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Methodenartikel

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung für lange nicht-kodierende RNA-Lokalisierung in menschlichen Osteosarkomzellen

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DOI:

10.3791/65545

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16. Juni 2023

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode der RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Lokalisierung der lncRNAs in humanen Osteosarkomzellen.

Zusammenfassung

Die wichtige Rolle langer nicht-kodierender RNAs (lncRNAs) bei Krebs wurde untersucht, wie z. B. die Regulierung der Proliferation, des epithelial-mesenchymalen Übergangs (EMT), der Migration, der Infiltration und der Autophagie von Krebszellen. Die Lokalisationsdetektion von lncRNAs in Zellen kann Aufschluss über ihre Funktionen geben. Durch das Design der lncRNA-spezifischen Antisense-Kettensequenz mit anschließender Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen kann die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) angewendet werden, um die zelluläre Lokalisierung von lncRNAs zu detektieren. Zusammen mit der Entwicklung der Mikroskopie ermöglichen die RNA-FISH-Techniken nun sogar die Visualisierung der schlecht exprimierten lncRNAs. Mit dieser Methode kann nicht nur die Lokalisierung von lncRNAs allein nachgewiesen werden, sondern auch die Kolokalisation anderer RNAs, DNA oder Proteine durch Verwendung von zweifarbiger oder mehrfarbiger Immunfluoreszenz. Hier haben wir das detaillierte experimentelle Vorgehen und die Vorsichtsmaßnahmen von RNA FISH am Beispiel des lncRNA-Wirtsgens 6 (SNHG6) in menschlichen Osteosarkomzellen (143B) aufgenommen, um Forschern, die RNA-FISH-Experimente, insbesondere lncRNA-FISH, durchführen möchten, eine Referenz zu bieten.

Einleitung

Unser Verständnis des menschlichen Genoms hat sich durch die jüngsten Fortschritte in der Ganzgenomtechnologie erheblich erweitert. Etwa 93 % des menschlichen Genoms können in RNAs transkribiert werden, aber nur 2 % der RNAs können in Proteine übersetzt werden. Die restlichen 98 % der RNAs, die keine Proteintranslationsfunktion haben, werden als nicht-kodierende RNA (ncRNA)1 bezeichnet. Als eine Klasse von nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs) haben lange ncRNAs (lncRNAs), die über 200 Nukleotideenthalten 2, aufgrund ihrer Beteiligung an vielen physiologischen und pathologischen Prozessen der Zellen, wie z. B. Differenzierung, Zykluskontrolle, Apoptose, Migration und Invasion, zunehmend Aufmerksamkeit erregt 3,4,5. LncRNAs spielen ihre Rolle durch verschiedene Mechanismen, wie z. B. die Regulierung der Chromatinstruktur und der nukleären Genexpression, die Kontrolle des mRNA-Spleißprozesses und die posttranskriptionelle Modifikation6. LncRNAs regulieren das Auftreten, die Entwicklung und die Metastasierung von Malignomen sowohl auf transkriptioneller als auch auf posttranskriptioneller Ebene. Die transkriptionelle Regulation wird im Zellkern durch Beeinflussung der RNA-Transkription durch Bindung an die chromosomalen Strukturen realisiert, während die posttranskriptionelle Regulation im Zytoplasma durch die Kontrolle der Zielgene über einen endogenen kompetitiven RNA-Mechanismus (ceRNA) realisiertwird 5,7,8. CeRNA hat einen neuen Mechanismus der RNA-Interaktion aufgedeckt, nämlich dass lncRNAs wie ein Schwamm wirken können, um miRNAs zu adsorbieren und den miRNA-vermittelten Abbau verwandter Zielgene zu hemmen9. Daher ist die Information über die subzelluläre Lokalisation von lncRNAs, unabhängig davon, ob sich eine bestimmte lncRNA im Zytoplasma oder im Zellkern befindet, wichtig, um ihre biologischen Funktionen zu identifizieren.

