Method Article

"Avatar", ein modifiziertes ex vivo Work Loop Experimente mit in vivo Stamm und Aktivierung

DOI:

10.3791/65610

⸱

August 18th, 2023

 , 
1Northern Arizona University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel beschreibt die Methodik zur Emulation der in vivo Muskelkraftproduktion während ex vivo Arbeitsschleifenexperimenten mit einem "Avatar"-Muskel von einem Labornagetier, um die Beiträge von Dehnungstransienten und Aktivierung zur Muskelkraftreaktion zu bewerten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bewegungsverhalten sind emergente Merkmale dynamischer Systeme, die sich aus der Muskelkraftproduktion und der Arbeitsleistung ergeben. Das Zusammenspiel zwischen neuronalen und mechanischen Systemen findet auf allen Ebenen der biologischen Organisation gleichzeitig statt, von der Abstimmung der Eigenschaften der Beinmuskulatur beim Laufen bis hin zur Dynamik der mit dem Boden interagierenden Gliedmaßen. Das Verständnis der Bedingungen, unter denen Tiere ihre neuronalen Kontrollstrategien in Richtung der intrinsischen Muskelmechanik ("Preflexe") in der Kontrollhierarchie verschieben, würde es Muskelmodellen ermöglichen, in vivo Muskelkraft vorherzusagen und genauer zu arbeiten. Um die in vivo Muskelmechanik zu verstehen, ist eine ex vivo Untersuchung der Muskelkraft und -arbeit unter dynamisch variierenden Dehnungs- und Belastungsbedingungen erforderlich, die der in vivo Fortbewegung ähneln. In vivo Dehnungstrajektorien weisen typischerweise abrupte Änderungen auf (d. h. Dehnungs- und Geschwindigkeitstransienten), die sich aus Wechselwirkungen zwischen neuronaler Aktivierung, muskuloskelettaler Kinematik und von der Umgebung aufgebrachten Lasten ergeben. Das Hauptziel unserer "Avatar"-Technik ist es, zu untersuchen, wie Muskeln bei abrupten Änderungen der Dehnungsrate und Belastung funktionieren, wenn der Beitrag der intrinsischen mechanischen Eigenschaften zur Muskelkraftproduktion am höchsten ist. Bei der "Avatar"-Technik wird der traditionelle Work-Loop-Ansatz unter Verwendung von in vivo gemessenen Dehnungstrajektorien und elektromyographischen (EMG) Signalen von Tieren während dynamischer Bewegungen modifiziert, um ex vivo-Muskeln durch mehrere Dehnungs-Verkürzungszyklen zu treiben. Dieser Ansatz ähnelt der Work-Loop-Technik, mit dem Unterschied, dass die in vivo-Dehnungstrajektorien entsprechend skaliert und den ex vivo-Mausmuskeln auferlegt werden, die an einem Servomotor befestigt sind. Diese Technik ermöglicht es: (1) in vivo Dehnung, Aktivierung, Schrittfrequenz und Arbeitsschleifenmuster zu emulieren; (2) diese Muster zu variieren, um die In-vivo-Kraftreaktionen am genauesten abzugleichen; und (3) spezifische Merkmale der Dehnung und/oder Aktivierung in kontrollierten Kombinationen variieren, um mechanistische Hypothesen zu testen.

