Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Schnelle In-vitro-Zytotoxizitätsbewertung des Jurkat-exprimierenden chimären Antigenrezeptors mittels Fluoreszenzbildgebung

3.7K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/65560

⸱

27. Oktober 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, University of Kansas Cancer Center, 2Department of Cancer Biology, University of Kansas Cancer Center, 3BioEngineering Program, University of Kansas, 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Kansas Medical Center, 5University of Kansas Cancer Center, 6Kansas Institute for Precision Medicine, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur Bewertung der quantitativen Abtötung von Tumorzellen durch Jurkat-Zellen, die chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren, der auf ein einzelnes Tumorantigen abzielt. Dieses Protokoll kann als Screening-Plattform für die schnelle Optimierung von CAR-Scharnierkonstrukten vor der Bestätigung in aus dem peripheren Blut gewonnenen T-Zellen verwendet werden.

Zusammenfassung

Chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen stehen an der Spitze der Onkologie. Ein CAR besteht aus einer Zieldomäne (in der Regel ein einzelnes kettenvariables Fragment, scFv) mit einem begleitenden Intra-Ketten-Linker, gefolgt von einem Scharnier, einer Transmembran und einer kostimulatorischen Domäne. Die Modifikation des Intra-Chain-Linkers und der Scharnierdomäne kann einen signifikanten Einfluss auf die CAR-vermittelte Tötung haben. In Anbetracht der vielen verschiedenen Optionen für jeden Teil eines CAR-Konstrukts gibt es eine große Anzahl von Permutationen. Die Herstellung von CAR-T-Zellen ist ein zeitaufwändiger und teurer Prozess, und die Herstellung und das Testen vieler Konstrukte ist eine hohe Zeit- und Materialinvestition. Dieses Protokoll beschreibt eine Plattform zur schnellen Evaluierung scharnieroptimierter CAR-Konstrukte in Jurkat-Zellen (CAR-J). Jurkat-Zellen sind eine immortalisierte T-Zelllinie mit hoher Lentivirus-Aufnahme, die eine effiziente CAR-Transduktion ermöglicht. Hier stellen wir eine Plattform zur schnellen Evaluierung von CAR-J mit einem Fluoreszenz-Imager vor, gefolgt von der Bestätigung der Zytolyse in PBMC-abgeleiteten T-Zellen.

Einleitung

Die CAR-T-Zelltherapie hat sich bei hämatologischen Malignomen als vielversprechend erwiesen, wie die 6 von der FDA zugelassenen CAR-T-Produkte seit 2017 zeigen, wie das National Cancer Instituteberichtet 1. Es gibt zahlreiche CAR-T-Zellen in klinischen Studien zur Bekämpfung solider Tumore. Die Entwicklung neuartiger CAR-Targets und die Optimierung des CAR-Konstrukts sind entscheidend für die Wirksamkeit einer CAR-T-Zelle. Die Wahl des idealen CAR-Konstrukts für jede Anwendung ist entscheidend für ein genaues Targeting von tumorassoziierten Antigenen (TAA) bei gleichzeitiger Vermeidung einer niedrigen TAA-Expression in normalem Gewebe2.

Ein CAR-Konstrukt besteht hauptsächlich aus fünf Kompartimenten: (1) extrazelluläre einkettige variable Fragmente (scFv)-Domäne, die auf das Tumorantigen abzielt; (2) Scharnier-Domäne; (3) Transmembran-Domäne; (4) intrazelluläre zytoplasmatische T-Zell-komdimulatorische Domäne; und (5) Signalisierungsdomäne. Die Modifikation jeder dieser Domänen beeinflusst die Präzision der CAR-T-Zelle, die mit ihrer Zielzelle3 interagiert. Daher ist die Bewertung der Zytotoxizität und Kreuzreaktivität dieser CAR-Konstrukte in vitro entscheidend, um das richtige Konstrukt für In-vivo-Experimente auszuwählen. Zu den aktuellen Methoden zur Bewertung der Zytolyse durch T-Zellen gehören der 51-Cr-Freisetzungstest, der Laktatdehydrogenase-Freisetzungstest, der biolumineszierende Bildgebungstest, die impedanzbasierte Echtzeit-Zellanalyse und der zellbasierte Durchflusszytometrie-Assay 4,5. Die hier beschriebene auf Fluoreszenzbildgebung basierende Plattform identifiziert die Anzahl lebender vs. toter Zellen, was eine direkte Quantifizierung der T-Zell-Zytolyse im Gegensatz zu einer indirekten Methode zur Bewertung der Zytolyse durch T-Zellen darstellt.

