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Methodenartikel

"Avatar", ein modifiziertes ex vivo Work Loop Experimente mit in vivo Stamm und Aktivierung

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DOI:

10.3791/65610

⸱

18. August 2023

 , 
1Northern Arizona University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Methodik zur Emulation der in vivo Muskelkraftproduktion während ex vivo Arbeitsschleifenexperimenten mit einem "Avatar"-Muskel von einem Labornagetier, um die Beiträge von Dehnungstransienten und Aktivierung zur Muskelkraftreaktion zu bewerten.

Zusammenfassung

Bewegungsverhalten sind emergente Merkmale dynamischer Systeme, die sich aus der Muskelkraftproduktion und der Arbeitsleistung ergeben. Das Zusammenspiel zwischen neuronalen und mechanischen Systemen findet auf allen Ebenen der biologischen Organisation gleichzeitig statt, von der Abstimmung der Eigenschaften der Beinmuskulatur beim Laufen bis hin zur Dynamik der mit dem Boden interagierenden Gliedmaßen. Das Verständnis der Bedingungen, unter denen Tiere ihre neuronalen Kontrollstrategien in Richtung der intrinsischen Muskelmechanik ("Preflexe") in der Kontrollhierarchie verschieben, würde es Muskelmodellen ermöglichen, in vivo Muskelkraft vorherzusagen und genauer zu arbeiten. Um die in vivo Muskelmechanik zu verstehen, ist eine ex vivo Untersuchung der Muskelkraft und -arbeit unter dynamisch variierenden Dehnungs- und Belastungsbedingungen erforderlich, die der in vivo Fortbewegung ähneln. In vivo Dehnungstrajektorien weisen typischerweise abrupte Änderungen auf (d. h. Dehnungs- und Geschwindigkeitstransienten), die sich aus Wechselwirkungen zwischen neuronaler Aktivierung, muskuloskelettaler Kinematik und von der Umgebung aufgebrachten Lasten ergeben. Das Hauptziel unserer "Avatar"-Technik ist es, zu untersuchen, wie Muskeln bei abrupten Änderungen der Dehnungsrate und Belastung funktionieren, wenn der Beitrag der intrinsischen mechanischen Eigenschaften zur Muskelkraftproduktion am höchsten ist. Bei der "Avatar"-Technik wird der traditionelle Work-Loop-Ansatz unter Verwendung von in vivo gemessenen Dehnungstrajektorien und elektromyographischen (EMG) Signalen von Tieren während dynamischer Bewegungen modifiziert, um ex vivo-Muskeln durch mehrere Dehnungs-Verkürzungszyklen zu treiben. Dieser Ansatz ähnelt der Work-Loop-Technik, mit dem Unterschied, dass die in vivo-Dehnungstrajektorien entsprechend skaliert und den ex vivo-Mausmuskeln auferlegt werden, die an einem Servomotor befestigt sind. Diese Technik ermöglicht es: (1) in vivo Dehnung, Aktivierung, Schrittfrequenz und Arbeitsschleifenmuster zu emulieren; (2) diese Muster zu variieren, um die In-vivo-Kraftreaktionen am genauesten abzugleichen; und (3) spezifische Merkmale der Dehnung und/oder Aktivierung in kontrollierten Kombinationen variieren, um mechanistische Hypothesen zu testen.

Einleitung

Bewegte Tiere vollbringen beeindruckende athletische Leistungen in Bezug auf Ausdauer, Geschwindigkeit und Beweglichkeit in komplexen Umgebungen. Die Fortbewegung von Tieren ist im Gegensatz zu von Menschen konstruierten Maschinen besonders beeindruckend – die Stabilität und Beweglichkeit von Robotern, Prothesen und Exoskeletten mit aktuellen Beinen bleibt im Vergleich zu Tieren schlecht. Die Fortbewegung mit den Beinen in natürlichem Gelände erfordert eine präzise Steuerung und schnelle Anpassungen, um die Geschwindigkeit zu ändern und Umgebungsmerkmale zu manövrieren, die als unerwartete Störungen wirken1,2,3,4. Das Verständnis der instationären Fortbewegung ist jedoch von Natur aus eine Herausforderung, da die Dynamik von komplexen Wechselwirkungen zwischen der physischen Umgebung, der Muskel-Skelett-Mechanik und der sensomotorischen Kontrolle abhängt1,2. Die Fortbewegung auf den Beinen erfordert die Reaktion auf unerwartete Störungen mit einer schnellen multimodalen Verarbeitung sensorischer Informationen und einer koordinierten Betätigung von Gliedmaßen und Gelenken1,5. Letztendlich wird Bewegung durch Muskeln ermöglicht, die über intrinsische mechanische Eigenschaften des Bewegungsapparates sowie durch neuronale Kontrolle Kraft erzeugen1 ,5,6,7. Eine offene Frage der Neuromechanik ist, wie diese Faktoren zusammenwirken, um koordinierte Bewegungen als Reaktion auf unerwartete Störungen zu erzeugen. Die folgende Technik nutzt die intrinsische mechanische Reaktion des Muskels auf Verformung unter Verwendung von in vivo Dehnungstrajektorien während kontrollierbarer ex vivo Experimente mit einem "Avatar"-Muskel.