Introduction

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Bewegte Tiere vollbringen beeindruckende athletische Leistungen in Bezug auf Ausdauer, Geschwindigkeit und Beweglichkeit in komplexen Umgebungen. Die Fortbewegung von Tieren ist im Gegensatz zu von Menschen konstruierten Maschinen besonders beeindruckend – die Stabilität und Beweglichkeit von Robotern, Prothesen und Exoskeletten mit aktuellen Beinen bleibt im Vergleich zu Tieren schlecht. Die Fortbewegung mit den Beinen in natürlichem Gelände erfordert eine präzise Steuerung und schnelle Anpassungen, um die Geschwindigkeit zu ändern und Umgebungsmerkmale zu manövrieren, die als unerwartete Störungen wirken1,2,3,4. Das Verständnis der instationären Fortbewegung ist jedoch von Natur aus eine Herausforderung, da die Dynamik von komplexen Wechselwirkungen zwischen der physischen Umgebung, der Muskel-Skelett-Mechanik und der sensomotorischen Kontrolle abhängt1,2. Die Fortbewegung auf den Beinen erfordert die Reaktion auf unerwartete Störungen mit einer schnellen multimodalen Verarbeitung sensorischer Informationen und einer koordinierten Betätigung von Gliedmaßen und Gelenken1,5. Letztendlich wird Bewegung durch Muskeln ermöglicht, die über intrinsische mechanische Eigenschaften des Bewegungsapparates sowie durch neuronale Kontrolle Kraft erzeugen1 ,5,6,7. Eine offene Frage der Neuromechanik ist, wie diese Faktoren zusammenwirken, um koordinierte Bewegungen als Reaktion auf unerwartete Störungen zu erzeugen. Die folgende Technik nutzt die intrinsische mechanische Reaktion des Muskels auf Verformung unter Verwendung von in vivo Dehnungstrajektorien während kontrollierbarer ex vivo Experimente mit einem "Avatar"-Muskel.

Die Muskelarbeitsschleifentechnik hat einen wichtigen Rahmen für das Verständnis der intrinsischen Muskelmechanik bei zyklischen Bewegungen geschaffen8,9,10. Die traditionelle Arbeitsschleifentechnik treibt die Muskeln durch vordefinierte, typischerweise sinusförmige Dehnungsbahnen unter Verwendung von Frequenzen und Aktivierungsmustern, die während In-vivo-Experimenten gemessen wurden2,8,9,11. Die Verwendung von sinusförmigen Längentrajektorien kann die Arbeit und die Leistungsabgabe während flight12 und swimming2 unter Bedingungen realistisch abschätzen, bei denen die Tiere aufgrund der Wechselwirkung mit der Umwelt und der Muskel-Skelett-Kinematik keine schnellen Änderungen der Dehnungstrajektorien erfahren. In-vivo-Muskelzerrungstrajektorien während der Fortbewegung mit den Beinen ergeben sich jedoch dynamisch aus Wechselwirkungen zwischen neuronaler Aktivierung, muskuloskelettaler Kinematik und Lasten, die von der Umgebung ausgeübt werden5,7,13,14. Eine realistischere Arbeitsschleifentechnik ist erforderlich, um Lasten, Dehnungsverläufe und Krafterzeugung zu emulieren, die der in vivo Muskel-Sehnen-Dynamik entspricht und Einblicke in das Zusammenspiel der intrinsischen Muskelmechanik und der neuronalen Steuerung bietet, um angesichts von Störungen koordinierte Bewegungen zu erzeugen.

Hier stellen wir eine neuartige Methode vor, um in vivo Muskelkräfte während der Fortbewegung auf dem Laufband zu emulieren, indem wir einen "Avatar"-Muskel von einem Labornagetier während kontrollierter ex vivo Experimente mit in vivo Dehnungstrajektorien verwenden, die zeitlich veränderliche in vivo Lasten darstellen. Die Verwendung der gemessenen in vivo-Dehnungstrajektorien eines Zielmuskels auf Muskeln eines Labortieres während kontrollierter ex vivo-Experimente emuliert die Belastungen, die während der Fortbewegung auftreten. In den hier beschriebenen Experimenten wird der ex vivo Maus-Musculus extensor digitorum longus (EDL) als "Avatar" für den in vivo medialen Gastrocnemius (MG)-Muskel der Ratte beim Gehen, Traben und Galoppieren auf einem Laufband verwendet13. Dieser Ansatz ähnelt der Work-Loop-Technik, mit dem Unterschied, dass die in vivo-Dehnungstrajektorien entsprechend skaliert und den ex vivo-Mausmuskeln auferlegt werden, die an einem Servomotor befestigt sind. Während sich die EDL-Muskeln der Maus in Größe, Fasertyp und Architektur im Vergleich zur Ratten-MG unterscheiden, ist es möglich, diese Unterschiede zu kontrollieren. Die "Avatar"-Technik ermöglicht es: (1) in vivo Dehnung, Aktivierung, Schrittfrequenz und Arbeitsschleifenmuster zu emulieren; (2) diese Muster zu variieren, um die In-vivo-Kraftreaktionen am genauesten abzugleichen; und (3) spezifische Merkmale der Dehnung und/oder Aktivierung in kontrollierten Kombinationen variieren, um mechanistische Hypothesen zu testen.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Northern Arizona University genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden Extensor digitorum longus (EDL)-Muskeln von männlichen und weiblichen Wildtyp-Mäusen (Stamm B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J) im Alter von 60-280 Tagen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle) und in einer Kolonie an der Northern Arizona University etabliert.