Gegenwärtig wird die lncRNA-Lokalisierung hauptsächlich mit zwei Methoden nachgewiesen, eine durch Zellkern-/Zytoplasmafraktions-Isolierungsassay und die andere durch RNA-FISH. Im ersten Fall werden RNAs in der zytoplasmatischen bzw. der nukleären Fraktion extrahiert, und dann wird eine PCR-Amplifikation mit spezifischen lncRNA-Primern durchgeführt, um das Verhältnis von lncRNAs im Zytoplasma und Zellkern nachzuweisen. Der Vorteil dieser Methode ist die Zeiteffizienz, während der Nachteil darin besteht, dass sich die tatsächliche lncRNA-Lokalisierung nicht direkt durch den relativen Anteil der lncRNAs im Zytoplasma und Zellkern widerspiegelt. RNA FISH kann die Lokalisierung von lncRNA in Zellen durch das Design von lncRNA-spezifischen Antisense-Kettensequenzen und anschließender Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen nachweisen10. Die RNA-FISH-Methoden wurden mit Fortschritten in den Sondentechniken und Nachweismethoden verbessert, einschließlich Fluorophor-markierter multipler Oligo-Sondensätze11, LNA-Sonden 12 und verzweigter DNA (bDNA)-Sonden13. RNA FISH kann nicht nur die Lokalisation von lncRNA nachweisen, sondern auch die Kolokalisation anderer RNAs, DNA oder Proteine mithilfe von zwei- oder mehrfarbiger Immunfluoreszenz14.

In dieser Arbeit haben wir das detaillierte intrazelluläre Lokalisationsdetektionsprotokoll des lncRNA-Wirtsgens 6 (SNHG6) in Osteosarkomzellen (143B) durch RNA FISH als Beispiel einbezogen. SNHG6 ist eine 600-730 Nukleotid-lncRNA in ihrer reifen gespleißten Form und wurde als neues Onkogen bei verschiedenen menschlichen Krebsarten identifiziert, darunter Darmkrebs, Magenkrebs, klarzelliges Ovarialkarzinom, Osteosarkom und hepatozelluläres Karzinom15,16,17,18. Studien haben die Beteiligung von SNHG6 an biologischen Verhaltensweisen von Krebszellen wie Proliferation, EMT und Autophagie bestätigt und die zytoplasmatische Lokalisation von SNHG6 gezeigt, wo es die Zielgene beeinflussen kann, indem es die miRNAs bindet (schwammt)15,16,17. Dieses detaillierte Detektionsprotokoll der intrazellulären Lokalisierung von SNHG6 durch RNA FISH wird hier vorgestellt.

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Protokoll

In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden. Abbildung 1 zeigt das Gesamtprotokoll für RNA FISH; Tabelle 1 enthält die Zusammensetzung aller Lösungen und Tabelle 2 enthält die in diesem Protokoll verwendeten Primersequenzen.

1. Sondenvorbereitung

  1. Identifizieren und erwerben Sie die FASTA-Sequenz einer Ziel-lncRNA von Interesse, z. B. von GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Befolgen Sie die Anweisungen auf der Website, entwerfen Sie die ISH-Sonden online19 und überprüfen Sie die Vorschläge des Designalgorithmus, um die Sonden aufzulisten, die mit dem Cy3-Etikett bestellt werden sollen.
  2. Inkubieren Sie den Hybridisierungspuffer bei 37 °C für 2 h im Voraus.
  3. 4 Sonden mit optischer Dichte (OD) werden in 160 μl mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem ddH2O in einer Konzentration von 1 mg/ml lichtfern gelöst.
    HINWEIS: Die optische Dichte (OD) stellt die Maßeinheit von DNA und RNA dar. Normalerweise ist 1 OD-Einheit = 33 μg/ml DNA.
  4. Bereiten Sie 200 μl der Sondenmischung für jede Vertiefung vor (1,2 μl-10 μl Sonde, 70 μl Hybridisierungspuffer, bilden Sie das Volumen mit DEPC-behandeltem ddH2O bis 200 μl) und richten Sie eine Reihe von 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12,5 μg/ml und 6 μg/ml ein.
    HINWEIS: Die Sondenkonzentration muss im Voraus experimentell untersucht werden. Eine hohe Sondenkonzentration führt zu einer unspezifischen Bindung von lncRNAs, während eine niedrige Sondenkonzentration zu einer unempfindlichen oder fehlgeschlagenen Detektion von lncRNAs führt.
  5. Die Sondenmischung bei 73 °C 5 min denaturieren.
    HINWEIS: Wenn die Cy3-markierte DNA-Sonde doppelsträngig ist, denaturieren Sie die Sonde 5 Minuten lang bei 95 °C auf einzelsträngige DNA und kühlen Sie sie dann schnell 2 Minuten lang auf Eis ab.