Die Muskelarbeitsschleifentechnik hat einen wichtigen Rahmen für das Verständnis der intrinsischen Muskelmechanik bei zyklischen Bewegungen geschaffen8,9,10. Die traditionelle Arbeitsschleifentechnik treibt die Muskeln durch vordefinierte, typischerweise sinusförmige Dehnungsbahnen unter Verwendung von Frequenzen und Aktivierungsmustern, die während In-vivo-Experimenten gemessen wurden2,8,9,11. Die Verwendung von sinusförmigen Längentrajektorien kann die Arbeit und die Leistungsabgabe während flight12 und swimming2 unter Bedingungen realistisch abschätzen, bei denen die Tiere aufgrund der Wechselwirkung mit der Umwelt und der Muskel-Skelett-Kinematik keine schnellen Änderungen der Dehnungstrajektorien erfahren. In-vivo-Muskelzerrungstrajektorien während der Fortbewegung mit den Beinen ergeben sich jedoch dynamisch aus Wechselwirkungen zwischen neuronaler Aktivierung, muskuloskelettaler Kinematik und Lasten, die von der Umgebung ausgeübt werden5,7,13,14. Eine realistischere Arbeitsschleifentechnik ist erforderlich, um Lasten, Dehnungsverläufe und Krafterzeugung zu emulieren, die der in vivo Muskel-Sehnen-Dynamik entspricht und Einblicke in das Zusammenspiel der intrinsischen Muskelmechanik und der neuronalen Steuerung bietet, um angesichts von Störungen koordinierte Bewegungen zu erzeugen.

Hier stellen wir eine neuartige Methode vor, um in vivo Muskelkräfte während der Fortbewegung auf dem Laufband zu emulieren, indem wir einen "Avatar"-Muskel von einem Labornagetier während kontrollierter ex vivo Experimente mit in vivo Dehnungstrajektorien verwenden, die zeitlich veränderliche in vivo Lasten darstellen. Die Verwendung der gemessenen in vivo-Dehnungstrajektorien eines Zielmuskels auf Muskeln eines Labortieres während kontrollierter ex vivo-Experimente emuliert die Belastungen, die während der Fortbewegung auftreten. In den hier beschriebenen Experimenten wird der ex vivo Maus-Musculus extensor digitorum longus (EDL) als "Avatar" für den in vivo medialen Gastrocnemius (MG)-Muskel der Ratte beim Gehen, Traben und Galoppieren auf einem Laufband verwendet13. Dieser Ansatz ähnelt der Work-Loop-Technik, mit dem Unterschied, dass die in vivo-Dehnungstrajektorien entsprechend skaliert und den ex vivo-Mausmuskeln auferlegt werden, die an einem Servomotor befestigt sind. Während sich die EDL-Muskeln der Maus in Größe, Fasertyp und Architektur im Vergleich zur Ratten-MG unterscheiden, ist es möglich, diese Unterschiede zu kontrollieren. Die "Avatar"-Technik ermöglicht es: (1) in vivo Dehnung, Aktivierung, Schrittfrequenz und Arbeitsschleifenmuster zu emulieren; (2) diese Muster zu variieren, um die In-vivo-Kraftreaktionen am genauesten abzugleichen; und (3) spezifische Merkmale der Dehnung und/oder Aktivierung in kontrollierten Kombinationen variieren, um mechanistische Hypothesen zu testen.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden von dem Institutional Animal Care and Use Committee der Northern Arizona University genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden Musculus extensor digitorum longus (EDL) von männlichen und weiblichen Wildtyp-Mäusen (Stamm B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J) im Alter von 60 bis 280 Tagen verwendet. Die Tiere stammten aus einer kommerziellen Quelle (siehe Tabelle der Materialien) und wurden in einer Kolonie an der Northern Arizona University etabliert.