1. Auswahl der in vivo Dehnungstrajektorie und Vorbereitung für die Verwendung bei ex vivo Arbeitsschleifenexperimenten

HINWEIS: In diesem Protokoll wurden frühere Messungen der dynamischen Fortbewegung in vivo, die den Autoren (Nicolai Konow, UMass Lowell, persönliche Mitteilung) direkt zur Verfügung gestellt wurden, in ex vivo-Experimenten verwendet. Die ursprünglichen Daten wurden für Wakeling et al.15 gesammelt. Zeit-, Längen- oder Dehnungs-, EMG-/Aktivierungs- und Kraftdaten sind erforderlich, um das Protokoll zu replizieren.

  1. Segmentieren Sie die gesamte In-vivo-Studie in einzelne Schritte mit einer beliebigen Programmierplattform (MATLab-Code in Suplementary Coding File 1 bereitgestellt).
    1. Plotten Sie die Längenänderungen im Zeitvergleich für die gesamte In-vivo-Studie. Dies wird verwendet, um einzelne Schritte (Stand zu Stand) zu visualisieren und die Variabilität zwischen den Schritten zu beurteilen (Abbildung 1).
    2. Berechnen Sie die Dehnung für den gesamten Versuch (Länge (L) /Maximale isometrische Kraft bei optimaler Länge L0).
    3. Wählen Sie aus dem gesamten Versuch einen Schritt aus, der repräsentativ für alle Schritte ist und mit ähnlichen Längen beginnt und endet. Dies kann visuell erfolgen, indem die Längen übereinander grafisch dargestellt werden, um jeden Schritt zu vergleichen.
    4. Nachdem Sie einen repräsentativen Schritt ausgewählt haben, segmentieren Sie die Dehnungs-, EMG-/Aktivierungs- und Kraftdaten aus dem gesamten Versuch mit einer beliebigen Programmierplattform (siehe Ergänzende Codierungsdatei 1 für die in MATLab16 verwendeten Codes).
    5. Wenn sich die Abtastfrequenz für Dehnung, EMG/Aktivierung oder Kraft unterscheidet, interpolieren Sie die Datenpunkte so, dass alle mit der gleichen Frequenz abgetastet werden.
      HINWEIS: Forscher können die Häufigkeit der Erfassung anhand der Zeitintervalle zwischen den einzelnen Punkten bestimmen, die in der gesamten Studie abgetastet wurden. Wenn Variablen mit der gleichen Häufigkeit erfasst werden, sind die Abtastzeiten gleich.
  2. Berechnen Sie die Häufigkeit segmentierter Schritte.
    1. Berechnen Sie die Häufigkeit, indem Sie die Dauer eines segmentierten Schritts in Sekunden bestimmen und 1 (Sekunde) durch die Dauer dividieren (1/Dauer = # Schritte pro Sekunde).
    2. Bestimmen Sie manuell, wie viele Datenpunkte in ex vivo-Experimenten erfasst werden müssen, um die Häufigkeit zu erreichen.
    3. Berechnen Sie die Zeit, die für zwei Schritte benötigt wird. Wiederholen Sie die Schritte mindestens einmal, um den Fehler innerhalb der Muskelmessung zu schätzen, der für die nachfolgende statistische Analyse erforderlich ist.