2. Vorbereitung der Zellen

  1. Säen Sie 50.000 143B-Zellen pro Well auf sterile Glasdeckgläser in einer 12-Well-Zellkulturplatte und inkubieren Sie sie für 24 h (37 °C, 5 % CO2) in DMEM.
    HINWEIS: Die spezifische Zellzahl, die hier ausgesät wird, variiert mit der Zellgröße, was für die ausgesäten Zellen geeignet ist, um nach 24 Stunden Inkubation einen Zusammenfluss von 50% zu erreichen. Die sterilen Deckgläser aus Glas sind rund, um für die 12-Well-Platte geeignet zu sein.
  2. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es 2 x 5 Minuten lang mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    HINWEIS: Bereiten Sie 1x PBS mit DEPC-behandeltem ddH2O vor. PBS ohne DEPC-Behandlung kann nicht verwendet werden, da es RNase enthält. Führen Sie alle folgenden Schritte unter RNase-freien Bedingungen durch.
  3. Entfernen Sie 1x PBS und fügen Sie 200 μl 100%iges Ethanol in jede Vertiefung hinzu, um es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zu fixieren.
  4. Entfernen Sie das Ethanol, fügen Sie 200 μl 0,1 % Triton X-100 (in 1x PBS) in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Die Zeit muss mit der Permeabilisierung von Triton X-100 streng kontrolliert werden und darf nicht zu lang sein.
  5. 0,1% Triton X-100 entfernen und 2 x 5 min mit 1x PBS waschen.
    HINWEIS: Wenn das Protokoll hier pausiert werden muss, ersetzen Sie das PBS durch 70% Ethanol (Verdünnung von 100% Ethanol mit RNase-freiem ddH2O) und lagern Sie die Probe bei 4 °C für bis zu 3 Monate.
  6. 1x PBS entfernen, 200 μl 2x Natriumsalzcitrat (SSC)-Puffer (Verdünnung von 20x SSC mit RNase-freiem ddH2O) in jede Vertiefung geben und 30 min bei 37 °C inkubieren.
  7. Entfernen Sie 2x SSC-Puffer, geben Sie 200 μl 70%iges Ethanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie 3 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  8. Das 70%ige Ethanol wird verworfen, 200 μl 85%iges Ethanol (Verdünnung von 100% Ethanol mit RNase-freiem ddH2O) in jede Vertiefung gegeben und 3 min bei Raumtemperatur inkubiert.
  9. Verwerfen Sie das 85%ige Ethanol, geben Sie 200 μl 100%iges Ethanol in jede Vertiefung und inkubieren Sie 3 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  10. 100% Ethanol absorbieren und entsorgen; Lassen Sie die Vertiefungen trocknen.

3. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

  1. In jede Vertiefung werden 200 μl Sondenmischung (denaturiert wie in Schritt 1.5) gegeben und bei 37 °C über Nacht (16-18 h) inkubiert.
    ANMERKUNG: Es besteht eine starke positive Korrelation zwischen der Hybridisierungstemperatur und der Sondenkonzentration. Um den Hintergrund zu optimieren, sollten daher sowohl die Hybridisierungstemperatur als auch die Sondenkonzentration reduziert werden.
  2. Am nächsten Tag werden Proben ab 37 °C entnommen und die Sondenmischung verworfen. Geben Sie 200 μl 0,4x SSC/0,3% Tween-20-Puffer in jede Vertiefung (vorgewärmt auf 65 °C) und waschen Sie sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  3. Entfernen Sie den 0,4-fachen SSC/0,3 %-Tween-20-Puffer, geben Sie 200 μl 200 μl 2-fachen SSC/0,1 %-Tween-20-Puffer in jede Vertiefung und waschen Sie ihn 2 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  4. Entfernen Sie 2x SSC/0,1% Tween-20-Puffer, fügen Sie 200 μl 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbelösung (1 μg/ml) hinzu und färben Sie es 20 Minuten lang lichtfern.
  5. Die DAPI-Farbstofflösung entsorgen und mit 1x PBS für 2 min bei Raumtemperatur waschen.
  6. Geben Sie 50 μl Eindeckmedium mit Gummi auf den Objektträger und legen Sie das Deckglas auf den Objektträger, um es zu fixieren.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, das Deckglas mit der Zellenseite nach unten auf die Folie zu legen.
  7. Unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop oder ein konfokales Lasermikroskop. Letzteres erzeugt eine höhere Empfindlichkeit und Klarheit der Bildgebung.

