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Methodenartikel

Histonmodifikations-Screening mittels Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie

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DOI:

10.3791/65589

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12. Januar 2024

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, 4Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein analytischer Arbeitsablauf, der auf Flüssigkeitschromatographie, Mobilitätsspektrometrie mit gefangenen Ionen und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) basiert, für eine hochzuverlässige und hochgradig reproduzierbare "Bottom-up"-Analyse von Histonmodifikationen und -identifizierung basierend auf Hauptparametern (Retentionszeit [RT], Kollisionsquerschnitt [CCS] und genaues Masse-zu-Ladungs-Verhältnis [m/z]).

Zusammenfassung

Histonproteine sind bei Eukaryoten sehr häufig und konserviert und spielen aufgrund von Strukturen, die als posttranslationale Modifikationen (PTMs) bekannt sind, eine große Rolle bei der Genregulation. Die Identifizierung der Position und Art jedes PTMs oder Musters von PTMs in Bezug auf externe oder genetische Faktoren ermöglicht es, diese Informationen statistisch mit biologischen Reaktionen wie DNA-Transkription, Replikation oder Reparatur zu korrelieren. In der vorliegenden Arbeit wird ein Hochdurchsatz-Analyseprotokoll für den Nachweis von Histon-PTMs aus biologischen Proben beschrieben. Der Einsatz von komplementärer Flüssigkeitschromatographie, Ionenmobilitätsspektrometrie und Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) ermöglicht die Trennung und PTM-Zuordnung der biologisch relevantesten Modifikationen in einer einzigen Analyse. Der beschriebene Ansatz nutzt die jüngsten Entwicklungen in der abhängigen Datenerfassung (DDA) mit paralleler Akkumulation in der Mobilitätsfalle, gefolgt von sequentieller Fragmentierung und kollisionsinduzierter Dissoziation. Histon-PTMs werden basierend auf ihrer Retentionszeit, Mobilität und ihrem Fragmentierungsmuster sicher zugewiesen.

Einleitung

In eukaryotischen Zellen wird DNA als Chromatin in funktionelle Einheiten verpackt, die Nukleosomen genannt werden. Diese Einheiten bestehen aus einem Oktamer von vier Kernhistonen (je zwei von H2A, H2B, H3 und H4)1,2,3,4. Histone gehören zu den am häufigsten vorkommenden und am höchsten konservierten Proteinen in Eukaryoten, die maßgeblich für die Genregulation verantwortlich sind5. Posttranslationale Histonmodifikationen (PTMs) spielen eine große Rolle bei der Regulation der Chromatindynamik und steuern verschiedene biologische Prozesse wie DNA-Transkription, -Replikation und -Reparatur6. PTMs treten hauptsächlich auf der zugänglichen Oberfläche der N-terminalen Regionen von Histonen auf, die mit DNA in Kontakt stehen 3,7. Schwanz- und Kernmodifikationen beeinflussen jedoch die Chromatinstruktur, verändern die Internukleosomeninteraktionen und rekrutieren spezifische Proteine 3,8.

Eine aktuelle Herausforderung bei der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-basierten Proteomik ist die potenzielle Co-Elution von Analyten von Interesse. Bei datenabhängigen Analysen (DDA) bedeutet dies den potenziellen Verlust mehrerer Vorläuferionen während des MS/MS-Erfassungsprozesses9. Time-of-Flight (ToF)-Instrumente erfassen Spektren mit sehr hoher Frequenz 9,10 (bis zu zehn kHz)11; Dadurch sind sie in der Lage, die gesamten Vorläuferionen innerhalb einer komplexen Probe (MS1) schnell zu scannen, was eine optimale Empfindlichkeit und MS/MS-Sequenzierungsraten (bis zu 100 Hz)9 verspricht und sie ideal für die biologische Probenanalysemacht 10. Die Empfindlichkeit, die bei diesen hohen Scanraten verfügbar ist, ist jedoch durch die MS/MS-Rate9 begrenzt. Die Hinzufügung der Gefangenen-Ionen-Mobilitätsspektrometrie (TIMS) in Kombination mit einem orthogonalen Quadrupol-Flugzeitspektrometer (qToF) wurde verwendet, um diese Einschränkungen zu mildern. In TIMS werden alle Vorläuferionen im Tandem akkumuliert und in Abhängigkeit von ihrer Mobilität eluiert, anstatt einzelne Vorläufermassen mit einem Quadrupol9 auszuwählen. Die parallele Akkumulations-serielle Fragmentierung (PASEF) ermöglicht Hunderte von MS/MS-Ereignissen pro Sekunde ohne Verlust der Empfindlichkeit9.

Das Hauptziel dieser Arbeit war es, die jüngsten Entwicklungen der DDA unter Verwendung von paralleler Akkumulation in der Mobilitätsfalle, gefolgt von sequentieller Fragmentierung und kollisionsinduzierter Dissoziation (CID), aufzuzeigen. Histon-PTMs wurden basierend auf ihren Retentionszeiten (RTs), Mobilitäten und Fragmentierungsmustern sicher zugewiesen.

