCP-Identifizierung eingesetzt 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20^, 21,22,23,24,25,26,27.

Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um HCPs mit LC-MS/MS nachzuweisen, darunter begrenzter Aufschluss²⁰, Filtration¹⁷, Protein-A-Deletion²¹, Immunpräzipitation (IP) und ProteoMiner-Anreicherung (PM)¹⁸. Die meisten Methoden zielen darauf ab, die Menge an mAb zu reduzieren und HCPs vor der LC-MS/MS-Analyse anzureichern, wodurch der dynamische Bereich zwischen mAb-Peptiden und HCP-Peptiden verringert wird. Dieses Protokoll stellt eine proteomische Probenanreicherungsmethode vor, die die ProteoMiner-Technologie und den begrenzten Aufschluss (PMLD) ^kombiniert28. Das Prinzip der ProteoMiner-Anreicherung beinhaltet die Verwendung kommerziell erhältlicher Proteom-Anreicherungskügelchen, die eine vielfältige Bibliothek kombinatorischer Peptidliganden enthalten. Diese Liganden binden spezifisch an Proteine auf Antikörper-Wirkstoff-Produkten und ermöglichen so die Entfernung überschüssiger Moleküle, während Wirtszellproteine (HCPs) mit geringer Häufigkeit auf ihre jeweiligen Affinitätsliganden konzentriert werden. Auf der anderen Seite beinhaltet das Prinzip der begrenzten Verdauung die Verwendung einer niedrigen Konzentration von Trypsin. Diese Konzentration reicht aus, um HCPs mit geringer Häufigkeit zu verdauen, aber nicht genug, um alle Antikörper-Wirkstoffprodukte zu verdauen. Dieser Ansatz ermöglicht die Rückgewinnung und Anreicherung von verdauten HCP-Peptiden aus der Lösung.

Im Vergleich zu Filtrationsverfahren ist die PMLD-Technik nicht durch die Größe der detektierten HCPs¹⁷ begrenzt. Protein-A-Deletionsmethoden sind spezifisch für den Nachweis von HCPs, die mit Antikörpern assoziiert sind²¹, während die Immunpräzipitation auf vordefinierte HCPs aus einer bestimmten Zelllinie (z. B. der Zelllinie des chinesischen Hamster-Eierstocks (CHO)) beschränkt ist, bei der ein Anti-HCP-Antikörper erzeugt wurde⁴. Im Gegensatz dazu kann PMLD zum Nachweis von HCPs aus beliebigen Wirkstoffmodulen und Wirtszellproteinen eingesetzt werden, die mit Arzneimitteln aus verschiedenen Zelllinien gereinigt wurden. Darüber hinaus weist PMLD eine bessere Sensitivität im Vergleich zu den genannten Methoden auf 17,18,20,21,24.

Dieser Ansatz kann die HCP-Konzentration um das 7000-fache anreichern und die Nachweisgrenze auf 0,002 ppm senken²⁸. Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 1 dargestellt.

Protokoll

Die im Protokoll verwendeten Abkürzungen sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt.

1. Herstellung von Lösungen und Puffern

HINWEIS: Die kommerziellen Details aller Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Bereiten Sie 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 Lösung vor, indem Sie 1 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 in 9 ml deionisiertes Wasser in einem Glasfläschchen hinzufügen und durch Wirbeln gut mischen. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
2. Bereiten Sie 24 mM Natriumdesoxycholat (SDC) vor, indem Sie 10 mg SDC in 1 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 auflösen.
3. Bereiten Sie 24 mM Natriumlauroylsarcosinat (SLS) vor, indem Sie 7 mg SLS in 1 ml 0,1 M Tris-HCl mit einem pH-Wert von 8,0 auflösen.
4. Bereiten Sie den Elutionspuffer vor, indem Sie 24 mM SDC und 24 mM SLS in einem Verhältnis von 1:1 (v/v) mischen.
5. Bereiten Sie 50 ng/μl Trypsinlösung vor, indem Sie 400 μl deionisiertes Wasser in 20 μg Trypsin geben.
6. Bereiten Sie 25 mg/ml Dithiothreitol (DTT) vor, indem Sie 308 μl 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, in 7,7 mg DTT zugeben.
7. Bereiten Sie 0,25 M Jodacetamid (IAM) vor, indem Sie 1,2 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, in 56 mg IAM geben.
8. Bereiten Sie 10 % TFA vor, indem Sie 1 ml Trifluoressigsäure (TFA) in 9 ml deionisiertes Wasser geben. 4 s lang einen Wirbel ziehen und dann runterdrehen. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
9. Bereiten Sie Puffer A vor, indem Sie 1 ml 10 % TFA in 99 ml deionisiertes Wasser geben.
10. Bereiten Sie Puffer B vor, indem Sie 1 ml 10 % TFA und 49 ml deionisiertes Wasser in 50 ml Acetonitril (ACN) geben.
11. Bereiten Sie 10 mM Histidinpuffer vor, indem Sie 37 mg L-Histidin und 54,8 mg L-Histidinmonohydrochlorid-Monohydrat in 50 ml Wasser geben.