Hier ist eine einfache, kosteneffiziente, schnelle und hochdurchsatztechnische Technik mit minimalen Eingriffen zur Bewertung der Zytotoxizität von Jurkat-Zellen, die den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) CAR exprimieren, gegen MDA-MB-231 triple-negative Brustkrebszellen (TNBC) und EGFR CRISPR knock-out MDA-MB-231-Zellen. Jurkat-Zellen sind immortalisierte menschliche T-Lymphozyten-Zellen6, die häufig für die Untersuchung von T-Zell-Aktivierungs- und Signalmechanismen verwendet werden7. Darüber hinaus wurden Jurkat-Zellen in mehreren Studien für In-vitro-CAR-Tests verwendet 8,9,10,11. Jurkat-Zellen werden leicht durch Lentiviren transduziert und weisen eine anhaltende Proliferation auf, und dieses System wurde genutzt, um die Scharnierdomäne verschiedener EGFR-CAR-Konstrukte zu optimieren.

Dieser Assay kann für das Screening mehrerer CAR-Konstrukte verwendet werden, die auf verschiedene Tumorantigene abzielen und gegen mehrere adhärente Tumorzelllinien und in verschiedenen Effektor-zu-Tumor-Verhältnissen (E:T) verwendet werden. Darüber hinaus können mehrere Zeitpunkte ausgewertet und die Anzahl der Replikate geändert werden, um die beste Tötung unter den verschiedenen CAR-Konstrukten zu identifizieren. Die besten Konstrukte müssen mit CD3-T-Zellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) bestätigt werden. Das übergeordnete Ziel hinter der Entwicklung dieser Methode ist es, die CAR-Scharniergeometrie schnell und mit hohem Durchsatz zu optimieren, um Barrieren wie eine geringe Transduktionseffizienz zu überwinden, gefolgt von einer Bestätigung in PBMC-abgeleiteten T-Zellen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

HINWEIS: Alle Zellkulturarbeiten werden in einer Biosicherheitswerkbank mit Laborkittel, Handschuhen und unter Einhaltung der aseptischen Standardtechniken durchgeführt.