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Protokoll

HINWEIS: Histonproben wurden mit einer Methode extrahiert, die von Bhanu et al. (2020)12 übernommen wurde.

1. Probenvorbereitung

  1. Ernte von kultivierten Zellen
    1. Wenn Zellen zu 80 % konfluent sind, stellen Sie sicher, dass sie lebensfähig sind, indem Sie den Trypanblau-Ausschluss verwenden.
      HINWEIS: Für diese Experimente wurde eine HeLa S3-Zelllinie verwendet, aber diese Methode kann auf alle kultivierten Zellen angewendet werden.
    2. Aspirieren Sie das Medium und tragen Sie dann 5 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf jede Platte auf.
    3. Schwenken Sie die Platte(n), um alle Restmedien zu spülen, saugen Sie dann PBS an und tragen Sie 5 ml 1x PBS auf.
    4. Trennen Sie die Zellen vorsichtig von der Platte, indem Sie sie mit einem Einweg-Zellheber abkratzen.
    5. Jede Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Röhrchen geben.
    6. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 800 x g für 5 min.
    7. Saugen Sie das PBS aus dem Zellpellet an.
    8. Fahren Sie mit der Histonextraktion fort.
      HINWEIS: Schockfrosten Sie das Zellpellet in flüssigem Stickstoff, wenn es nicht sofort verarbeitet werden kann. Lagern Sie die Pellets bei -80 °C, bis Sie fortfahren können.
  2. Histon-Extraktion
    1. Schätzen Sie das Volumen jedes Zellpellets und markieren Sie den Meniskus mit einem Permanentmarker.
    2. Bereiten Sie genügend Kernisolationspuffer (NIB; 15 mM Tris-HCl (pH 7,5), 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 und 250 mM Saccharose) für alle Proben vor. Wenn im Laufe der Zeit viele Proben verarbeitet werden müssen, können Sie den Puffer alternativ in loser Schüttung herstellen und bis zu 6 Monate bei 2-8 °C lagern oder aliquotieren und auf unbestimmte Zeit bei -15 °C bis -25 °C einfrieren, indem Sie nur die für jede Extraktion erforderliche Menge auftauen.
      HINWEIS: Der Puffer sollte während der Lagerung frei bleiben. Wenn der Puffer zu irgendeinem Zeitpunkt trüb oder anderweitig abnormal aussieht, entsorgen Sie ihn und bereiten Sie frischen Puffer vor.
    3. Bereiten Sie das 50-fache Volumen der Zellpellets des Waschpuffers vor und fügen Sie Inhibitoren wie folgt hinzu (ca. 10 ml Waschpuffer pro 2 Proben).
      1. Zur Herstellung von 10 ml Waschpuffer mischen Sie 10 ml NIB, 30 μl 200 mM 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluoridhydrochlorid [AEBSF], 10 μl 1 M Dithiothreitol [DTT], 20 μl 5 μM Microcystin, 20 μl 5 M Natriumbutyrat.
    4. Entfernen Sie 1/5 des Waschpuffers, um den Lysepuffer vorzubereiten (1/5 Volumen aus dem Waschpuffer, 0,3 % NP-40 oder NP-40 Alternative).
      HINWEIS: Verwenden Sie Triton-X 100 nicht anstelle der Alternative NP-40 oder NP-40, da es für bestimmte Zelltypen zu abrasiv sein kann.
    5. Waschen Sie das Zellpellet gründlich, indem Sie es in 5 Spalten Waschpuffer suspendieren und bei 800 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Führen Sie diesen Schritt zweimal aus, saugen Sie den Überstand zwischen den Wäschen an und entsorgen Sie ihn.
    6. Stellen Sie sicher, dass das Volumen des Zellpellets noch mit einem Permanentmarker markiert ist. In 10 Volumina Lysepuffer resuspendieren.
    7. Pipetten Sie jedes Pellet gründlich, um es zu resuspendieren, und inkubieren Sie es dann 15 Minuten lang auf Eis.
    8. Nach 15 min bei 800 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    9. Saugen Sie den Überstand an und entsorgen Sie ihn.
      Anmerkungen: Das Pellet sollte auf ≤ 1/2 der ursprünglichen Pelletgröße reduziert werden (wie durch die Markierungslinie angezeigt). Wenn das Pellet nicht ausreichend reduziert ist, wiederholen Sie den Lysevorgang und fügen Sie einen sanften Homogenisierungsschritt mit einem Stößel hinzu, um die Zellen aufzubrechen.
    10. Nach Abschluss der Lyse wird das Pellet in 500 μl Waschpuffer resuspendiert und dann 5 Minuten bei 4 °C bei 800 x g zentrifugiert. Aspirieren und entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie dann den Waschschritt erneut, um alle Spuren von NP-40 zu entfernen.
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt besteht das Pellet aus Chromatin, das Histone enthält.
    11. Resuspendieren Sie das Pellet in 5 Volumina (der ursprünglichen Zellpelletgröße) von 0,4 N H2SO4.
    12. 2 h in einem Kühlraum oder Kühlschrank mit einem Rührwerk inkubieren.
    13. Nach 2 h zentrifugieren Sie die Probe(n) bei 3400 x g für 5 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand nicht.
    14. Übertragen Sie den Überstand in neue Röhrchen und spießen Sie 100% Trichloressigsäure (TCA) auf 1/3 des Volumens des Inhalts (die endgültige TCA-Konzentration beträgt ca. 20%).
    15. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um und beobachten Sie, dass die klare, farblose Lösung weiß und/oder trüb wird, was auf Proteinausfällung hinweist.
      HINWEIS: Bei Lösungen mit niedrigen Histonkonzentrationen ist die Proteinausfällung möglicherweise nicht sofort spürbar, aber der Niederschlag sollte nach der Inkubation über Nacht sichtbar sein.