2. Herstellung von Lösungen für monoklonale Antikörper (mAb)

1. Bei Arzneimitteln mit Konzentrationen über 50 mg/ml werden 15 mg des monoklonalen Antikörpers (mAb) (siehe Materialtabelle) mit deionisiertem Wasser in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen verdünnt, was zu einem Gesamtvolumen von 300 μl und einem endgültigen pH-Wert von ~6 führt. Passen Sie bei Bedarf den pH-Wert mit Essigsäure oder Tris-HCl an.
2. Bei Arzneimitteln mit Konzentrationen unter 50 mg/ml ist der Pufferaustausch gemäß den Schritten 2.2.1 bis 2.2.5 durchzuführen.
   1. 20 mg jeder Probe werden in ein 10k-Zentrifugalfiltergerät (siehe Materialtabelle) überführt und bei 14.000 x g für 25 Minuten (bei Raumtemperatur, RT) zentrifugiert, bis ein Volumen von ca. 100 μl übrig bleibt.
   2. 350 μl 10 mM Histidin (siehe Materialtabelle), pH-6,0-Puffer in den Filter, Wirbel und Zentrifuge bei 14.000 x g für 25 min bei RT geben.
   3. Drehen Sie den Filter um und legen Sie ihn in das Probensammelröhrchen, dann zentrifugieren Sie die Proben bei 1000 x g für 5 Minuten bei RT, um das gesamte Volumen im Sammelröhrchen zu erhalten. Waschen Sie den Filter mit 200 μl 10 mM Histidinpuffer und pipetieren Sie ihn auf und ab, um alle verbleibenden Proteinproben zu gewinnen. Füllen Sie die gesamte Lösung in dasselbe Sammelröhrchen, Wirbel und schleudern Sie es herunter.
   4. Messen Sie die Probenkonzentration mit NanoDrop. Stellen Sie die Konzentration jeder Proteinprobe auf 50 mg/ml ein, indem Sie den Histidinpuffer vor der Inkubation mit Anreicherungskügelchen hinzufügen.
   5. 300 μl der Probe werden in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.

3. Herstellung von Proteom-Anreicherungskügelchen

1. Entfernen Sie die obere und untere Kappe von jeder Schleudersäule, die Sie aus dem handelsüblichen Proteinanreicherungskit erhalten haben (siehe Materialtabelle). Werfen Sie die Kappen nicht weg, da sie später verwendet werden.
2. Nehmen Sie die Spin-Säule und positionieren Sie sie in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ohne Kappe. Zentrifugieren Sie den Aufbau bei Raumtemperatur und 1.000 x g für 30-60 s bei RT, um die Lagerlösung zu eliminieren. Entsorgen Sie das in diesem Schritt gesammelte Material.
3. Geben Sie 200 μl Waschpuffer in die handelsüblichen Anreicherungsperlen (siehe Materialtabelle) und pipetieren Sie mehrmals auf und ab. Stellen Sie die Spin-Säule in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 1.000 x g für 30-60 s bei RT, um den Puffer zu entfernen. Gesammeltes Material entsorgen.
   HINWEIS: Der Waschpuffer ist im handelsüblichen Proteinanreicherungskit enthalten.
4. Wiederholen Sie Schritt 3.3 zweimal.
5. Setzen Sie die untere Kappe wieder auf und fügen Sie 200 μl Wasser hinzu, dann setzen Sie die obere Kappe wieder auf.