1. Generierung von CAR, das Jurkats (CAR-J) exprimiert

  1. Kaufen Sie Jurkat-Zellen, Klon E6-1 von ATCC. 1 x 106 Zellen in einem T-75-Kolben auftauen und in T-75-Kolben kultivieren. Halten Sie sie in Suspension bei 0,6 x 106 Zellen pro ml unter Verwendung von Medien des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), die mit 10 % FBS angereichert sind, in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2.
  2. Platte 1 x 105 Jurkat-Zellen pro Well einer mit Gewebekultur behandelten 24-Well-Platte in 500 μl RPMI-Wachstumsmedien mit 4 μg/ml Polybrene, das die lentivirale Effizienz verbessert. Zählen Sie Zellen mit einem laserbasierten Tischzellanalysator mit Fluoreszenzdetektion. Die Anzahl der Wells hängt von der Anzahl der zu bewertenden Konstrukte ab. In diesem Beispiel werden 4 Konstrukte und ein nicht transduziertes Steuerelement verwendet. Der Entwurf des CAR-Konstrukts ist in Tabelle 1 dargestellt.
  3. Fügen Sie 10 μl Lentivirus/Wells von jedem CAR-Konstrukt hinzu. Das Design des CAR-Konstrukts und die Lentivirus-Produktion erfolgten wie zuvor beschrieben12.
  4. Geben Sie am nächsten Tag 1 ml RPMI-Wachstumsmedium in jede Vertiefung und setzen Sie die Kultivierung im Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 fort.
  5. Entnehmen Sie die Zellen 2 Tage später (insgesamt 72 Stunden nach der Jurkat-Transduktion) und zählen Sie sie.
  6. Entnehmen Sie 1 x 104 Zellen, um die CAR-Expression auf den Jurkat-Zellen zu bestätigen. Kurz gewaschen werden die Zellen 2x mit FACS-Färbelösung (FSS), bevor Sie das CAR-J mit Antikörpern markieren, die auf den Flag-Tag abzielen, der zum Nachweis der CAR-Positivität verwendet wird, 30 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C. Waschen Sie die Zellen erneut 2x mit FSS und lassen Sie die Zellen wie zuvor beschrieben durch ein Durchflusszytometer laufen12. Verwenden Sie die vom Hersteller empfohlene Antikörperkonzentration.
  7. Jurkat-Zellen sind leicht transduziert und zeigen fast immer eine CAR-Expression von >90%. Produzieren Sie CAR-J lange vor dem Zytotoxizitätstest in der Co-Kultur und frieren Sie es für die spätere Verwendung ein.

2. Beschichtung von CFSE-markierten Tumorzellen

ANMERKUNG: MDA-MB-231 (von ATCC, HTB-26) Zellen waren ein Geschenk eines Mitarbeiters, und EGFR KO MDA-MB-231 wurde wie zuvor beschriebenhergestellt 12.

  1. 1 x 106 Zellen in einem T-75-Kolben auftauen und in T-75-Kolben kultivieren. MDA-MB-231-Tumorzellen und CRISPR-EGFR-KO-MDA-MB-231-Tumorzellen werden in 14 ml modifiziertem Adlermedium (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 aufbewahrt und bei etwa 70 % Konfluenz gespalten.
  2. Beobachten Sie adhärente Tumorzellen unter dem normalen Hellfeldmikroskop, um eine Konfluenz von fast 70 % sicherzustellen.
  3. Nährmedien mit einer serologischen Pipette aus dem Kolben entfernen. 3 ml Trypsin in den T75-Kolben geben und 3-5 Minuten lang bei 37 °C mit 5 %CO2 in einen Inkubator geben, um die Zellen aus dem Kolben zu lösen.
  4. Neutralisieren Sie das Trypsin mit der gleichen Menge (3 ml) Wachstumsmedien. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem Zentrifugenröhrchen und schleudern Sie die Zellen 4 Minuten lang bei 400 x g herunter, um die Zellen zu pelletieren.
  5. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzähler.
  6. Überführen Sie 8 x 105 Zellen in ein weiteres 15-ml-Röhrchen und fügen Sie PBS hinzu, um ein Volumen von 1 ml zu erreichen.
  7. Geben Sie 2 μl Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE; 5 μM Stammkonzentration) in jedes Röhrchen und mischen Sie es mit einer 1-ml-Pipette gut durch.
  8. Inkubieren Sie die Zellen mit CFSE für 20 min im Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2. Nehmen Sie die Röhrchen nach 20 Minuten aus dem Inkubator und geben Sie 5 ml Wachstumsmedien in das Röhrchen.
  9. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 x g für 4 Minuten, um die CFSE-markierten Zellen zu pelletieren. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette und fügen Sie 1 ml frisches Medium hinzu, um die Zellen zu resuspendieren.
  10. Bewerten Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzähler neu. 4 x 105 Zellen in ein 25-ml-Reagenzreservoir überführen und Medien für ein Gesamtvolumen von 8 ml hinzufügen.
    1. Um ein ausreichendes Volumen für die Aussaat von 5000 Tumorzellen/Wells in 100 μl Medien zu gewährleisten, muss das Volumen mit der Mehrkanalpipette pipetiert werden können, und um den Verlust einiger Zellen in Schritt 1.7 zu kompensieren, bereiten Sie 10 % bis 20 % zusätzliches Zell- und Medienvolumen vor.
  11. Mischen Sie die Zellsuspension gründlich mit einer serologischen Pipette von 5 ml. Pipettieren Sie mit einer 100-μl-Mehrkanalpipette 100 μl der Zellsuspension in jede Reihe der durchsichtigen, flachen schwarzen 96-Well-Platte auf der linken Hälfte. Ein Beispiel für eine Beschichtungsstrategie ist in Tabelle 2 zu finden.
  12. Piprimieren Sie EGFR KO-Zellen auf die rechte Hälfte der Platte. Sobald die gesamte Platte plattiert ist, ziehen Sie die Platte auf der Plattform der Gewebekulturhaube hin und her und von einer Seite zur anderen, um eine gleichmäßige Verteilung der Tumorzellen in den Vertiefungen zu gewährleisten.
  13. Inkubieren Sie die Platte für 4 h im Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2 , damit sich die Tumorzellen anheften können.