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Ergebnisse

Es werden repräsentative Bilder von SNHG6 FISH in humanen Osteosarkomzellen gezeigt (Abbildung 2). Die Negativkontrolle wird mit der negativen Ctrl-Sonde behandelt; Die Positivkontrolle wird mit der U6-Sonde 20 behandelt. SNHG6-Sonde und U6-Sonde sind mit Cy3 markiert, das rote Fluoreszenz emittiert. DAPI ist ein Farbstoff, der die DNA färbt und blaue Fluoreszenz aussendet. Dieses Ergebnis zeigt, dass SNHG6 hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert ist, und diese Inform...

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Diskussion

Dieses RNA-FISH-Protokoll kann nicht nur die Lokalisierung von lncRNAs in Zellen nachweisen, sondern auch die Kolokalisation anderer RNAs, DNA oder Proteine in Zellen, was auch zum Nachweis der Lokalisation von lncRNAs in paraffineingebetteten Geweben verwendet werden kann. Das spezifische Protokoll in solchen Fällen ist jedoch anders, da die in Paraffin eingebetteten Gewebe entwachst werden müssen21. Dieses experimentelle Verfahren kann in 48- oder 96-Well-Platten angewendet werden, aber 384-Well...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wird unterstützt durch Zuschüsse von (1) dem National Key R&D Program of China (2020YFE0201600); (2) die National Nature Science Foundation (81973877 und 82174408); (3) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation; (4) Forschungsprojekte im Rahmen des Budgets der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).

    

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Automatischer ZellzählerShanghai Simo Biological Technology Co., LtdIC1000Zellen zählen
Zellkulturplatte-12Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd3513, corningLegen Sie die Deckgläser in die Platte
  Zelllinie (143B)Cell Bank of Chinese Academy of SciencesCRL-8303Osteosarkom-Krebszelllinie
Zentrifugenröhrchen (15 mL, 50 mL)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, CorningZentrifugieren Sie die
Zellen DeckgläserShanghai YueNian Biotechnology Co., Ltdabs7026Die Zellen werden auf die Deckgläser ausgesät
Cy3 Label-SNHG6 DNA-SondeShanghai GenePharma Co., LtdA10005Detect SNHG6 Standort
DMEM-MedienShanghai YueNian Biotechnology Co., LtdLM-E1141Zellkulturmedium
Trockenbad-InkubatorVerifizierter Lieferant - Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.DKT200-2 Inkubation bei unterschiedlich hohen Temperaturen
Ethanol 100% Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218Dehydratation
FluoreszenzmikroskopShanghai Waihai Biotechnology Co., LTDOlympus BX43 ausgestattet mit einer Kamera von Olympus U-TV0.5XC-3 (SN:5J01719), OlympusBeobachtungs- und Positionierungs-Inkubator
Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDDHP-9051Die Proben wurden bei 37 °C inkubiert.
EindeckmediumSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E675004Befestigen Sie die Deckgläser an der Folie
ShakerHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.TS-8SWaschprobe
SlideShanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd188105Das Deckglas wird auf den Objektträger
Triton X-100Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. gelegt.A600198Permeable Membran und Kernmembran
  Trypsin (0,25%)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd25200056, GibcoTrypsin-Behandlung von Zellen
Tween-20Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600560Waschmittel

Referenzen

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