Schnelle In-vitro-Zytotoxizitätsbewertung des Jurkat-exprimierenden chimären Antigenrezeptors mittels Fluoreszenzbildgebung

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur Bewertung der quantitativen Abtötung von Tumorzellen durch Jurkat-Zellen, die chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren, der auf ein einzelnes Tumorantigen abzielt. Dieses Protokoll kann als Screening-Plattform für die schnelle Optimierung von CAR-Scharnierkonstrukten vor der Bestätigung in aus dem peripheren Blut gewonnenen T-Zellen verwendet werden.

Zusammenfassung

Chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen stehen an der Spitze der Onkologie. Ein CAR besteht aus einer Zieldomäne (in der Regel ein einzelnes kettenvariables Fragment, scFv) mit einem begleitenden Intra-Ketten-Linker, gefolgt von einem Scharnier, einer Transmembran und einer kostimulatorischen Domäne. Die Modifikation des Intra-Chain-Linkers und der Scharnierdomäne kann einen signifikanten Einfluss auf die CAR-vermittelte Tötung haben. In Anbetracht der vielen verschiedenen Optionen für jeden Teil eines CAR-Konstrukts gibt es eine große Anzahl von Permutationen. Die Herstellung von CAR-T-Zellen ist ein zeitaufwändiger und teurer Prozess, und die Herstellung und das Testen vieler Konstrukte ist eine hohe Zeit- und Materialinvestition. Dieses Protokoll beschreibt eine Plattform zur schnellen Evaluierung scharnieroptimierter CAR-Konstrukte in Jurkat-Zellen (CAR-J). Jurkat-Zellen sind eine immortalisierte T-Zelllinie mit hoher Lentivirus-Aufnahme, die eine effiziente CAR-Transduktion ermöglicht. Hier stellen wir eine Plattform zur schnellen Evaluierung von CAR-J mit einem Fluoreszenz-Imager vor, gefolgt von der Bestätigung der Zytolyse in PBMC-abgeleiteten T-Zellen.

Einleitung

Die CAR-T-Zelltherapie hat sich bei hämatologischen Malignomen als vielversprechend erwiesen, wie die 6 von der FDA zugelassenen CAR-T-Produkte seit 2017 zeigen, wie das National Cancer Institute^{berichtet 1}. Es gibt zahlreiche CAR-T-Zellen in klinischen Studien zur Bekämpfung solider Tumore. Die Entwicklung neuartiger CAR-Targets und die Optimierung des CAR-Konstrukts sind entscheidend für die Wirksamkeit einer CAR-T-Zelle. Die Wahl des idealen CAR-Konstrukts für jede Anwendung ist entscheidend für ein genaues Targeting von tumorassoziierten Antigenen (TAA) bei gleichzeitiger Vermeidung einer niedrigen TAA-Expression in normalem Gewebe

Protokoll

HINWEIS: Alle Zellkulturarbeiten werden in einer Biosicherheitswerkbank mit Laborkittel, Handschuhen und unter Einhaltung der aseptischen Standardtechniken durchgeführt.

1. Generierung von CAR, das Jurkats (CAR-J) exprimiert

1. Kaufen Sie Jurkat-Zellen, Klon E6-1 von ATCC. 1 x 10⁶ Zellen in einem T-75-Kolben auftauen und in T-75-Kolben kultivieren. Halten Sie sie in Suspension bei 0,6 x 10⁶ Zellen pro ml unter Verwendung von Medien des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), die mit 10 % FBS angereichert sind, in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂.
2. Platte 1 x 10⁵

Ergebnisse

Ein Bereich des E:T-Verhältnisses zwischen 1:8 und 8:1 für CAR-J1 wurde nach 72 Stunden untersucht, der auf EGFR auf TNBC MDA-MB-231-Zellen abzielte. Jurkat-Zellen wurden mit CAR-Lentivirus mit Polybrene transduziert, um CAR-J-Zellen zu erzeugen, wie in Schritt 2 beschrieben. Die Zytotoxizität von CAR-J1 nahm mit höherem E:T-Verhältnis signifikant zu, ohne dass sich die Abtötung im Verhältnis 1:8 unterschied (Abbildung 1). Mehr als 50% Tötung wurde bei 4:1 E:T über 72 h beobachtet. Dieses E:.......

Diskussion

Hier haben wir eine schnelle Methode vorgeschlagen, um die zielspezifische zytolytische Aktivität, die durch die CAR-Expression in Jurkat-Zellen induziert wird, effizient zu bewerten. Alle CAR-Konstrukte haben das gleiche scFv, aber unterschiedliche Scharnier- und Transmembrandomänen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Potenz von CAR-T-Zellen beeinflussen¹³. Eine weitere Evaluierung der unspezifischen Abtötung durch diese CAR-J erfolgte durch Kultivierung mit Antigen-Knock-out-Zellen (KO). Dies.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 mL Conical Tube (Steril)	Midwest Scientific	#C15B	Jedes Ähnliche funktioniert
50 mL Conical Tube (Steril)	Thermo Scientific	339652	Jedes Ähnliche funktioniert Black
/Clear 96 Well Platte	Falcon	353219	Celligo hat eine Liste kompatibler Platten
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	Ähnliches funktioniert
Celigo Software	Nexcelcom Bioscience	Version 5.3.0.0	Ähnliches funktioniert
Cell Culture Incubator	Thermo Scientific	HeraCell 160i	Ähnliches funktioniert
Cell Culture Treated Flasks (T75, verschiedene Größen, steril)	TPP	90076	Ähnliches funktioniert
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	Ähnliches funktioniert
Cytek Muse Cell Analyzer	Cytek	0500-3115	Ähnliches funktioniert
DMEM	Gibco	11995-040	Ähnliches funktioniert
FBS	Gemini Bio-Products	900-108	Ähnliches funktioniert
Durchflusszytometer	Cytek, BD, etc	Aurora, LSR II, etc	Ähnliches funktioniert
FlowJo Sortware	Becton Dickinson & Unternehmen	Version 10.7.1	Ähnliches funktioniert
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	Ähnliches funktioniert
GraphPad Software	GraphPad	Version 9.3.1 (471)	Ähnliches funktioniert
Multichanel Pipette	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Ähnliches funktioniert
PBS	Gibco	10010-031	Ähnliches funktioniert
PenStrep	Gibco	15070-063	Jedes Ähnliche funktioniert
Pipettenspitzen (steril, gefiltert, 1 mL, verschiedene Größen)	Pr1ma	PR-1250RK-FL, etc	Ähnliches funktioniert
Pipettierer	Thermo Scientific	Finnpipette F2	Jedes Ähnliche funktioniert
Propidium Iodid	Invitrogen	P1304MP	Jedes Ähnliches funktioniert
RPMI	Corning	10-041-cv	Jedes Ähnliches funktioniert
Serologische Pipettenhilfe	Drummond Scientific	4-000-105	Jedes Ähnliches funktioniert Serologische
Pipetten (steril, verschiedene Größen)	Pr1ma	PR-SERO-25usw	Ähnliches funktioniert
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-CI	Ähnliches Sterile
Reservoirs	Midwest Scientific	RESE-2000	Ähnliches funktioniert
Tischzentrifuge	Eppendorf	5810R	Ähnliches