3. Co-Kultivierung von CAR, die Jurkats exprimieren, mit CFSE-markierten Tumorzellen

  1. Unter Verwendung der Anzahl der nicht transduzierten und CAR-exprimierenden Jurkat-Zellen werden 4 x 105 Zellen jedes CAR-J in ein 25-ml-Reservoir überführt. Fügen Sie DMEM-Wachstumsmedien hinzu, um ein Gesamtvolumen von 2 ml zu erhalten.
  2. Für E:T von 4:1 wurden 2 x 104 CAR-J pro Vertiefung in 100 μl Medien unter Verwendung einer Mehrkanalpipette vorsichtig an der Seite jedes Wells entlang zugegeben, um die anhaftenden Tumorzellen nicht zu stören.
  3. Geben Sie weitere 100 μl Wachstumsmedien mit einer Mehrkanalpipette an die Seite von Wells, die Tumorzellen und Jurkat-Zellen enthalten. Die reinen Tumorgruppen erhalten 200 μl Medien, so dass insgesamt 300 μl Medien in allen Wells vorhanden sind.
  4. Ziehen Sie die Platte entlang der Plattform in Hin- und Her- und Seitwärtsbewegungen, um eine gleichmäßige Verteilung der Jurkat-Zellen auf den Tumorzellen zu gewährleisten.
  5. Die Co-Kultur im Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2 für 48 h zulassen.

4. Vorbereitung der Platte für die Bildgebung

  1. Stellen Sie eine Lösung von Propidiumiodid (PI) mit 1 μg/ml in Medien mit niedriger Hintergrundfluoreszenz her, basierend auf der Anzahl der Vertiefungen und erhalten Sie jeweils 100 μl Medien.
  2. Für 84 Vertiefungen 9 ml PI-haltige Medien vorbereiten. Mischen Sie das Medium gründlich mit einer Pipette.
  3. Stellen Sie 10 ml 20%ige Triton-X-Lösung her, indem Sie Triton-X mit deionisiertem Wasser verdünnen. Nach 48 Stunden Kokultur wird der CAR-J-haltige Überstand durch eine einmalige Inversion der Platte und Klopfen auf Papiertuch entsorgt.
  4. Geben Sie nun 100 μl des oben vorbereiteten PI-haltigen Mediums (Schritt 4.2) mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig in jede Vertiefung, um die anhaftenden Tumorzellen nicht zu stören.
  5. Geben Sie 20 μl 20%ige Triton-X-Lösung in die erste Vertiefung jedes Tumortyps, die als totale Totkontrolle fungiert.
  6. Lassen Sie die Platte 20 Minuten im Inkubator. Bilden Sie die Platte mit dem Fluoreszenz-Imaging-Zytometer ab. Die Daten werden auf dem Computer gespeichert und können zu einem späteren Zeitpunkt analysiert werden.