    16. Über Nacht (12-18 h) bei 4 °C ungestört inkubieren, um die Histonproteine vollständig auszufällen.
    17. Am nächsten Tag bei 3400 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren.
    18. Saugen Sie den Überstand an und achten Sie darauf, die Seiten des Röhrchens nicht mit der Pipettenspitze zu berühren. In diesem Stadium werden die Histone hauptsächlich als Film an den Seiten der Röhre(n) abgeschieden.
    19. Geben Sie 500 μl eiskaltes Aceton + 0,1 % HCl (saures Aceton) mit einer Pasteurpipette aus Glas in jedes Röhrchen und drehen Sie die Röhrchen mehrmals vorsichtig um. Ordnen Sie dabei die Proben in der Reihenfolge (1, 2, 3 usw.) an, da jedes fehlerhafte Aceton die Markierungen auf den Röhrchen entfernen kann. Bei 3400 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig dekantieren.
    20. Wiederholen Sie diesen Spülschritt mit 500 μl eiskaltem 100%igem Aceton, ebenfalls mit einer Pasteurpipette aus Glas. Bei 3400 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig dekantieren.
    21. Lassen Sie die Röhrchen offen bei Raumtemperatur trocknen, bis das restliche Aceton verdampft ist.
    22. Nach dem Trocknen 100 μl Wasser in Massenspektrometrie (MS)-Qualität in jedes Röhrchen geben. Verwenden Sie dieses Tröpfchen, um alle Seiten des Behälters abzutupfen, um den gesamten Histonfilm zu resuspendieren. Tun Sie dies, indem Sie das Tröpfchen auf die Seite des Röhrchens pipettieren und es drehen, während Sie auf und ab pipettieren, oder indem Sie die Hälfte der 100 μl abgeben und mit der Spitze rundherum umrühren. Eine Kombination beider Methoden funktioniert am besten. Histone sind leicht wasserlöslich und befinden sich in der Lösung.
    23. Nach dem Resuspendieren aller Proben, falls noch weiße Feststoffe vorhanden sind, 5 Minuten lang in einem Bad bei Raumtemperatur beschallen.
    24. Bei 800 x g 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Übertragen Sie die klare Lösung auf frische Röhrchen. Entsorgen Sie alle verbleibenden unlöslichen Pellets.
    25. Führen Sie eine SDB-PAGE unter reduzierenden Bedingungen aus, um zu überprüfen, ob die Extraktion sauber ist.
      HINWEIS: Gele können mit jeder geeigneten Konzentration von Polyacrylamid betrieben werden, solange Proteine im Bereich von 10-20 kDa unterschieden werden können. In der Materialtabelle finden Sie die in diesem Protokoll verwendeten Gele.
    26. Führen Sie einen Proteinkonzentrationstest (d. h. Bradford oder BCA) durch, um die Gesamtproteinkonzentration zu bestimmen.
  3. Chemische Derivatisierung (Propionylierung) der Lysinreste
    1. 20 μg Histone (bestimmt durch den Protein-Assay) in ein sauberes Röhrchen geben. Trocknen Sie diese Probe mit einem Vakuumkonzentrator auf <5 μl und resuspendieren Sie sie dann mit 20 μl 100 mM Ammoniumbicarbonat (NH4CO3) (~1 μg/μl Lösung). Stellen Sie den pH-Wert bei Bedarf mit Ammoniumhydroxid auf ~8 ein.
      ACHTUNG: Verwenden Sie Ammoniumhydroxid (NH4OH) nicht zur Resuspendierung, sondern nur zur Einstellung des pH-Werts, falls erforderlich. Andernfalls denaturieren Proteine und fallen aus.
      HINWEIS: Um den pH-Wert mit minimalem Probenverlust zu überprüfen, tauchen Sie die Probe mit einer Pipettenspitze ein und tupfen Sie sie auf einen pH-Streifen. Dieses Testverfahren wird in den verbleibenden Schritten der Probenvorbereitung nützlich sein.
    2. Bereiten Sie das Propionylierungsreagenz vor, indem Sie Acetonitril (ACN) im Verhältnis 1:3 (v/v) Propionanhydrid zusetzen (d. h. um 40 μl Reagenz herzustellen, kombinieren Sie 10 μl Propionanhydrid mit 30 μl ACN).
      HINWEIS: Traditionell werden Methanol oder Isopropanol zur Herstellung eines Propionylierungsreagenzes verwendet. Da die Propionylierung eine Amidbildungsreaktion ist, ist ein nicht-protonisches Lösungsmittel wie Acetonitril erforderlich, um unerwünschte Nebenprodukte und Reaktionen wie Methylpropionylester zu verhindern, die bei der Verwendung von Methanol entstehen. Bereiten Sie nur genügend Propionylierungsreagenz für bis zu 4 Proben gleichzeitig vor, damit das Reagenz frisch bleibt. Verwenden Sie das Reagenz innerhalb von 1-2 Minuten nach der Zubereitung. Wenn das Reagenz sitzt, reagiert das Propionanhydrid mit Umgebungsfeuchtigkeit und es beginnt sich Essigsäure zu bilden, was die Wirksamkeit des Reagenzes verändern und den pH-Wert der Histonlösung ändern kann, sobald das Reagenz hinzugefügt wird.
    3. Propionylierungsreagenz zu jeder Probe im Verhältnis 1:4 (v/v) geben (d. h. für 20 μl Histone 5 μl Propionylierungsreagenz hinzufügen).
    4. Fügen Sie schnell 1:5 (v/v) NH4OH hinzu (d. h. fügen Sie 4 μl für 20 μl der Histonlösung hinzu), um den pH-Wert der Lösung wieder auf ~8 zu bringen. Wenn der pH-Wert immer noch zu niedrig ist, fügen Sie jeweils 1-2 μl NH4OH hinzu, bis ein pH-Wert von 8 erreicht ist. In der Regel ist ein Verhältnis von 1:5 (v/v) ausreichend.
    5. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang ungestört bei Raumtemperatur.