  3. Bestimmen Sie die Phase der Stimulation relativ zum Dehnungseinfall unter Verwendung der gemessenen EMG-Aktivität, um den Beginn und die Dauer der Stimulation für die ex vivo-Arbeitsschleifen zu bestimmen. Jede Programmierplattform kann verwendet werden (siehe Ergänzende Codierungsdatei 1 für den in dieser Studie verwendeten Code).
    1. Betrachten Sie das EMG-Signal über denselben x-Achsenbereich (Zeit) wie die Dehnungsänderung (Abbildung 1). Vergrößern Sie das EMG-Signal, um sichtbar zu sein; Dies kann erreicht werden, indem das EMG-Signal mit einer beliebigen Zahl multipliziert, die Dehnung und das EMG auf die gleiche Skala umskaliert und/oder das EMG-Signal zur Dehnung addiert wird.
      HINWEIS: Die Autoren skalierten die Dehnung und das EMG mit der Funktion "rescale" in MATLab auf die gleiche Skala neu (siehe Ergänzende Abbildung 1).
    2. Ermitteln Sie, wo die EMG-Aktivität beginnt und aufhört, was durch eine Intensitätsänderung von zwei Standardabweichungen angezeigt wird17,18.
      HINWEIS: Je nach Tier und Muskel kann der EMG-Beginn mit dem Fußkontakt übereinstimmen oder nicht (Monica Daley, UC Irvine, persönliche Mitteilung) (siehe Abschnitt Diskussion).
    3. Berechnen Sie den Prozentsatz des Dehnungszyklus (z. B. 40 %), bei dem die EMG-Aktivierung einsetzt, und wie lange die Stimulation andauert (z. B. 222 ms).
      HINWEIS: Die Forscher müssen eine Erregungs-Kontraktions-Kopplungsverzögerung (ECC) berücksichtigen, die sich zwischen In-vivo-Bewegung und Ex-vivo-Arbeitsschleifen unterscheidet und für jedes Tier und jeden Muskel unterschiedlich sein kann (z. B. beträgt die In-vivo-ECC 24,5 ms für Ratten-MG, die Ex-vivo-ECC ~5 ms für Maus-EDL).
  4. Bereiten Sie repräsentative Dehnungseingänge für das Arbeitsschleifen-Controller-Programm vor. Jedes Programm, das die Kraftausgabe mit Eingang für Dehnung und Stimulation erfassen kann, kann für das Arbeitsschleifer-Controller-Programm verwendet werden (siehe Abschnitt Diskussion).
    1. Führen Sie den ausgewählten Schritt aus und interpolieren Sie auf die entsprechende Anzahl von Punkten, die erforderlich ist, um den Schritt zwei Zyklen lang mit In-vivo-Frequenz zu erfassen (siehe Schritt 1.2).
    2. Skalieren Sie den Schritt neu, um bei "Null Dehnung" (z. B. L0 oder 95% L0) zu beginnen und zu stoppen, nachdem Sie sich durch eine vorgegebene Längenabweichung gedehnt haben (siehe Schritt 3.3).
    3. "Skalieren" Sie den ausgewählten Schritt, falls erforderlich, um ihn als Eingabe für Dehnungsänderungen in der Maus-EDL zu verwenden (siehe Abschnitt Diskussion). Wählen Sie zum Skalieren eine Längenauslenkung aus, bis zu der die Maus-EDL ohne Beschädigung gedehnt werden kann (z. B. dehnen wir die Maus-EDL in der Regel um 10 % L0, unabhängig von der in vivo-Spezies). Dies muss sich möglicherweise auf der Grundlage vorläufiger Ergebnisse ändern (siehe Schritt 3.3).