5. Analyse von Fluoreszenzbildern

  1. Verwenden Sie eine der Tumorzellen, um den grün fluoreszierenden Kanal einzustellen.
  2. Verkleinern Sie die Well-Maske auf 98%, um die Zellen am Rand des Wells zu entfernen, da das Signal am Rand nicht perfekt ist.
  3. Identifizierung von CFSE-markierten Tumorzellen auf dem grünen, fluoreszierenden CFSE-Kanal. Ändern Sie den Schwellenwert für die Fluoreszenzintensität, um alle Zellen im Well aufzunehmen.
  4. Stellen Sie den minimalen Zelldurchmesser auf 25 μm ein, um alle auf dem CFSE-Kanal erkannten Ablagerungen zu entfernen. Dies variiert je nach Zelltyp, der analysiert wird.
  5. Aktivieren Sie "Separate sich berührende Objekte ", um einzelne Zellen zu identifizieren, wenn sie miteinander in Kontakt stehen.
  6. Wählen Sie CFSE auf der Bildanzeige aus und sehen Sie sich das grafische Overlay an, um herauszufinden, was vom System ausgewählt wird.
  7. Sobald CFSE-markierte Zellen ordnungsgemäß erfasst werden, setzen Sie Gatter, um die Population lebender und toter Zellen zu definieren.
  8. Wählen Sie die CFSE-markierten Zellen aus und generieren Sie ein Histogramm der Anzahl auf der y-Achse im Vergleich zur mittleren PI-Intensität auf der x-Achse.
  9. Basierend auf der Vertiefung, in der wir Triton-X hinzugefügt haben (Schritt 4.5), zeichnen Sie einen Splitter, um niedrig PI-gefärbte und hoch PI-gefärbte Zellen zu unterscheiden. In dieser Vertiefung sollten sich die meisten Zellen in einer stark PI-gefärbten Region befinden.
    HINWEIS: PI zeigt ein basales Signal auf lebenden Zellen. Daher tötet die Zugabe von Triton-X alle Zellen ab und sie färben sich hell im roten Fluoreszenzkanal. Dies erleichtert das Ziehen von Toren, um tote Zellen von lebenden Zellen zu trennen.
  10. Passen Sie den Wert der X-Achse an, um die Zellen besser anzeigen zu können. Markieren Sie nun die niedrig PI-gefärbten Zellen als Lebendzellen.
  11. Wählen Sie die Live-Zellen aus, und legen Sie ein weiteres Histogramm mit Fläche auf der X-Achse und Zählungen auf der Y-Achse fest.
  12. Zeichnen Sie einen weiteren Splitter, indem Sie nur den Tumor verwenden, um Zellen und keine Trümmer einzufangen. In den mit Jurkat behandelten Brunnen sammeln sich Trümmer an, die CFSE-gefärbt sind und aus den Zählungen entfernt werden müssen. Die verbleibenden Nicht-Trümmer werden als "Big Cells" bezeichnet.
  13. Führen Sie die Analyse für die gesamte Platte durch und exportieren Sie die Tabelle mit den Zahlen.
  14. Tragen Sie die Big-Zählungen auf, um die Anzahl der lebenden CFSE-markierten Tumorzellen zu identifizieren, die nach der Exposition gegenüber CAR-J im Well verbleiben. Ermitteln Sie Statistiken mithilfe der unidirektionalen ANOVA.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Ein Bereich des E:T-Verhältnisses zwischen 1:8 und 8:1 für CAR-J1 wurde nach 72 Stunden untersucht, der auf EGFR auf TNBC MDA-MB-231-Zellen abzielte. Jurkat-Zellen wurden mit CAR-Lentivirus mit Polybrene transduziert, um CAR-J-Zellen zu erzeugen, wie in Schritt 2 beschrieben. Die Zytotoxizität von CAR-J1 nahm mit höherem E:T-Verhältnis signifikant zu, ohne dass sich die Abtötung im Verhältnis 1:8 unterschied (Abbildung 1). Mehr als 50% Tötung wurde bei 4:1 E:T über 72 h beobachtet. Dieses E:...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Hier haben wir eine schnelle Methode vorgeschlagen, um die zielspezifische zytolytische Aktivität, die durch die CAR-Expression in Jurkat-Zellen induziert wird, effizient zu bewerten. Alle CAR-Konstrukte haben das gleiche scFv, aber unterschiedliche Scharnier- und Transmembrandomänen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Potenz von CAR-T-Zellen beeinflussen13. Eine weitere Evaluierung der unspezifischen Abtötung durch diese CAR-J erfolgte durch Kultivierung mit Antigen-Knock-out-Zellen (KO). Dies...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