    6. Wiederholen Sie die Propionylierungsreaktion für nicht mehr als 3-4 Proben pro Charge des Propionylierungsreagenzes, um eine minimale Säurebildung zu gewährleisten.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.2 bis 1.3.5 des Propionylierungsverfahrens. Eine zweite Runde der Propionylierung stellt sicher, dass >95% der verfügbaren Lysine derivatisiert werden.
    8. Trocknen Sie die Proben mit einem Vakuumkonzentrator auf <5 μl. Dadurch werden alle nicht umgesetzten Propionylierungsreagenzien, sauren Produkte und Ammoniakgas verdampft, die aus dem NH4OH freigesetzt werden. Wenn die Proben vollständig austrocknen, ist dies in Ordnung, da keine nennenswerten Probenverluste auftreten.
      Anmerkungen: Verdrängen Sie vor der Lagerung die Luft in der Propionanhydridflasche mit Argongas, um die Bildung von Essigsäure durch Kontakt mit der in der Flasche verbleibenden Umgebungsfeuchtigkeit zu verhindern.
  4. Proteolytischer Verdau mit Trypsin
    1. Resuspendieren Sie Histone in 100 mM NH4HCO3 , um ein Volumen von 20 μl zu erreichen und eine optimale Konzentration von 1 μg/μl zu erreichen.
      HINWEIS: Probenlösungen mit Konzentrationen unter 1 μg/μl führen zu einer verminderten Trypsineffizienz.
    2. Fügen Sie Trypsin zu Histonproben im Verhältnis 1:10 (Gew./Wt) hinzu (d. h. fügen Sie 2 μl 1 μg/μl Trypsinlösung zu 20 μg Histone hinzu).
    3. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 °C für 6-8 h. Alternativ über Nacht (12-18 h) bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Stoppen Sie die Verdauung, indem Sie mindestens 1 h bei -80 °C einfrieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie keine Säure, um die Verdauungsreaktion zu löschen, da dies zu diesem Zeitpunkt des Verfahrens zu einem unerwünschten Abfall des pH-Werts führt. Die Probe kann bei -80 °C gelagert werden, bis sie fortgefahren werden kann (Zwischenstopp).
  5. Chemische Derivatisierung (Propionylierung) von Peptid-N-Terminoren
    1. Trocknen Sie die Proben mit einem Vakuumkonzentrator auf <5 μl.
    2. Resuspendieren Sie die Proben bis zu 20 μl (1 μg/μl) mit 100 mM NH4HCO3.
    3. Wiederholen Sie die Propionylierung wie zuvor (Schritt 1.3).
      HINWEIS: Es ist normal, dass die Proben bei diesem Schritt aufgrund eines höheren Verhältnisses von wässriger zu organischer Phase länger zum Trocknen brauchen.
  6. Probenentsalzung mit Stufenspitzen
    1. Resuspendieren oder verdünnen Sie die Proben mit 50 μl MS-Wasser + 0,1 % TFA.
    2. Stanzen Sie mit einem 11-G-Probencorer 5 Scheiben mit C18-Material aus einer Festphasenextraktionsscheibe (stanzen Sie alle 5 Scheiben, bevor Sie sie in die Pipettenspitze übertragen). Setzen Sie die Scheiben ein und stellen Sie sicher, dass sie sicher und gleichmäßig an der Unterseite einer 200-μl-Pipettenspitze verkeilt sind (Abbildung 1).
      HINWEIS: Verwenden Sie einen 15-G-Entkerner, wenn Sie mehr als 25 μg Probe durch eine einzelne Stufenspitze entsalzen.
    3. Verwenden Sie einen Zentrifugenadapter, um die Tischspitzen in 1,5-ml- oder 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu halten.
      Anmerkungen: Verwenden Sie für die folgenden Zentrifugationsschritte eine langsame (400-500 x g) Umdrehung bei 4 °C für jeweils 1-2 Minuten; die Lösungsmittel passieren das Harz normalerweise in weniger als 1 Minute, je nachdem, wie dicht das C18-Material in den Spitzen verpackt ist.
    4. Spülen Sie das Harz durch Zentrifugieren mit 50 μl 100% Acetonitril, um das C18-Material zu aktivieren und potenzielle Verunreinigungen zu entfernen.
      HINWEIS: Es kann einfacher sein, Lösungen mit Gellade-Pipettenspitzen auf die Tischspitzen zu laden. Nach der Aktivierung des C18-Materials ist es wichtig, das Harz für die Dauer des Entsalzungsvorgangs nicht austrocknen zu lassen.
    5. Äquilibrieren Sie das Scheibenmaterial mit 80 μl Wasser in MS-Qualität + 0,1 % TFA durch Zentrifugation.
    6. Säuern Sie die Probe mit Eisessig auf pH 4 oder niedriger an. Überprüfen Sie den pH-Wert wie zuvor mit pH-Streifen, um den Probenverlust zu minimieren.
    7. Laden Sie die gesamte Probe durch langsame Zentrifugation auf die Harzscheibe.
    8. Waschen Sie die Probe mit 80 μl MS-Wasser + 0,1 % TFA durch Zentrifugation.
    9. Eluieren Sie die Probe in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen, indem Sie 70 μl 75 % Acetonitril und 0,5 % Essigsäure durch langsame Zentrifugation spülen. Zusätzliche Zentrifugationszeit kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass das gesamte Probenvolumen von der Tischspitze eluiert wird. Es ist in Ordnung, wenn das Harz mit der zusätzlichen Zentrifugationszeit austrocknet, da es nach der Elution der Probe nicht mehr benötigt wird.
    10. Trocknen Sie jede Probe vollständig in einem Vakuumkonzentrator.
      HINWEIS: Proben(en) können bei -80 °C gelagert werden, bis sie fortgefahren werden können (Zwischenstopp).
    11. Für die LC-MS/MS-Analyse rekonstituieren Sie die Proben in einem Volumen Lösungsmittel A (0,1 % Ameisensäure) aus dem Flüssigkeitschromatographieprotokoll (LC), das die Endkonzentration von 0,4 μg/μl ergibt (d. h. 20 μg Histone in 50 μl Lösungsmittel A auflösen).