1. Auswahl der in vivo-Spannungskurve und Vorbereitung für die Verwendung während ex vivo-Arbeitszyklus-Experimente

HINWEIS: In diesem Protokoll wurden vorherige Messungen aus in vivo-dynamischer Lokomotion, die den Autoren direkt zur Verfügung gestellt wurden (Nicolai Konow, UMass Lowell, persönliche Mitteilung), in ex vivo-Experimenten verwendet. Die ursprünglichen Daten wurden für Wakeling et al.15 erhoben. Zeit-, Längen- oder Dehnungs-, EMG/Aktivierungs- sowie Kraftdaten sind erforderlich, um das Protokoll zu replizieren.

  1. Segmentieren Sie den gesamten in vivo Versuch in einzelne Schritte unter Verwendung einer beliebigen Programmierplattform zerlegen (MATLab-Code im Zusätzliche Codierungsdatei 1).
    1. Tragen Sie die Längenänderungen auf gegenüber. Zeit für das gesamte in vivo Versuch. Dies dient der Visualisierung einzelner Schritte (von Standphase zu Standphase) und der Beurteilung der Variabilität zwischen aufeinanderfolgenden Schritten (Abbildung 1).
    2. Berechnen Sie die Dehnung für den gesamten Versuch (Länge (L) / maximale isometrische Kraft bei optimaler Länge L)0).
    3. Wählen Sie eine Gangphase aus dem gesamten Versuch aus, die für alle Gangphasen repräsentativ ist und bei ähnlichen Längen beginnt und endet. Dies kann visuell durch das Übereinanderzeichnen der Längen zur Vergleichbarkeit jeder Gangphase erfolgen.
    4. Nachdem ein repräsentativer Schrittzyklus ausgewählt wurde, segmentieren Sie Dehnungs-, EMG/Aktivierungs- und Kraftdaten aus dem gesamten Versuch mithilfe einer beliebigen Programmierplattform (siehe Zusätzliche Codierungsdatei 1 für die in MATLAB verwendeten Codes16).
    5. Wenn die Abtastrate für Dehnung, EMG/Aktivierung oder Kraft unterschiedlich ist, interpolieren Sie die Datenpunkte, sodass alle mit der gleichen Frequenz abgetastet werden.
      HINWEIS: Die Forscher können die Aufnahmefrequenz anhand der Zeitintervalle zwischen den einzelnen in der gesamten Versuchsreihe erfassten Messpunkten bestimmen. Wenn Variablen mit der gleichen Frequenz erfasst werden, sind die Abtastzeiten identisch.
  2. Berechnen Sie die Häufigkeit segmentierter Schritte.
    1. Berechnen Sie die Frequenz, indem Sie die Dauer eines segmentierten Schritts in Sekunden ermitteln und 1 (Sekunde) durch die Dauer teilen (1/Dauer = Anzahl Schritte pro Sekunde).
    2. Manuell ermitteln, wie viele Datenpunkte erfasst werden müssen in ex vivo Experimente zur Anpassung der Frequenz.
    3. Berechnen Sie die für zwei Schritte benötigte Zeit. Wiederholen Sie die Schritte mindestens einmal, um den innermuskulären Messfehler abzuschätzen, der für die anschließende statistische Analyse erforderlich sein wird.