MDA-MB-231 waren ein freundliches Geschenk von Dr. Shane Stecklein. Die Autoren danken dem University of Kansas Cancer Center für die Durchführung dieser Forschung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL Conical Tube (Steril)Midwest Scientific#C15BJedes Ähnliche funktioniert
50 mL Conical Tube (Steril)Thermo Scientific339652Jedes Ähnliche funktioniert Black
/Clear 96 Well PlatteFalcon353219Celligo hat eine Liste kompatibler Platten
Celigo 4 Channel Imaging CytomenterNexcelcom Bioscience200-BFFL-5CÄhnliches funktioniert
Celigo SoftwareNexcelcom BioscienceVersion 5.3.0.0Ähnliches funktioniert
Cell Culture IncubatorThermo ScientificHeraCell 160iÄhnliches funktioniert
Cell Culture Treated Flasks (T75, verschiedene Größen, steril)TPP90076Ähnliches funktioniert
CFSETonbo13-0850-U500Ähnliches funktioniert
Cytek Muse Cell AnalyzerCytek0500-3115Ähnliches funktioniert
DMEMGibco11995-040Ähnliches funktioniert
FBSGemini Bio-Products900-108Ähnliches funktioniert
DurchflusszytometerCytek, BD, etcAurora, LSR II, etcÄhnliches funktioniert
FlowJo SortwareBecton Dickinson & Unternehmen Version 10.7.1Ähnliches funktioniert
Fluorobrite DMEMGibcoA18967-01Ähnliches funktioniert
GraphPad SoftwareGraphPadVersion 9.3.1 (471)Ähnliches funktioniert
Multichanel PipetteThermo ScientificFinnpipette F2Ähnliches funktioniert
PBSGibco10010-031Ähnliches funktioniert
PenStrepGibco15070-063Jedes Ähnliche funktioniert
Pipettenspitzen (steril, gefiltert, 1 mL, verschiedene Größen)Pr1maPR-1250RK-FL, etcÄhnliches funktioniert
Pipettierer Thermo ScientificFinnpipette F2Jedes Ähnliche funktioniert
Propidium IodidInvitrogenP1304MPJedes Ähnliches funktioniert
RPMICorning10-041-cvJedes Ähnliches funktioniert
Serologische PipettenhilfeDrummond Scientific4-000-105Jedes Ähnliches funktioniert Serologische
Pipetten (steril, verschiedene Größen)Pr1maPR-SERO-25uswÄhnliches funktioniert
Sodium PyruvateCorning25-000-CIÄhnliches Sterile
ReservoirsMidwest ScientificRESE-2000Ähnliches funktioniert
TischzentrifugeEppendorf5810RÄhnliches
.

Referenzen

  1. Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  2. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
  3. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  4. Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
  5. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  6. Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
  7. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
  8. Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
  9. Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
  10. Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93(2013).
  11. Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384(2023).
  12. Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
  13. Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
  14. Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
  15. Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
  16. Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
  17. Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048(2018).
  18. Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
  19. Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
  20. Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
  21. Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

CAR-T-ZellenJurkat-ZellenHochdurchsatz-ScreeningEGFR-TargetingModifikation der Hinge-Domäneaus PBMC gewonnene T-Zellen96-Well-PlattePropidiumiodid-Färbung
Schnelle In-vitro-Zytotoxizitätsbewertung des Jurkat-exprimierenden chimären Antigenrezeptors mittels Fluoreszenzbildgebung
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.