4. Proteinanreicherung

1. Die Aufschlämmung wird auf und ab pipettiert (aus Schritt 3.5) und 40 μl Aufschlämmung in die in Schritt 2 vorbereitete Probe überführt. Inkubieren und drehen Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur für 2 h.
2. Stellen Sie mit der 16-G-Nadel eine Spitze mit Fritte her (siehe Materialtabelle), um die entsprechende Frittengröße zu erhalten, und führen Sie sie dann in das Spitzenende der 200-μl-Spitze ein.
3. Die Probe mit den Perlen wird auf die in Schritt 4.2 vorbereitete Spitze übertragen. Zentrifugieren Sie die Spitze mit einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen bei 200 x g für 3 Minuten bei RT, um die Lösung zu entfernen.
4. Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie 200 μl Waschpuffer in die Spitze geben und zentrifugieren Sie die Spitze mit einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen bei 200 x g 2 Minuten lang bei RT, um die Waschlösung zu entfernen. Wiederholen Sie den Schritt zweimal.
5. Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie 200 μl Wasser in die Spitze geben und zentrifugieren Sie die Spitze mit einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen bei 200 x g für 2 Minuten bei RT, um das Wasser zu entfernen.
6. Eluieren Sie Proteine aus Kügelchen, indem Sie 10 μl Elutionspuffer (Schritt 1.4) in die Spitze geben und die Aufschlämmung zehnmal in die Spitze pipettieren, um sicherzustellen, dass die Kügelchen mit Elutionspuffer getränkt sind.
7. Zentrifugieren Sie die Spitze mit einem neuen 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen bei 200 x g für 30 s bei RT, um den Eluenten aufzufangen. Wiederholen Sie die Schritte 4.6-4.7 zweimal und fassen Sie die gesamte Elution in einem 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zusammen.
8. 1,5 μl Trypsinlösung (Schritt 1.5) werden in den Eluenten für den Aufschluss über Nacht bei 28 °C gegeben. Man fügt 1,5 μl 25 mg/ml DTT hinzu (Schritt 1.6) und erhitzt die Probe 20 Minuten lang bei 90 °C.
9. Fügen Sie 1,5 μl 0,25 M IAM hinzu (Schritt 1.7) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur im Dunkeln für 20 Minuten. Fügen Sie 3,5 μl 10% TFA hinzu (Schritt 1.8), wirbeln Sie 2 Minuten lang vor und stellen Sie sicher, dass der pH-Wert bei ~2-3 liegt.
10. Bei 14.400 × g für 10 min bei RT zentrifugieren, um SDC und SLS auszufällen. Sammeln Sie den Überstand zum Entsalzen.
11. Führen Sie die Entsalzung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. 50 μl Puffer B (Schritt 1.10) in die GC-Entsalzungsspitze geben (siehe Materialtabelle). Zentrifugieren Sie die Spitze mit einem Halter bei 1000 x g für 3 min bei RT. Entsorgen Sie das gesammelte Material.
    2. Geben Sie 50 μl Puffer A (Schritt 1.9) in die Spitze. Zentrifugieren Sie die Spitze mit einem Halter bei 1000 x g für 3 min bei RT. Entsorgen Sie das gesammelte Material.
    3. Die angesäuerte Probe in die Spitze geben. Zentrifugieren Sie die Spitze mit einem Halter bei 500 x g für 6 min bei RT. Entsorgen Sie das gesammelte Material.
    4. Waschen Sie die Spitze, indem Sie 50 μl Puffer A in die Spitze geben. Zentrifugieren Sie die Spitze mit dem Halter bei 500 x g für 3 min bei RT. Entsorgen Sie das gesammelte Material. Wiederholen Sie den Vorgang einmal.
    5. Eluieren Sie das Peptid von der Spitze, indem Sie 50 μl Puffer B in die GC-Entsalzungsspitze geben. Zentrifugieren Sie die Spitze mit einem neuen Röhrchen bei 500 x g für 3 min bei RT. Sammeln Sie das Material. Wiederholen Sie den Schritt einmal und kombinieren Sie den Eluenten.
    6. Trocknen Sie den Eluenten mit einem Vakuumkonzentrator (siehe Materialtabelle).
12. Resuspendieren Sie den getrockneten Eluenten in 30 μl 0,1%iger Ameisensäurelösung (FA).
13. Messen Sie die UV-Strahlung von Peptidmischungen bei 214 nm mit einem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle). Die Konzentration von Peptidmischungen sollte zwischen 0,1 und 0,5 mg/ml liegen.
14. 10 μl jeder aufgeschlossenen Probe in ein LC-Probenfläschchen überführen und dann 1 μg jeder aufgeschlossenen Probe auf Nano-LC-MS/MS injizieren (siehe Materialtabelle). Führen Sie die Analyse gemäß Schritt 5 durch. Bewahren Sie den Rest der aufgeschlossenen Proben in einem Gefrierschrank bei -80 °C auf.