  3. Bestimmen Sie die Phase der Stimulation in Bezug auf die Dehnungseingabe anhand der gemessenen EMG-Aktivität, um den Beginn und die Dauer der Stimulation für die ex vivo Arbeitsschleifen. Jede Programmierplattform kann verwendet werden (siehe Zusätzliche Codierungsdatei 1 für den in dieser Studie verwendeten Code).
    1. EMG-Signal im gleichen x-Achsen-Bereich (Zeit) wie die Dehnungsänderung anzeigenAbbildung 1). Vergrößern Sie das EMG-Signal, sodass es sichtbar wird; dies kann durch Multiplikation des EMG-Signals mit einer beliebigen Zahl, durch Umkalibrierung der Dehnung und des EMG-Signals auf dieselbe Skala und/oder durch Addition des EMG-Signals zur Dehnung erreicht werden.
      HINWEIS: Die Autoren skalierten die Dehnung und das EMG mit der „rescale“-Funktion in MATLAB neu, um sie auf derselben Skala darzustellen (siehe Zusatzabbildung 1).
    2. Finden Sie, wo die EMG-Aktivität beginnt und endet, wie durch eine Intensitätsänderung von zwei Standardabweichungen angegeben17,18.
      HINWEIS: Je nach Tier und Muskel entspricht der EMG-Beginn möglicherweise nicht dem Fußkontakt (Monica Daley, UC Irvine, persönliche Mitteilung) (siehe Diskussionsabschnitt).
    3. Berechnen Sie den Prozentsatz des Dehnungszyklus (z. B. 40 %), bei dem der EMG-Aktivierungsbeginn eintritt, sowie die Dauer, für die die Stimulation erfolgen wird (z. B. 222 ms).
      HINWEIS: Die Forscher müssen eine Unterschiede in der Erregungs-Kontraktions-Kopplung (ECC) berücksichtigen, die zwischen in vivo Bewegung und ex vivo Arbeitsloops und kann für jedes Tier und jeden Muskel unterschiedlich sein (z. B. in vivo ECC beträgt 24,5 ms für die Ratten-MG, ex vivo ECC beträgt ~5 ms für die EDL-Maus.
  4. Bereiten Sie repräsentative Dehnungseingaben für das Work-Loop-Steuerungsprogramm vor. Jedes Programm, das Kraftausgabe mit Eingabe von Dehnung und Stimulation erfassen kann, kann für das Work-Loop-Steuerungsprogramm verwendet werden (siehe Diskussionsabschnitt).
    1. Nehmen Sie den ausgewählten Schrittzyklus und interpolieren Sie auf die entsprechende Anzahl von Punkten, die erforderlich ist, um den Schritt mit der gewünschten Auflösung zu erfassen. in vivo Frequenz für zwei Zyklen (siehe Schritt 1.2).
    2. Skalieren Sie die Schrittlänge so um, dass sie bei „Null-Dehnung“ beginnt und endet (z. B. L0 oder 95 % L0) nach Dehnung um eine vorbestimmte Längenänderung (siehe Schritt 3.3).
    3. „Skalieren“ Sie gegebenenfalls die ausgewählte Schrittlänge, um sie als Eingabewert für Dehnungsänderungen im EDL-Muskel der Maus zu verwenden (siehe Diskussionsabschnitt). Zum Skalieren wählen Sie eine Längenauslenkung aus, auf die der EDL-Muskel der Maus ohne Schädigung gedehnt werden kann (z. B. dehnen wir den EDL-Muskel der Maus typischerweise um 10 % L0 unabhängig von der in vivo Dies kann je nach vorläufigen Ergebnissen angepasst werden müssen (siehe Schritt 3.3).