2. TIMS-Software-Schnittstelle

  1. Wählen Sie die Registerkarte Instrument, und wechseln Sie zu Operate (vergewissern Sie sich, dass der Instrumentenname grün hervorgehoben wird) (Abbildung 2).
  2. Überprüfen Sie die TIMS-Parameter (Abbildung 2).
  3. Überprüfen Sie die MS-Einstellungen (Scanbeginn, Scan-Ende, Ionenpolarität, Scan-Modus) (Abbildung 2).
  4. Überprüfen Sie die TIMS-Einstellungen (Modus, Mobilitätsstart, Mobilitätsende, Rampenzeit, Akkumulationszeit, Tastverhältnis, Rampenrate, MS-Rate, MS-Mittelwertbildung und Autokalibrierung) (Abbildung 2).
  5. Gehen Sie zur Registerkarte Quelle und aktivieren Sie die Spritzenoption (Hamilton 500 μl) nur für den TuneMix-Kalibrierungsschritt (Abbildung 3)13.
  6. Gehen Sie zur Registerkarte Kalibrierung , klicken Sie auf m/z, wählen Sie Kalibrierungsmodus und wählen Sie den Modus (Enhanced Q, allgemein), zoomen (+0,01%) STD Dev (0,24) und klicken Sie auf Kalibrieren; Wenn eine Punktzahl von 100 % erreicht wird, akzeptieren Sie (Abbildung 4).
  7. Gehen Sie zur Registerkarte Mobilität und wiederholen Sie den Kalibrierungsvorgang (im Allgemeinen Linearmodus), den Erfassungsbereich (+5%), die Breite (0,1 Da), die STD-Entwicklung (0,1855) und klicken Sie dann auf Kalibrieren; Wenn Sie eine Punktzahl ≥ 98,5 % erhalten, akzeptieren Sie (Abbildung 5).
  8. Gehen Sie zur Methode und wählen Sie die zu verwendende Methode aus. für dieses Beispiel wurde Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl ausgewählt (Abbildung 5).