5. Nano-LC-MS/MS-Analyse

1. Injizieren Sie die Peptidmischung in ein Nano-LC-System, das mit einem Massenspektrometer gekoppelt ist. Die Peptidmischungen (~1 μg) werden zur Entsalzung auf eine C18-Trap-Säule mit dem in Tabelle 1A angegebenen Gradienten und dann zur Trennung auf eine C18-Analysesäule bei 40 °C geladen.
   ANMERKUNG: Der Puffer der mobilen Phase A bestand aus 0,1 % FA in Reinstwasser und die mobile Phase B aus 0,1 % FA in 80 % ACN.
2. Trennen Sie die Peptide und eluieren Sie mit dem in Tabelle 1B angegebenen Gradienten mit einer Flussrate von 250 nL/min.
   HINWEIS: Das Massenspektrometer wurde im datenabhängigen Modus (DDA) mit einer Zykluszeit von 3 s betrieben. Die Ionen wurden durch hochenergetische Kollisionsdissoziation (HCD) mit einer normalisierten Kollisionsenergie von 30 % für jeden vollständigen MS-Scan fragmentiert. Die Scans wurden mit einer Auflösung von 60.000 durchgeführt, mit einem AGC-Ziel (Automatic Gain Control) von 3e6, einer maximalen Injektionszeit von 20 ms und einem m/z-Bereich von 380-1600. MS/MS-Ereignisse wurden mit einer Auflösung von 15.000, einem AGC-Ziel von 1e5, einer maximalen Injektionszeit von 60 ms und einem m/z-Bereich von 200-2000 durchgeführt. Die Ausschlussdauer wurde auf 45 s festgelegt. Die Eigenschaften der Ionenquelle sind in Tabelle 1C angegeben, und die spezifischen Massenspektrometrieparameter sind in Tabelle 2A-F zu finden.

6. Datenanalyse

1. Führen Sie eine Suche in den NISTmAb-Massenspektrometrie-Rohdateien mit der UniProt mus+musculus-Datenbank^{durch 29}. Suchen Sie außerdem nach den rekombinanten Protein-Spiked-in-mAb DS-Massenspektrometrie-Rohdateien in der UniProt Cricetulus Griseus-Datenbank³⁰.
   HINWEIS: Diese Suchen wurden in der Proteome Discoverer-Software (siehe Materialtabelle) mit den Suchmaschinen Sequest HT und Mascot durchgeführt. Die verwendeten Datenbanken waren frei von redundanten Einträgen.
2. Wenden Sie für die massenspektrometrische Suche eine Massentoleranz von 10 ppm an und legen Sie die Fragmentmassentoleranz auf 0,02 Da fest.
   ANMERKUNG: Die Suchkriterien umfassten die statische Carbamidomethylierung von Cysteinresten (+57,0214 Da) und die variable Modifikation der Oxidation (+15,9949 Da) an Methioninresten. Zusätzlich wurde eine variable Modifikation der Desaminierung (+0,984 Da) angewendet.
3. Führen Sie die Datenbanksuche mit Trypsin-Verdau durch, wobei maximal zwei übersehene Spaltungen zulässig sind. Legen Sie die Falscherkennungsraten für Proteine und Peptide auf 0,01 fest.
   HINWEIS: Um Wirtszellproteine (HCPs) positiv zu identifizieren, wurde eine Mindestanforderung von mindestens zwei einzigartigen Peptiden angewendet. Tabelle 3 enthält eine repräsentative Zusammenfassung der identifizierten HCPs, die mit NIST mAb assoziiert sind und von der Proteome Discoverer-Software analysiert wurden.