Daten zur Herzmuskelkontraktion; Längen-zu-Zeit-Diagramm, das zyklische Bewegungsmuster zeigt
Abbildung 1: Länge über der Zeit eines in vivo-Gesamtversuchs. Die Länge (mm) ist über der Zeit des Ratten-MG aufgetragen. Schritte sind durch Kreise markiert, von der kürzesten Länge zur kürzesten Länge, jeweils als einzelner Schritt betrachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Bewertung der maximalen isometrischen Kraft der Mausmuskulatur ex vivo

  1. Richten Sie die Ausrüstung und den Operationsbereich ein.
    ANMERKUNG: Siehe Abschnitt Diskussion für eine Erklärung der für die ex vivo-Work-Loop-Methode benötigten Ausrüstung.
    1. Bereiten Sie ein Gewebe-Organsbad vor, indem Sie das Oxytube-Nadelventil in das wassergekühlte Gewebebad einsetzen (siehe Materialtabelle). Schließen Sie die Oxytube an eine Gasflasche mit 95 % O2-5 % CO2 an. Lassen Sie 20 psi in das wassergekühlte Gewebebad einströmen.
    2. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie eine zusätzliche Oxytube von der Gasleitung zu einem Kristallisierbecher mit Krebs-Henseleit-Lösung (Schritt 2.1.3) in der Nähe des Operationsbereichs führen. Diese wird verwendet, um die Muskeln während und nach den Eingriffen belüftet und hydratisiert zu halten.
      ANMERKUNG: Muskeln können auch bis zu 4 Stunden in dieser belüfteten Lösung aufbewahrt werden, wenn mehr als ein Muskel gleichzeitig aus der Maus entnommen wird.
    3. Bereiten Sie 1 L Krebs-Henseleit-Lösung mit folgenden Bestandteilen (in mmol l-1): NaCl (118); KCl (4,75); MgSO4 (1,18); KH2PO4 (1,18); CaCl2 (2,54); und Glukose (10,0) bei Raumtemperatur vor und stellen Sie den pH-Wert mit HCl und NaOH auf 7,4 ein (siehe Materialtabelle). Tragen Sie beim Umgang mit HCl und NaOH die entsprechende PSA mit Schutzbrille und Handschuhen.
    4. Füllen Sie das Bad mit Krebs-Henseleit-Lösung bei Raumtemperatur und pH 7,4. Tauchen Sie den Muskel und den Haken vollständig in die Lösung ein.
    5. Schalten Sie alle Geräte ein: Dual-Mode-Muskelhebelsystem, Stimulator und Signalinterface (DAQ-Board) (siehe Materialtabelle).
  2. Dissektion des EDL-Muskels.
    1. Narkotisieren Sie die Maus tief und führen Sie anschließend die Tötung durch Halswirbelbruch durch. Legen Sie die Maus entweder in rechts- oder linksseitige Seitenlage mit dem oberen Hinterbein gestreckt und den Zehen, die das Präparationsbrett berühren. Entfernen Sie das Fell vom Knöchel bis über das Kniegelenk.
    2. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette an und schneiden Sie vom Sprunggelenk bis zum Hüftbereich. Sobald der Muskel freigelegt ist, schneiden Sie rund um das Sprunggelenk wie einen „Saum“ von Hosen. Ziehen Sie die Haut nach oben, um die Beinmuskulatur deutlicher freizulegen.
    3. Suchen Sie die Fasziennähte, die den M. tibialis anterior (TA) vom Musculus gastrocnemius trennen, und trennen Sie diese mit einer Präzisionsschere, um die Knietraktoren freizulegen. Führen Sie die Präzisionsschere zwischen die beiden freigelegten Knietraktoren ein. Die Schere „hakt“ sich dabei in eine Tasche direkt unterhalb der freigelegten Knietraktoren ein. Trennen Sie diese „Tasche“ stumpf, indem Sie die Schere vom Bein wegziehen, bis sie das Sprunggelenk erreicht, um den EDL freizulegen.
    4. Verwenden Sie einen vorgebundenen Schlaufenknoten aus chirurgischer Seidennaht der Stärke 4-0 (siehe Materialtabelle), um ein Ende der Naht unter dem Sehnenansatz nahe dem Knie durchzuführen. Binden Sie einen doppelten Quadratknoten oberhalb der proximalen Muskel-Sehnen-Verbindung, ohne dass dieser auf dem Muskel sitzt oder die Sehne einschließt. Schneiden Sie oberhalb des Knotens ab. Ziehen Sie vorsichtig an der Schlaufe, die an der Sehne befestigt ist, und der EDL tritt aus der „Tasche“ hervor.
    5. Befestigen Sie die Schlaufe mit Klebeband am Präparationsbereich, um Zug auf den EDL auszuüben. Binden Sie einen weiteren doppelten Quadratknoten mit einem weiteren vorgebundenen Schlaufenknoten an der distalen Muskel-Sehnen-Verbindung, ohne dass dieser auf dem Muskel sitzt oder die Sehne einschließt. Schneiden Sie den Knoten auf der Seite, die näher am Bein liegt, ab, um den gesamten EDL aus der Maus zu entfernen. Schneiden Sie die überschüssige Naht an den proximalen und distalen Seiten der doppelten Quadratknoten ab und legen Sie den Muskel in das belüftete Bad neben dem Operationsbereich.