figure-protocol-1
Abbildung 1: Länge über die Zeit der gesamten in vivo-Studie. Länge (mm) aufgetragen gegen die Zeit der Ratte MG. Die Schritte werden durch Kreise von der kürzesten Länge zur kürzesten Länge abgegrenzt, die als Einzelschritt betrachtet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Bewertung der maximalen isometrischen Kraft des Mausmuskels ex vivo

  1. Einrichten von Geräten und Operationen.
    HINWEIS: Im Abschnitt "Diskussion" finden Sie eine Erläuterung der für den Ex-vivo-Arbeitsablauf benötigten Geräte.
    1. Bereiten Sie ein Gewebe-Organ-Bad vor, indem Sie das Oxytube-Nadelventil in das Wassermantel-Gewebebad einführen (siehe Materialtabelle). Schließen Sie das Autogenrohr an eine Gasflasche mit 95 % 02-5 % CO2 an. Lassen Sie 20 psi das Wassermantel-Gewebebad füllen.
    2. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie ein zusätzliches Oxytube von der Gasleitung zu einer mit Krebs-Henseleit-Lösung gefüllten Kristallisationsschale (Schritt 2.1.3) in der Nähe des Operationsbereichs führen. Dies wird verwendet, um die Muskeln während und nach den Operationen belüftet und hydratisiert zu halten.
      HINWEIS: Muskeln können auch bis zu 4 h in dieser belüfteten Lösung gelagert werden, wenn mehr als ein Muskel gleichzeitig aus der Maus entnommen wird.
    3. Bereiten Sie 1 l Krebs-Henseleit-Lösung vor, die (in mmol l-1) Folgendes enthält: NaCl (118); KCl (4,75); MgSO4 (1,18); KH2PO4 (1,18); CaCl2 (2,54); und Glukose (10,0) bei Raumtemperatur und pH-Wert bis 7,4 unter Verwendung von HCl und NaOH (siehe Materialtabelle). Tragen Sie beim Umgang mit HCl und NaOH die richtige PSA aus Schutzbrille und Handschuhen.
    4. Füllen Sie das Bad mit Krebs-Henseleit-Lösung bei Raumtemperatur und pH 7,4. Tauchen Sie den Muskel und den Haken vollständig in die Lösung.
    5. Schalten Sie alle Geräte ein: Dual-Mode-Muskelhebelsystem, Stimulator und Signalschnittstelle (DAQ-Platine) (siehe Materialtabelle).
  2. EDL-Muskeldissektion.
    1. Betäuben Sie die Maus tief und führen Sie dann eine Euthanasie durch Gebärmutterhalsluxation durch. Legen Sie die Maus entweder in eine rechte oder linke seitliche Liegeposition, wobei die obere Hintergliedmaße gestreckt ist und die Zehen das Präparierbrett berühren. Entfernen Sie das Fell vom Knöchel bis oberhalb des Kniegelenks.
    2. Verwöhnen Sie die Haut mit einer Pinzette und schneiden Sie vom Sprunggelenk bis zum Hüftbereich. Sobald der Muskel freigelegt ist, schneiden Sie um den Knöchel herum wie einen "Saum" einer Hose. Ziehe die Haut nach oben, um die Beinmuskulatur besser freizulegen.
    3. Lokalisieren Sie die Faszienlinie, die den Tibialis anterior (TA) und den Gastrocnemius trennt, und trennen Sie sie mit einer Präparierschere, um die Kniesehnen freizulegen. Platzieren Sie eine Präparierschere zwischen den beiden freiliegenden Kniesehnen. Die Schere "verfängt" sich in einer Tasche direkt unter den freiliegenden Kniesehnen. Präparieren Sie stumpf eine "Tasche", während Sie die Schere vom Bein wegziehen, bis die Schere den Knöchel erreicht, um die EDL freizulegen.
    4. Führen Sie mit einem vorgebundenen Schlaufenknoten aus chirurgischem Seidennaht der Größe 4-0 (siehe Materialtabelle) ein Ende der Naht unter die Sehne, die dem Knie am nächsten liegt. Binden Sie einen doppelten quadratischen Knoten über dem proximalen Muskel-Sehnen-Übergang, ohne ihn auf den Muskel zu legen oder die Sehne einzubeziehen. Oberhalb des Knotens einschneiden. Ziehen Sie vorsichtig an der Schlaufe, die an der Sehne befestigt ist, und das EDL tritt aus der "Tasche" aus.
    5. Kleben Sie die Schlaufe an den Präparierbereich, um Spannung im EDL zu erzeugen. Binden Sie einen doppelten quadratischen Knoten mit einem anderen vorgebundenen Schlaufenknoten an der distalen Muskel-Sehnen-Verbindung, ohne ihn auf den Muskel zu legen oder die Sehne einzubeziehen. Schneiden Sie den Knoten an der Seite näher am Bein ab, um das gesamte EDL von der Maus zu entfernen. Schneiden Sie die zusätzliche Naht von den doppelten quadratischen Knoten auf der proximalen und distalen Seite des Muskels ab und legen Sie den Muskel in das belüftete Bad neben dem Operationsbereich.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, welche Seite proximal und/oder distal ist, wenn Sie den Muskel in ein belüftetes Bad legen.