3. LC-TIMS-PASEF-ToF MS/MS

  1. Verwenden Sie die typischen nESI-Betriebsbedingungen: 4500 V Kapillarspannung, 800 V Endplattenversatz, 3,0 bar Verneblerdruck, 10,0 l/min Trockengas, 200 °C Trockenheizung und 50 μl/min Einspritzdurchflussrate.
  2. Verwenden Sie die typischen MS-Einstellungen: 6 eV Kollisionsenergie, 1200 Vpp Kollisions-HF, 75 μs Übertragungszeit, 5 μs Vorimpulsspeicherung.
  3. Bestimmen Sie den Treibgasstrom anhand der Druckdifferenz zwischen dem Eintrittstrichter P1 und dem Austrittstrichter P2. In der TIMS-Zelle findet eine parallele Akkumulations-serielle Fragmentierung (PASEF) statt, bei der alle Vorläuferionen gleichzeitig und nicht einzeln akkumuliert werden. Vorläuferionen werden dann in schmalen Ionenpeaks im Vergleich zu den normalerweise viel breiteren Peaks (etwa 50-mal kürzer) freigesetzt, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht wird, während gleichzeitig co-eluierende Peptide über Mobilität getrenntwerden 14.
  4. Entwicklung einer LC-TIMS-ToF MS/MS-Methode zur Analyse proteolytischer Histonpeptide. Koppeln Sie einen Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (HPLC) mit einer C18-Säule (300 Å, 5 μm, 4,6 mm x 250 mm) mit einem kommerziellen TIMS-TOF-MS-Gerät mit proprietärer PASEF-Technologie.
    HINWEIS: Diese Säulengröße wurde basierend auf zuvor veröffentlichten Arbeiten15, 16, 17 so bestimmt, dass sie sowohl bei hohem als auch bei niedrigem pH-Wert eine gute Trennung für Peptidmischungen bietet.
    1. Stellen Sie das Injektionsvolumen auf 20 μl (8 μg) Probe und eine Flussrate von 0,4 ml/min ein.
    2. Führen Sie einen 60-minütigen, nichtlinearen LC-Gradienten mit Wasser mit 0,1 % Ameisensäure (Lösungsmittel A) und Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure (Lösungsmittel B) durch. Stellen Sie die Steigung ein: 10 % B für 2,7 min, dann auf 20 % B in 5,3 min, 28 % B in 4 min, 35 % B in weiteren 18 min, auf 40 % B in 13 min und 100 % B in weiteren 2 min. Nachdem Sie 5 Minuten lang 100 % B gehalten haben, senken Sie die Konzentration in 5 Minuten auf 10 % B und halten Sie sie für die letzten 5 Minuten.
  5. Verifizieren Sie die Probenelution von der HPLC in das TIMS-TOF über Nano-Elektrospray-Ionisation (nESI) im positiven Ionisationsmodus.

4. Datenanalyse

  1. Identifizieren Sie die Peptidsequenzen und Modifikationsstellen.
    1. Erstellen Sie eine theoretische Liste von Peptiden mit ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest] unter dem MS-Digest-Tool.
      1. Führen Sie einen theoretischen Verdau unter Berücksichtigung der Bedingungen des Verdaus (verwendetes Enzym), der gesuchten PTM-Typen (z. B. Mono-, Di- oder Trimethylierung), des Größenbereichs der gesuchten Peptide sowie des Massennachweisbereichs und der potenziellen Anzahl übersehener Spaltungen durch.
  2. Analysieren Sie die erfassten Daten manuell auf der Grundlage theoretischer Peptide (Abbildung 6)12.
    1. Suchen Sie nach den Massen bei mehreren Ladungszuständen (+1 bis +4) für jedes theoretische Peptid.
    2. Nach der anfänglichen Identifizierung jedes m/z wählen Sie den Peak aus und bestätigen Sie die MS/MS anhand einer theoretischen Liste von Fragmentierungsionen basierend auf der Peptidsequenz, einschließlich PTMs.
      HINWEIS: Wenn die Mobilität des identifizierten Peptids zuvor bekannt war, wird dies ebenfalls bestätigt.
  3. Berechnen Sie die relativen Häufigkeiten verschiedener PTMs und melden Sie jede Modifikation als Prozentsatz der angegebenen Peptidsequenz.
    1. Die relative Häufigkeit jedes detektierten PTM wird anhand der folgenden Gleichung berechnet:
      Relative Abundanz = PTM-Fläche/Gesamtfläche von unmodifizierten und PTMs für ein gegebenes Peptid