      ANMERKUNG: Achten Sie darauf, die proximale und/oder distale Seite zu kennzeichnen, wenn Sie den Muskel in ein belüftetes Bad legen.
    6. Befestigen Sie den EDL vertikal zwischen den hängenden Platinelektroden am Servomotor-Hebel-System. Befestigen Sie den distalen Schlaufenknoten am feststehenden Haken und den proximalen Schlaufenknoten am Haken, der mit dem Servomotorarm verbunden ist. Heben Sie das Gewebebad an, um den Muskel in die belüftete Krebs-Henseleit-Lösung einzutauchen.
      ANMERKUNG: Die Belüftung sollte den Muskel beim Eintauchen nicht stören. Falls doch, verringern Sie den Gasdruck. Lassen Sie den Muskel 10 Minuten lang equilibrieren, bevor Sie mit der Stimulation beginnen.
  3. Messen Sie die maximale isometrische Kraft des EDL-Muskels.
    ANMERKUNG: Siehe Tabelle 1 für das Protokoll zur Messung der maximalen isometrischen Kraft mittels Reizung und Tetanus. Siehe ergänzende Abbildung 1 für eine Darstellung des vom Autorenteam verwendeten Programms.
    1. Reizen Sie den Muskel mit einem supramaximalen Einzelzuckungsimpuls, um sicherzustellen, dass der Muskel während der Operation nicht beschädigt wurde (80 V, 1 pps, 1 ms; Tabelle 1; siehe ergänzende Abbildung 2). Falls keine Schädigung vorliegt, verwenden Sie den Längenregler am Muskelhebelsystem, um mittels Einzelzuckungsreizung eine Muskelänge zu finden, bei der die aktive Spannung etwa 1 V / 0,1271 N beträgt und die passive Spannung unter etwa 0,1 V / 0,01271 N liegt.
    2. Notieren Sie die Ausgangslänge des Muskels von Knoten zu Knoten in Volt und Millimetern. Geben Sie die Messwerte im Kalibrierabschnitt des Programms für die Ausgangslänge ein (siehe ergänzende Abbildung 1).
    3. Bestimmen Sie die maximale isometrische Kraft des supramaximalen Einzelzuckungsreizes bei optimaler Länge (L0) des EDL (Tabelle 1). Technisch gesehen ist keine Ruhephase erforderlich, aber ein Warten von 1 Minute zwischen den Reizungen stabilisiert die passive Spannung. Notieren Sie die Länge (in Volt), bei der die supramaximale Einzelzuckung maximal ist. Dies ist die optimale Muskelänge (L0) für die Einzelzuckung.
    4. Messen Sie den Muskel mit einer Schieblehre bei dieser Länge. Messen Sie den Muskel von Knoten zu Knoten. Sobald L0 bestimmt ist, verkürzen Sie den Muskel wieder auf die Ausgangslänge (aktive Spannung etwa 1 V / 0,1271 N).
    5. Bestimmen Sie die maximale isometrische Kraft des supramaximalen Tetanus des EDL (80 V, 180 pps, 500 ms; Tabelle 1). Notieren Sie die Länge (in Volt und Millimetern) der supramaximalen tetanischen Kraft bei L0 und messen Sie die Fasern erneut mit der Schieblehre von Knoten zu Knoten.
      ​ANMERKUNG: Eine Erhöhung der Muskelänge in Schritten von 0,5 V / 0,65 mm führt zu einer genaueren Bestimmung von L0 sowohl für Einzelzuckung als auch für Tetanus.
    6. Bestimmen Sie die submaximale isometrische Kraft des EDL (45 V, 110 pps, 500 ms; Tabelle 1) bei L0 vor und nach dem Experiment, um sicherzustellen, dass keine Ermüdung durch das Stimulationsprotokoll aufgetreten ist. Ein Kraftabfall um 10 % gilt als „ermüdeter“ Muskel.
ExperimentSimulationsintensität (V)Pulsfrequenz (pps / Hz)Stimulationsdauer (ms)Anmerkungen
1. „Aufwärmen“8011Länge um 0,50 V erhöhen oder verringern, um eine passive Spannung von 1 V zu erreichen
2. Zuckung bei optimaler Muskelänge (L0)8011Länge um 0,50 V erhöhen oder verringern, um eine passive Spannung von ca. 1 V zu erreichen
3. Tetanus bei optimaler Muskelänge (L0)801805003 min Pause zwischen jeder Längenänderung um 0,50 V
4. Vorversuch submaximale L045110500Bei Länge L0
6. Avatar-Experimente45110Zyklisch repräsentative Längenänderungen für den EDL-Muskel der Maus verwenden
7. Nachversuch submaximale L045110500Nach dem Experiment zur Länge L0 zurückkehren und L0 messen

