Methodenartikel

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung für lange nicht-kodierende RNA-Lokalisierung in menschlichen Osteosarkomzellen

DOI:

10.3791/65545

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16. Juni 2023

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode der RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Lokalisierung der lncRNAs in humanen Osteosarkomzellen.

Zusammenfassung

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Die wichtige Rolle langer nicht-kodierender RNAs (lncRNAs) bei Krebs wurde untersucht, wie z. B. die Regulierung der Proliferation, des epithelial-mesenchymalen Übergangs (EMT), der Migration, der Infiltration und der Autophagie von Krebszellen. Die Lokalisationsdetektion von lncRNAs in Zellen kann Aufschluss über ihre Funktionen geben. Durch das Design der lncRNA-spezifischen Antisense-Kettensequenz mit anschließender Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen kann die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) angewendet werden, um die zelluläre Lokalisierung von lncRNAs zu detektieren. Zusammen mit der Entwicklung der Mikroskopie ermöglichen die RNA-FISH-Techniken nun sogar die Visualisierung der schlecht exprimierten lncRNAs. Mit dieser Methode kann nicht nur die Lokalisierung von lncRNAs allein nachgewiesen werden, sondern auch die Kolokalisation anderer RNAs, DNA oder Proteine durch Verwendung von zweifarbiger oder mehrfarbiger Immunfluoreszenz. Hier haben wir das detaillierte experimentelle Vorgehen und die Vorsichtsmaßnahmen von RNA FISH am Beispiel des lncRNA-Wirtsgens 6 (SNHG6) in menschlichen Osteosarkomzellen (143B) aufgenommen, um Forschern, die RNA-FISH-Experimente, insbesondere lncRNA-FISH, durchführen möchten, eine Referenz zu bieten.

Einleitung

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Unser Verständnis des menschlichen Genoms hat sich durch die jüngsten Fortschritte in der Ganzgenomtechnologie erheblich erweitert. Etwa 93 % des menschlichen Genoms können in RNAs transkribiert werden, aber nur 2 % der RNAs können in Proteine übersetzt werden. Die restlichen 98 % der RNAs, die keine Proteintranslationsfunktion haben, werden als nicht-kodierende RNA (ncRNA)1 bezeichnet. Als eine Klasse von nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs) haben lange ncRNAs (lncRNAs), die über 200 Nukleotideenthalten 2, aufgrund ihrer Beteiligung an vielen physiologischen und pathologischen Prozessen der Zellen, wie z. B. Differenzierung,....

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Protokoll

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In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien, Reagenzien und Instrumenten, die in diesem Protokoll verwendet werden. Abbildung 1 zeigt das Gesamtprotokoll für RNA FISH; Tabelle 1 enthält die Zusammensetzung aller Lösungen und Tabelle 2 enthält die in diesem Protokoll verwendeten Primersequenzen.

1. Sondenvorbereitung

  1. Identifizieren und erwerben Sie die FASTA-Sequenz einer Ziel-lncRNA von Interesse, z. B. von GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Befolgen Sie die Anweisungen auf der Website, entwerfen ....

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Ergebnisse

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Es werden repräsentative Bilder von SNHG6 FISH in humanen Osteosarkomzellen gezeigt (Abbildung 2). Die Negativkontrolle wird mit der negativen Ctrl-Sonde behandelt; Die Positivkontrolle wird mit der U6-Sonde 20 behandelt. SNHG6-Sonde und U6-Sonde sind mit Cy3 markiert, das rote Fluoreszenz emittiert. DAPI ist ein Farbstoff, der die DNA färbt und blaue Fluoreszenz aussendet. Dieses Ergebnis zeigt, dass SNHG6 hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert ist, und diese Inform.......

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Diskussion

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Dieses RNA-FISH-Protokoll kann nicht nur die Lokalisierung von lncRNAs in Zellen nachweisen, sondern auch die Kolokalisation anderer RNAs, DNA oder Proteine in Zellen, was auch zum Nachweis der Lokalisation von lncRNAs in paraffineingebetteten Geweben verwendet werden kann. Das spezifische Protokoll in solchen Fällen ist jedoch anders, da die in Paraffin eingebetteten Gewebe entwachst werden müssen21. Dieses experimentelle Verfahren kann in 48- oder 96-Well-Platten angewendet werden, aber 384-Well.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wird unterstützt durch Zuschüsse von (1) dem National Key R&D Program of China (2020YFE0201600); (2) die National Nature Science Foundation (81973877 und 82174408); (3) Shanghai Collaborative Innovation Center of Industrial Transformation of Hospital TCM Preparation; (4) Forschungsprojekte im Rahmen des Budgets der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (2021LK047).

    

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Automatischer ZellzählerShanghai Simo Biological Technology Co., LtdIC1000Zellen zählen
Zellkulturplatte-12Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd3513, corningLegen Sie die Deckgläser in die Platte
  Zelllinie (143B)Cell Bank of Chinese Academy of SciencesCRL-8303Osteosarkom-Krebszelllinie
Zentrifugenröhrchen (15 mL, 50 mL)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd  430790, CorningZentrifugieren Sie die
Zellen DeckgläserShanghai YueNian Biotechnology Co., Ltdabs7026Die Zellen werden auf die Deckgläser ausgesät
Cy3 Label-SNHG6 DNA-SondeShanghai GenePharma Co., LtdA10005Detect SNHG6 Standort
DMEM-MedienShanghai YueNian Biotechnology Co., LtdLM-E1141Zellkulturmedium
Trockenbad-InkubatorVerifizierter Lieferant - Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.DKT200-2 Inkubation bei unterschiedlich hohen Temperaturen
Ethanol 100% Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218Dehydratation
FluoreszenzmikroskopShanghai Waihai Biotechnology Co., LTDOlympus BX43 ausgestattet mit einer Kamera von Olympus U-TV0.5XC-3 (SN:5J01719), OlympusBeobachtungs- und Positionierungs-Inkubator
Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDDHP-9051Die Proben wurden bei 37 °C inkubiert.
EindeckmediumSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E675004Befestigen Sie die Deckgläser an der Folie
ShakerHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.TS-8SWaschprobe
SlideShanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd188105Das Deckglas wird auf den Objektträger
Triton X-100Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. gelegt.A600198Permeable Membran und Kernmembran
  Trypsin (0,25%)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd25200056, GibcoTrypsin-Behandlung von Zellen
Tween-20Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600560Waschmittel

Referenzen

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  1. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).
  2. Li, C. H., Chen, Y. Insight into the role of long noncoding RNA in cancer development and progression. International Review of Cell and Molecular B....

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Schlagwörter

RNA FISHlange nicht kodierende RNAlncRNA LokalisierungSNHG6 NachweisFluoreszenzhybridisierungzytoplasmatische LokalisierungDAPI F rbungSondenkennzeichnungZellkultur

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