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Ergebnisse

Ein Bottom-up-Proteom-Workflow (Abbildung 7) umfasst in der Regel Folgendes: Extraktion des Zielproteins aus einer Rohprobe, gefolgt von der Quantifizierung der Konzentration des Proteins/der Proteine und der anschließenden Fraktionierung, in der Regel durch Gelelektrophorese oder Flüssigkeitschromatographie. Nach der Fraktionierung werden die Proteine mit einem proteolytischen Enzym (oft Trypsin) verdaut und schließlich eine massenspektrometrische Analyse der resultierenden Peptide und eine...

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Diskussion

Histone sind grundlegende Proteine, die die Chromatinstruktur regulieren, indem sie mit der DNA in Form von Oktameren interagieren, die aus den vier Kernhistonen (je zwei von H2A, H2B, H3 und H4) bestehen20. Histone enthalten zahlreiche Lysin- und Argininreste, die leicht modifiziert werden können, was zu umfangreichen PTMs führt, die die Chromatinchemie verändern, indem sie die Histonfunktion beeinflussen oder an andere zelluläre Proteine binden21. PTMs können biologische ...

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Offenlegungen

Melvin A. Park und Matthew Willetts sind Mitarbeiter von Bruker Daltonics Inc., dem Hersteller des timsTOF-Instruments.