    6. Zum Platzieren auf dem Servomotor-Hebelständer befestigen Sie das EDL vertikal zwischen aufgehängten Platinelektroden. Befestigen Sie den distalen Schlaufenknoten am stationären Haken und befestigen Sie den proximalen Schlaufenknoten an dem Haken, der am Servomotorarm befestigt ist. Heben Sie das Gewebebad an, um den Muskel in die belüftete Krebs-Henseleit-Lösung zu tauchen.
      HINWEIS: Die Belüftung sollte den Muskel nicht stören, wenn er untergetaucht ist. Wenn dies der Fall ist, verringern Sie den Druck des Gases. Lassen Sie die Muskeln 10 Minuten lang ausgleichen, bevor Sie mit der Stimulation beginnen.
  3. Messen Sie die maximale isometrische Kraft des EDL-Muskels.
    HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie ein Protokoll zur Messung der maximalen isometrischen Kraft mit Twitch und Tetanus. Siehe Ergänzende Abbildung 1 für eine Illustration des von den Autoren verwendeten Programms.
    1. Stimulieren Sie den Muskel mit einem supramaximalen Zucken, um sicherzustellen, dass der Muskel während der Operation nicht beschädigt wurde (80 V, 1 pps, 1ms; Tabelle 1; siehe ergänzende Abbildung 2). Wenn keine Beschädigung aufgetreten ist, verwenden Sie den Längenknopf am Muskelhebelsystem, um mit Hilfe der Twitch-Stimulation eine Muskellänge zu ermitteln, bei der die aktive Spannung ~1 V / 0,1271 N mit weniger als ~0,1 V / 0,01271N passiver Spannung beträgt.
    2. Notieren Sie die Ausgangslänge des Muskels von Nahtknoten zu Nahtknoten in Volt und Millimetern. Geben Sie die Messwerte für die Startlänge in den Kalibrierungsteil des Programms ein (siehe Ergänzende Abbildung 1).
    3. Ermitteln Sie die supramaximale isometrische Zuckungskraft bei optimaler Länge (L0) der EDL (Tabelle 1). Technisch gesehen ist keine Ruhephase erforderlich, aber eine Wartezeit von 1 Minute zwischen den Stimulationen stabilisiert die passive Spannung. Notieren Sie die Länge (in Volt), bei der das supramaximale Zucken maximal ist. Dies ist die optimale Muskellänge (L0) für Twitch.
    4. Messen Sie den Muskel mit einem Messschieber bei dieser Länge. Messen Sie den Muskel von Nahtknoten zu Nahtknoten. Sobald L0 gefunden wurde, kürzen Sie den Muskel wieder auf Ausgangslänge (aktive Spannung ~1V / 0,1271 N).
    5. Ermitteln Sie die supramaximale isometrische Tetanuskraft der EDL (80 V, 180 pps, 500 ms; Tabelle 1). Erfassen Sie die Länge (in Volt und Millimetern) der supramaximalen tetanischen Kraft bei L0 und messen Sie die Fasern von Nahtknoten zu Nahtknoten erneut mit Messschiebern.
      HINWEIS: Eine Erhöhung der Muskellänge in Schritten von 0,5 V/0,65 mm führt zu einer genaueren L0 sowohl für Twitch als auch für Tetanus.
    6. Ermitteln Sie die submaximale isometrische Kraft der EDL (45 V, 110 pps, 500 ms; Tabelle 1) bei L0 vor und nach dem Experiment, um sicherzustellen, dass keine Ermüdung durch das Stimulationsprotokoll auftrat. Eine Abnahme der Kraft um 10 % gilt als "ermüdeter" Muskel.
ExperimentierenSimulationsintensität (V)Pulsfrequenz (pps / Hz)Stimulationsdauer (ms)Kommentare
1. "Aufwärmen"8011Erhöht oder verringert die Länge um 0,50 V, um eine passive Spannung von 1 V zu finden
2. Optimale Muskellänge zucken (L0)8011Erhöhen oder verringern Sie die Länge um 0,50 V, um eine passive Spannung von ~1 V zu finden
3. Optimale Muskellänge Tetanus (L0)80180500Pause 3 min zwischen Längenänderung um 0,50 V
4. Submaximum L0 vor dem Experiment45110500Bei Länge von L0
6. Avatar-Experimente45110Zyklisch repräsentative Längenänderungen für Maus-EDL verwenden
7. Submaximales L0 nach dem Experiment45110500Nach dem Experiment zu L0 zurückkehren und L0 messen