Ergebnisse

Dieses Protokoll stellte einen Probenvorbereitungs-Workflow vor, der als Proteinanreicherung gekoppelt mit begrenzter Verdauung (PMLD) bezeichnet wird, für die Analyse von Wirtszellproteinen (HCPs) in einer monoklonalen Antikörperprobe (mAb). Abbildung 1 zeigt die schrittweise Vorgehensweise der PMLD. Die Forscher verglichen die Ergebnisse der HCP-Analyse mit direktem Aufschluss (oben in Abbildung 2 dargestellt) und PMLD (unten in Abbildung 2 dargestellt). Die Profile des Gesamtionenchromatogramms (TIC) zeigten, dass PMLD die wichtigsten mAb-Peptide signifikant reduzierte oder eliminierte, während es die Beobachtung einiger HCP-Peptide ermöglichte, die mit mAb-Peptiden vergleichbar sind. Detaillierte Parameter für Nano-LC- (Tabelle 1) und MS/MS-Analysen (Tabelle 2) werden bereitgestellt. Darüber hinaus enthält Tabelle 3 eine Zusammenfassung der identifizierten HCPs, die mit dem NIST mAb assoziiert sind, einschließlich Informationen wie Zugangsnummer, HCP-Name, Spezies, Abdeckungsprozentsatz, PSMs, einzigartige Peptide, Molekulargewicht, erwarteter isoelektrischer Punkt (pI), Mascot-Score, Sequest HT-Score und die Anzahl der von Mascot und Sequest HT identifizierten Peptide.

Abbildung 1: Arbeitsablauf bei der Probenvorbereitung der Proteinanreicherung in Verbindung mit begrenzter Verdauung (PMLD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Gesamtionenchromatogramm (TIC)-Profil für die HCP-Analyse von NIST mAb. Oberes Bild: TIC-Profil für die HCP-Analyse von NIST mAb mittels direktem Aufschluss. Untere Tafel: TIC-Profil für die HCP-Analyse von NIST mAb mittels PMLD. Aus dem TIC-Profil geht hervor, dass im Vergleich zum direkten Verdau die meisten der wichtigsten mAb-Peptide nach PMLD reduziert oder eliminiert wurden, während einige Peptide, die zu HCPs gehören, beobachtet werden können und mit mAb-Peptiden vergleichbar sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Parameter für Nano-LC. (A) Steigung der Ladepumpe. (B) Gradient der NC-Pumpe. (C) Eigenschaften der Ionenquelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Parameter für MS/MS. (A) Vollständige Scaneigenschaften. (B) MIPS-Eigenschaften. (C) Intensitätseigenschaften. (D) Eigenschaften des Ladezustands. (E) Dynamischer Ausschluss. (F) Datenabhängige MS2-Scan-Eigenschaften. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Repräsentative Übersichtstabelle der identifizierten HCPs, die mit NIST mAb assoziiert sind und von der Proteome Discoverer-Software analysiert wurden. Die Tabelle enthält Informationen wie die Zugangsnummer, den HCP-Namen, die Spezies, den Prozentsatz der Abdeckung, die Anzahl der Peptidspektrum-Übereinstimmungen (PSMs), die Anzahl der eindeutigen Peptide, das Molekulargewicht, den erwarteten isoelektrischen Punkt (pI), den Mascot-Score, den Sequest HT-Score und die Anzahl der von Mascot und Sequest HT identifizierten Peptide. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Liste der verwendeten Abkürzungen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Es gibt zwei Versionen von kommerziell erhältlichen Proteinanreicherungskügelchen: eine mit kleinerer Kapazität und die andere mit größerer Kapazität (siehe Materialtabelle). Beide Versionen der Anreicherungsperlen enthalten zehn Preps in der Packung. Die Anweisungen des Herstellers deuten darauf hin, dass jedes Präparat aus dem Kit mit geringer Kapazität verwendet werden kann, um 10 mg Gesamtprotein anzureichern. Für eine optimale Leistung der Anreicherung von Wirtszellproteinen (HCP) durch DS ist jedoch jedes Präparat für fünf DS-Proben geeignet. Daher kann jedes Kit zur Anreicherung von HCPs aus fünfzig Proben verwendet werden. Für jedes Präparat aus dem Kit mit großer Kapazität ist es gut für die Anreicherung von HCPs aus fünfundzwanzig DS-Proben und ermöglicht den Nachweis von HCPs aus insgesamt zweihundertfünfzig Proben.