Tabelle 1: Stimulationsprotokoll. Stimulationsprotokoll zur Bestimmung der optimalen Länge für supramaximale und submaximale Zuckungen sowie Tetanus. Das Protokoll variiert je nach Stimulationsintensität, Zeitablauf und Impulsen pro Sekunde.

3. Durchführung der „Avatar“-Work-Loop-Technik unter Verwendung ausgewählter in vivo-Dehnungstrajektorien

  1. Richten Sie die Software ein, die erforderlich ist, um „Avatar“-Work-Loop-Techniken durchzuführen (siehe Materialienübersicht).
    HINWEIS: Es wird eine Eingabedatei (.csv oder ähnlich) benötigt, die die Muskelänge zu jedem Zeitpunkt festlegt (siehe Schritt 1.4). Eingaben für den Prozentsatz des Zyklus, zu dem die Stimulation beginnt, sowie für die Dauer der Stimulation sind erforderlich (siehe Zusatzabbildung 3 zum Beispiel).
  2. Vollständige „Avatar“-Work-Loop-Technik.
    HINWEIS: Obwohl wir ein benutzerdefiniertes LabView-Programm verwenden, können Forscher jedes Programm nutzen, das die Steuerung von Längenänderungen der EDL-Maus am Servomotor-Hebel, die Steuerung von Beginn (% Zyklus) und Dauer (ms) der Stimulation zu festgelegten Zeitpunkten sowie die Messung der Muskelkraft ermöglicht. Siehe Zusatzabbildung 3 zur Veranschaulichung der vom Programm verwendeten Autoren
    1. Laden Sie die skalierten Dehnungsänderungen zusammen mit der skalierten Längenänderung in das Programm aus Schritt 1.4 hoch. Weitere Informationen zu „skalierten Dehnungsänderungen“ finden Sie in den Schritten 1.4, 3.3 und im Diskussionsabschnitt.
    2. Passen Sie die Anfangslänge des Muskels gegebenenfalls an (siehe Abschnitt 3.3). Geben Sie die Anfangslänge in V und mm ein, um die Ergebnisse zu kalibrieren (siehe Zusatzabbildung 3).
    3. Verwenden Sie den in Schritt 1.3 berechneten Stimulationsbeginn und die Stimulationsdauer.
    4. Führen Sie den Muskel über zwei Zyklen hinweg durch die skalierten Längenänderungen mit festgelegter Längenauslenkung.
    5. Daten speichern. Wenn mehrere Stimulationsprotokolle am selben Muskel aufgezeichnet werden, 3 min zwischen den einzelnen Stimulationen warten.
    6. Reize bei optimaler Länge (L0) unter Verwendung einer submaximalen Aktivierung, um festzustellen, ob Ermüdung eingetreten ist. Wenn die Kraft um mehr als 10 % abnimmt, gelten die Muskeln als ermüdet. Siehe Tabelle 1 für Stimulationsprotokolle.
    7. Entfernen Sie den Muskel aus dem Bad. Schneiden Sie die Schleifenschlingen am Muskel ab und tupfen Sie die überschüssige Lösung vom Muskel ab. Wiegen Sie den Muskel. Bestimmen Sie die physiologische Querschnittsfläche anhand der Standardformel: Muskelmasse/(L0*1.06)19.
  3. Passen Sie die Parameter für die „Avatar“-Work-Loop-Technik an (siehe Diskussionsabschnitt).
    1. Bestimmen Sie die Ausgangslänge und Längenauslenkung durch Abgleich der ex vivo passiver Spannungsanstieg zum beobachteten Anstieg der passiven Spannung in vivo (Abbildung 2).
      HINWEIS: Diese Studie verwendete den Anteil an L0 zur Skalierung der Ausgangslänge (mm) und der Auslenkung (% L0; siehe Schritt 1.4 und Diskussionsabschnitt). Zum Abgleich des Spannungsanstiegs in ex vivo Maus EDL zu der in vivo Ratten-MG stellten die Autoren fest, dass die Ausgangslänge bei L0 ergab die beste Anpassung (Abbildung 2).
    2. Wählen Sie drei Startlängen (z. B. -5 % L0, L0, und +5 % L0). Führen Sie die „Avatar“-Arbeitsschleife bei jeder dieser Ausgangslängen mit einer vorgegebenen Längenauslenkung (z. B. 10 % L0).
      HINWEIS: Bei den vorliegenden „Avatar“-Experimenten unter Verwendung der EDL-Maus ein Längenausschlag von 10 % L0 wurde verwendet.
    3. Wiederholen Sie den Vorgang mit neuen Ausgangslängen und/oder Bewegungsauslenkungen, bis die Rate von ex vivo der Anstieg der passiven Spannung ist ähnlich der Rate von in vivo passiver Spannungsanstieg (siehe Abbildung 2B).
    4. Je nach Fasertypen und Aktivierungsdynamik der verwendeten Muskeln die Dauer der Stimulation erhöhen oder verringern, um die Übereinstimmung zwischen ex vivo und in vivo Kraft. Daher kann es erforderlich sein, den Beginn und/oder die Dauer der Stimulation anzupassen, um sie optimal abzustimmen in vivo Kraftentwicklung während „Avatar“-Experimenten.
    5. Um zu entscheiden, ob dies notwendig ist (siehe Abschnitt Diskussion), tragen Sie die Kraft über die Zeit für den „Avatar“ auf in vivo Muskel (Abbildung 3) und berechnen Sie den Determinationskoeffizienten R2 indem die quadrierte skalierte Korrelation zwischen der Ziel- und der „Avatar“-Muskelkraft berechnet wird (siehe Repräsentative Ergebnisse).