Tabelle 1: Stimulationsprotokoll. Stimulationsprotokoll zur Ermittlung der optimalen Länge von supramaximalen und submaximalen Zuckungen und Tetanus. Das Protokoll variiert je nach Stimulationsintensität, Timing und Impulsen pro Sekunde.

3. Vervollständigung der "Avatar"-Arbeitsschleifentechnik unter Verwendung ausgewählter in vivo Dehnungstrajektorien

  1. Richten Sie die Software ein, die erforderlich ist, um die "Avatar"-Arbeitsschleifentechniken zu vervollständigen (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Eine Eingabedatei (.csv oder ähnliches), die die Muskellänge bei jedem Zeitschritt angibt, wird benötigt (siehe Schritt 1.4). Es sind Eingaben für den Prozentsatz des Zyklus, bei dem die Stimulation beginnt, und für die Dauer der Stimulation erforderlich (siehe z. B. ergänzende Abbildung 3).
  2. Schließe die "Avatar"-Arbeitsschleifentechnik ab.
    HINWEIS: Obwohl wir ein benutzerdefiniertes LabView-Programm verwenden, können Forscher jedes Programm verwenden, das die Steuerung von Längenänderungen in der Maus-EDL über einen servomotorischen Hebel, die Steuerung des Beginns (% Zyklus) und der Dauer (ms) der Stimulation zu bestimmten Zeiten sowie die Messung der Muskelkraft ermöglicht. In der ergänzenden Abbildung 3 finden Sie eine Illustration des Programms, das die Autoren verwenden.
    1. Laden Sie die skalierten Dehnungsänderungen mit skalierter Längenexkursion aus Schritt 1.4 in das Programm hoch. Weitere Informationen zu "skalierten Dehnungsänderungen" finden Sie in den Schritten 1.4, 3.3 und im Abschnitt Diskussion.
    2. Passen Sie bei Bedarf die Ausgangslänge des Muskels an (siehe Abschnitt 3.3). Geben Sie die Anfangslänge in V und mm ein, um die Ergebnisse zu kalibrieren (siehe Ergänzende Abbildung 3).
    3. Verwenden Sie den Beginn und die Dauer der Stimulation, die in Schritt 1.3 berechnet wurden.
    4. Lassen Sie den Muskel zwei Zyklen lang durch die skalierten Längenänderungen mit gezielter Längenauslenkung laufen.
    5. Daten speichern. Wenn mehrere Stimulationsprotokolle für denselben Muskel gesammelt werden, warten Sie 3 Minuten zwischen jeder Stimulation.
    6. Stimulieren Sie in optimaler Länge (L0) mit submaximaler Aktivierung, um festzustellen, ob Ermüdung aufgetreten ist. Nimmt die Kraft um mehr als 10 % ab, gelten die Muskeln als ermüdet. Siehe Tabelle 1 für Stimulationsprotokolle.