In Schritt 3.1 wird davon abgeraten, die obere oder untere Kappe zu verwerfen, da sie im gesamten Protokoll wiederverwendet werden. Wenn sich Perlen in der oberen Kappe absetzen, ersetzen Sie sie, nachdem Sie den unteren Stopfen entfernt und zentrifugiert haben, während die obere Kappe auf der Säule bleibt. Um die untere Kappe als Stopfen zu verwenden, drehen Sie sie um und positionieren Sie sie sicher am Boden der Schleudersäule.

Ein kritischer Schritt im Verfahren ist Schritt 4.1, bei dem sich die Kügelchenaufschlämmung am Boden des Röhrchens absetzt. Daher ist es wichtig, beim Überführen der Aufschlämmung in die Proben des monoklonalen Antikörpers (mAb) kontinuierlich auf und ab zu pipettieren. Ein weiterer kritischer Schritt ist Schritt 4.6, bei dem es wichtig ist, die Aufschlämmung zehnmal in die Spitze zu pipettieren, während die Kügelchen mit Elutionspuffer gesättigt sind. Die Dauer der Zentrifugation in den Schritten 4.3-4.5, 4.7 und 4.10 kann in Abhängigkeit von der Menge der akkumulierten Wirtszellproteine (HCPs) variieren. Daher ist es wichtig, zu überprüfen und sicherzustellen, dass die Flüssigkeiten in der Spitze ordnungsgemäß heruntergeschleudert wurden, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Auch hier gilt: Wenn mit einer Anfangsmenge von 15 mg Antikörper-Wirkstoff-Produkt begonnen wird, können ca. 30 μg Antikörper und angereicherte Wirtszellproteine (HCPs) eluiert werden. Um ein Protein-zu-Enzym-Verhältnis von 400:1 für eine eingeschränkte Verdauung zu erreichen, wurden 75 ng Trypsin hinzugefügt. Wenn eine geringere Menge an Inputmaterial verwendet wird, ist eine Messung der Konzentration der eluierten Proteinprobe erforderlich. Diese Messung hilft dabei, die Menge an Trypsin, die entsprechend hinzugefügt werden muss, anzupassen. Schritt 4.9 zeigt einen weißen Niederschlag nach Zugabe der 10% TFA. Um eine Störung des MS-Signals durch Tenside zu vermeiden, ist es wichtig, den pH-Wert nach der Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) zu überprüfen, um die vollständige Entfernung des Reinigungsmittels aus dem Überstand zu gewährleisten.

Nach der Trocknung und Resuspension des Eluenten in Wasser ist es notwendig, eine UV-Messung des Peptidgemisches durchzuführen. Diese Messung ist von entscheidender Bedeutung, da die Menge der auf die Säule geladenen Peptide die Detektion mittels MS beeinflussen kann. Nach der Auswertung wurde festgestellt, dass etwa 1 μg der Peptidmischung die beste Leistung bei MS zeigte. Folglich muss diese optimale Menge zur weiteren Analyse in Nano-LC-MS/MS injiziert werden.