Danksagungen

Dieses Material basiert auf Arbeiten, die von der National Science Foundation unter der Fördernummer unterstützt werden. HRD-1547798 und Grant No. HRD-2111661. Diese NSF-Zuschüsse wurden der Florida International University im Rahmen des CREST-Programms (Centers of Research Excellence in Science and Technology) gewährt. Dies ist der Beitrag Nummer 1672 des Institute of Environment, einem herausragenden Programm an der Florida International University. Zusätzliche Unterstützung wurde vom National Institute of Health im Rahmen des Grant No. R21AI135469 an Francisco Fernandez-Lima und Grant No. R01HD106051 an Benjamin A. Garcia sowie von der National Science Foundation unter Grant No. CHE-2127882 an Benjamin A. Garcia. Die Autoren danken Dr. Mario Gomez Hernandez für die anfängliche Unterstützung bei der ersten Methodenentwicklung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4Thermo Fisher Scientific10010023tierischen Ursprungs
frei 1 mL PipettenspitzenThermo Fisher Scientific94060710Finntip Flex 1000 μ L, unsteril, ungefiltert, Spitzen im Rack,
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenThermo Fisher Scientific14-282-300Verwenden Sie diese Röhrchen für die einfache und sichere Verarbeitung von Probenvolumina bis zu 1,5 mL
10 & Mikro; L PipettenspitzenThermo Fisher Scientific94060100Finntip Flex, 10 μ L, unsteril, ungefiltert, im Rack
10% NP-40Thermo Fisher Scientific28324NP-40 Surfact-Amps Waschmittellösung
10x Dulbecco' s PBS ohne Ca2+/Mg2+(Mediatech)MT21031CM
15 mL konische RöhrchenCorning352196Falcon konische Zentrifugenröhrchen
200 µ L Pipettenspitzen zum GelladenThermo Fisher Scientific02-707-138Fisherbrand  Tipps zum Laden von Gelen, 1– 200 μ L
200 µ L PipettenspitzenThermo Fisher Scientific94060310Finntip Flex 200μ L, unsteril, ungefiltert, Spitzen im Rack,
2x Laemmli ProbenpufferBio-Rad1610737Vorgemischter Proteinprobenpuffer für SDS-PAGE
50 mL Konische RöhrchenCorning352070Falcon Konische Zentrifugenröhrchen
96-Well-FlachbodenplatteThermo Fisher Scientific12565501
96-Well-Platte, V-Boden 600 μ LAxygenP-DW-500-C-S
AcetonSigma Aldrich179124ACS-Reagenz, ≥ 99,5 %
Acetonitril (ACN)Thermo Fisher ScientificA998HPLC, Fisher Chemisches
Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure (v/v), LC/MS-Qualität,Thermo FisherScientific LS120Optima LC/MS-Qualität, Thermo Scientific
AEBSFThermo Fisher ScientificAEBSF-Hydrochlorid, 98 %
Ammoniumbicarbonat, NH4HCO3Sigma Aldrich09830BioUltra, ≥ 99,5% (T)
Ammoniumhydroxidlösung, NH4OHSigma AldrichAX1303erfüllt die ACS-Spezifikationen, erfüllt die Reagenzspezifikationen für die Prüfung von USP/NF-Monographien GR
ACS Argon (Ar)AirgasAR HP 300
BEH C18 HPLC-SäuleWasser186003625XBridge Peptid BEH C18 Säule, 300 & Aring;, 5 & Mikro; m, 4,6 mm x 250 mm, 1K– 15K
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma AldrichA7906Hitzeschockfraktion, pH 7, ≥ 98%
Calciumchlorid, CaCl2Sigma AldrichC4901wasserfrei, Pulver, ≥ 97%
ZelldissoziationspufferThermo Fisher Scientific13151014
Keramik Scoring WaferRestek20116
Kompass DataAnalysis 6.0Bruker Datonics
Kompass HyStar 6.2Bruker Daltonics
Kompass IsotopenMusterBruker Daltonics
Kompass timsControl 4.1Bruker Daltonics
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad1610436
Deep Well, 96-Well-Mikrotiterplatte, 2,0 mLThermo Fisher Scientific89237526
Einweg-ZelllifterThermo Fisher Scientific 08100240Fisherbrand Zellheber; Einweg-Lifter entfernen schnell Zellschichten
Einweg-Pellet-StößelThermo Fisher Scientific12-141-363Fisherbrand  Pellet-Stößel; Resuspendieren Sie Protein- und DNA-Pellets oder zerkleinern Sie Weichgewebe in Mikrozentrifugenröhrchen
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificP23251 M
Ameisensäure (FA)Sigma Aldrich695076ACS-Reagenz ≥ 96%
Quarzglaskapillare 75 μ m ID x 363 μ m OD(Molex (Polymicro)TSP075375
EisessigThermo Fisher ScientificA38SEssigsäure, Glacial (ACS-zertifiziert), Fisher Chemical
Glaspasteur-PipettenSigma AldrichBR747725-1000EA
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatograph ShimadzuProminence 20 HPLC UFLC System
Salzsäure, HClSigma Aldrich258148ACS Reagenz, 37%
Hypercarb 30-40 μ m Kohlenstoff 150– 300 & Aring;Thermo Fisher Scientific60106-402
Hypersep KartuscheThermo Fisher Scientific60109-404
LC/MS Kalibrierstandard, für ESI-ToFAgilentG1969-85000TuningMix
Magnesiumchlorid, MgCl2Sigma AldrichM8266wasserfrei, ≥ 98%
Methanol, für HPLCThermo Fisher ScientificA454Optima für HPLC, Fisher Chemical   
Adapter für MikrozentrifugenröhrchenGL Sciences501021514
MicrocystinThermo Fisher Scientific50-200-8727Enzo Life Sciences  Microcystin-LA
MS-Probenfläschchen, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mmLEAP PAL ErsatzteileLAP.11190933
NanodropThermo Fisher ScientificModell: ND3300
Stickstoff (N2)AirgasNI UHP300
PEAKS Studio X+Bioinformatic Solutions
pH-Indikatorstreifen, InstachekMicro Essential LaborJR-113Modell: Hydrion
Kaliumchlorid, KClSigma AldrichP3911ACS Reagenz, 99,0%– 100,5%
DruckinjektionszelleNächster Fortschritt  Modell: PC77
PropionsäureanhydridSigma Aldrich8.00608Für die Synthese
Gekühlte Zentrifuge (700– 18.000 x g)NuAire, Modell: NuwindNU-C200V
Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μ m, 3 gESI Source Solutionsr13.aq.0003
SDS-PAGE GeleBio-Rad4569035Alle kD Polyacrylamid-Fertigteilgele, 8,6 cm > 6,7 cm (W &mal; L), zur Verwendung mit Mini-PROTEAN Elektrophoresezellen
NatriumbutyratThermo Fisher ScientificA11079.0698+%
Natriumchlorid, NaClSigma AldrichS9888ACS Reagenz, ≥ 99,0%
SPE Scheibe, C18VWR76333-134Empore SPE Scheibe, C18, CDS Analytisch, 90 mm x 0,5 mm, 12 & Mikro; m
SpeedVac+ Vakuumpumpe und PlattenrotorSavant Modell: SC210A
SaccharoseMillipore1.07651geeignet für Mikrobiologie
Schwefelsäure, H2SO4 Sigma Aldrich33974199.999%
TIMS-ToF MassenspektrometerBruker DaltonicsModell Tims tof ms
Trichloressigsäurelösung, TCASigma AldrichT06996.1  N
Trifluoressigsäure (TFA)Sigma Aldrich302031Geeignet für HPLC, ≥ 99,0%
Triversa NanomateAdvionModell: TR263
TrypsinProtease, MS GradeThermo Fisher Scientific90057
RöhrenrotatorThermo Fisher Scientific88881001
Vortex MixerThermo Fisher Scientific88880017
Wasser mit 0,1% Ameisensäure (v/v), LC/MS GradeThermo Fisher ScientificLS118Optima LC/MS-Qualität, Thermo Scientific
, , 328110500

Referenzen

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