Diagramm des statischen Gleichgewichts, ΣFx=0, zur Darstellung der Arbeitsloop-Analyse; skaliertes Spannungs-Dehnungs-Diagramm.
Abbildung 2: Anstieg der passiven Spannung entsprechend abgleichen. Arbeitsschleifen, die die in vivo und ex vivo Anstieg der passiven Spannung (Pfeile). In vivo skalierte Arbeitskurve aus der MG-Ratte (schwarz) beim Gehen mit 2,9 Hz (Daten von Wakeling et al.)15). Ex vivo skalierte Arbeitszyklen aus der EDL-Maus bei 2,9 Hz. (A) Anfängliche Länge des EDL-Muskels der Maus beträgt +5 % L0. (B) Anfangslänge des EDL-Muskels der Maus ist L0. Beachten Sie, dass der ex vivo passive Spannungsanstieg mit dem in vivo Zunahme der Spannung in A, jedoch nicht in B. Dickere Linien zeigen Stimulation an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Spannung-Zeit-Diagramm mit dynamischen Antwortkurven in der Materialprüfanalyse.
Abbildung 3: Optimierung der Stimulationsdauer des EDL-Muskels der Maus, um der in vivo-Kraft des MG-Muskels der Ratte (schwarze Linie) zu entsprechen. Die vom EDL-Muskel der Maus erzeugte Kraft unter Verwendung der EMG-basierten Stimulation (grüne gestrichelte Linie) nimmt früher ab als die in vivo-Kraft, wahrscheinlich aufgrund einer schnelleren Deaktivierung des EDL-Muskels der Maus im Vergleich zum MG-Muskel der Ratte. Um die Übereinstimmung zwischen den in vivo- und ex vivo-Kräften zu verbessern, wurde der EDL-Muskel der Maus über eine längere Dauer stimuliert (durchgezogene grüne Linie). EMG-basierte Stimulation R2 = 0.55, optimierte Stimulation R2 = 0.91. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

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Ergebnisse

Das Ziel der „Avatar“-Experimente besteht darin, zu replizieren in vivo Kraftentwicklung und Arbeitsleistung so genau wie möglich während ex vivo Work-Loop-Experimente. Diese Studie entschied sich dafür, den EDL-Muskel der Maus als „Avatar“ für den MG-Muskel der Ratte zu verwenden, da sowohl der EDL-Muskel der Maus als auch der MG-Muskel der Ratte hauptsächlich aus schnellzuckenden Muskeln bestehen.20,21. Beide Muskeln sind Hauptbeweger des Spru...

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Diskussion

Während sich Organismen nahtlos durch Landschaften bewegen, variieren die zugrunde liegenden Belastungen und Belastungen, denen die Muskeln ausgesetzt sind, drastisch 1,6,23. Sowohl bei der in vivo Fortbewegung 1,24 als auch in "Avatar"-Experimenten werden die Muskeln unter zyklischen, instationären Bedingungen submaximal stimuliert. Die isometrischen Kraft-Läng...

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Offenlegungen

Alle Autoren erkennen an, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.

Danksagungen

Wir danken Dr. Nicolai Konow für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Daten. Finanziert durch NSF IOS-2016049 und NSF DBI-2021832.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Geflochtenes, nicht resorbierbares Seidennaht 4-0 Mersilk 734H
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2)Sigma-Aldrich1086436Krebs-Henseleit  Lösung
Dextrose Sigma-AldrichD9434Krebs-Henseleit  Lösung
HEPESSigma-AldrichPHR1428Krebs-Henseleit  Lösung
Hydorchlorsäure (HCl)  Sigma-Aldrich1.37055Krebs-Henseleit  Lösung
LabView Data Collection Lab-View
Magnesiumsulfat (MgSO4)Sigma-AldrichM7506Krebs-Henseleit  Lösung
Kaliumchlorid (KCl) Sigma-AldrichP3911Krebs-Henseleit  Lösung
Kaliumphosphat Monobasisch (KH2PO4)Sigma-Aldrich5.43841Krebs-Henseleit  Lösung
S88 StimulatorGrasM643H05Erhältlich bei Ebay Serie
300B HebelsystemAurora1200Abeinhaltet Wassermantel-Gewebebad
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Krebs-Henseleit  Lösung
Natriumchlorid (NaCl) Sigma-AldrichS9888Krebs-Henseleit  Lösung
Natriumhydroxid (NaOH)Sigma-AldrichS5881Krebs-Henseleit  Lösung
Wildtyp-MäuseJackson LaboratoryB6C3Fe a/a Ttn mdm/J

Referenzen

  1. Dickinson, M. H. How Animals move: an integrative view. Science. 288 (5463), 100-106 (2000).
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