Der PMLD-Ansatz bietet mehrere Vorteile bei der Probenvorbereitung, einschließlich einer ausreichenden DS-Reduktion durch monoklonale Antikörper (mAb), während die Mehrheit der Wirtszellproteine (HCPs) mit geringer Häufigkeit erhalten bleibt. Im Gegensatz zur Immunpräzipitation (IP) ist diese Technik nicht auf Anti-HCP-Antikörper angewiesen, wodurch die mit vordefinierten Antikörpern verbundene Verzerrung beseitigt und der Arbeits- und Zeitaufwand für die Herstellung von Anti-HCP-Antikörpern reduziert wird. Darüber hinaus reichert PMLD im Gegensatz zu Filtrationsmethoden, die auf dem Molekulargewichts-Cut-off¹⁷ basieren, HCPs unabhängig von ihrer Größe an. Es kann zur Anreicherung von HCPs aus verschiedenen Arzneimittelmodulen wie Antikörpern, Fusionsproteinen, ScFv und mehr eingesetzt werden, was es zu einem vielseitigen Ansatz im Vergleich zu Protein-A-Deletionsmethoden^{macht 21}.

Zusätzlich zu diesen Vorteilen weist PMLD eine niedrigere Nachweisgrenze auf und ermöglicht im Vergleich zu anderen Methoden den Nachweis einer größeren Anzahl von HCPs aus NISTmAb, einem weithin charakterisierten Referenzstandard. Es ist jedoch erwähnenswert, dass PMLD selbstgebaute Geräte erfordert, was ihre Anwendung für die Automatisierung einschränkt. Um die Benutzerfreundlichkeit zu erweitern, ist es möglich, bestimmte Geräte, wie z. B. die Spitze mit Fritte, durch handelsübliche Alternativen zu ersetzen. Darüber hinaus kann die Entsalzung auf 96-Well-Platten mit diesem Ansatz einen höheren Durchsatz ermöglichen. Die Erforschung der Automatisierung oder Halbautomatisierung in zukünftigen Experimenten kann ein logischer nächster Schritt sein, um die breitere Anwendung von PMLD auszuweiten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
16 G, Nabennadel aus Metall, 2 Zoll, Spitzenform 3	Hamilton	91016
Acclaim PepMap 100 C18 Trap-Säule (20 cm & 0,075 mm)	Thermo Fisher	164535
Acetonitril	Fisher-Scientific	A955
Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS120-4
Amicon Ultra-0,5 Zentrifugalfiltereinheit	Millipore Sigma	UFC5010
C18 Analysesäule (0,075 mm × 1,7 μ m & times; 30 cm, 100 & Aring;)	CoAnn Technologies	HEB07503001718I
Zentrifuge 5424	Eppendorf	5405000646
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher	A39255
Fritte für SPE-Kartuschen, 9,5 mm, 3 mL, 100/pk	Agilent	12131020
GL-Tip GC	GL Sciences Inc	7820-11201
hauseigene mAb	Regeneron		Konzentration 200 mg/ml
Iodacetamid (30 x 9,3 mg)	Thermo Fisher	A39271
Isopropanol	Fisher-Scientific	149320025
L-Histidin	Sigma Aldrich	H6034
L-Histidin Monohydrochlorid Monohydrat	Sigma Aldrich	53370
Methanol	Fisher-Scientific	A456-4
Milli-Q	Millpore	30035
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000
Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Protein LoBind Tube 0,5 mL	Eppendorf (VWR)	22431064
Protein LoBind Tube 2,0 mL	Eppendorf (VWR)	22431102
Proteom Entdecker Software 2.4	Thermo Scientific
ProteoMiner Proteinanreicherungskit mit großer Kapazität	Bio-Rad	1633007
ProteoMiner Proteinanreicherungskit mit kleiner Kapazität	Bio-Rad	1633006
Natriumdesoxycholat (SDC)	Sigma Aldrich	D6750
Natriumlauroylsarkosinat (SLS)	Sigma Aldrich	L5777
SpeedVac	Labconco	7970010
Thermomixer R	Eppendorf	22670107
Trifluoressigsäure (TFA)	Fisher-Scientific	28904
Trypsin (Sequenzierqualität modifiziert)  (5 x 20 ug)	Promega	V5111
Tube Revolver Rotator	Thermo Fisher	88881001
UltiMate 3000 RSLC Nano System	Thermo Fisher	ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8,0	Thermo Fisher	15568-025
Vortex Genie 2	VWR	102091-234
Wasser mit 0,1% Ameisensäure (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS118-4