    7. Entferne den Muskel aus dem Bad. Schneiden Sie Schlaufenknoten vom Muskel ab und tupfen Sie die überschüssige Lösung vom Muskel ab. Wiege den Muskel. Bestimmen Sie die physiologische Querschnittsfläche mit der Standardformel: Muskelmasse/(L0*1,06)19.
  3. Parameter für die "Avatar"-Arbeitsschleifentechnik anpassen (siehe Abschnitt Diskussion).
    1. Bestimmen Sie die Anfangslänge und die Längenauslenkung, indem Sie den passiven Spannungsanstieg ex vivo mit dem in vivo beobachteten passiven Spannungsanstieg abgleichen (Abbildung 2).
      HINWEIS: In dieser Studie wurde der Prozentsatz L0 verwendet, um die Ausgangslänge (mm) und die Exkursion (% L0; siehe Schritt 1.4 und Abschnitt Diskussion) zu skalieren. Für die Anpassung des Spannungsanstiegs in ex vivo Maus-EDL an den des in vivo Ratten-MG fanden die Autoren, dass die Ausgangslänge bei L0 die beste Anpassung ergab (Abbildung 2).
    2. Wählen Sie drei Anfangslängen (z. B. -5 % L0, L0 und +5 % L0). Führen Sie die Arbeitsschleife "Avatar" bei jeder dieser Startlängen mit einer bestimmten Längenabweichung (z. B. 10 % L0) aus.
      HINWEIS: In den vorliegenden "Avatar"-Experimenten mit Maus-EDL wurde eine Längenauslenkung von 10% L0 verwendet.
    3. Wiederholen Sie den Vorgang mit neuen Startlängen und/oder Auslenkungen, bis die Rate des passiven Zuganstiegs ex vivo ähnlich der Rate des passiven Zuganstiegs in vivo ist (siehe Abbildung 2B).
    4. Abhängig von den Fasertypen und der Aktivierungsdynamik der verwendeten Muskeln können Sie die Dauer der Stimulation erhöhen oder verringern, um die Übereinstimmung zwischen ex vivo und in vivo Kraft zu optimieren. Daher kann es notwendig sein, den Beginn und/oder die Dauer der Stimulation so zu ändern, dass sie der in vivo Kraftproduktion während der "Avatar"-Experimente am besten entspricht.
    5. Um zu entscheiden, ob dies notwendig ist (siehe Abschnitt Diskussion), zeichnen Sie die Kraft von "Avatar" und in vivo Muskel über die Zeit (Abbildung 3) und berechnen Sie den Bestimmtheitskoeffizienten R2, indem Sie die skalierte Korrelation zwischen Ziel- und "Avatar"-Muskelkraft quadrieren (siehe Repräsentative Ergebnisse).

figure-protocol-2
Abbildung 2: Passender passiver Spannungsanstieg. Arbeitsschleifen, die den Anstieg der passiven Spannung in vivo und ex vivo zeigen (Pfeile). In vivo skalierte Arbeitsschleife von Ratte MG (schwarz) beim Gehen bei 2,9 Hz (Daten von Wakeling et al.15). Ex-vivo skalierte Arbeitsschleifen von Maus-EDL (grün) bei 2,9 Hz. (A) Die Ausgangslänge des Maus-EDL-Muskels beträgt +5% L0. (B) Die Anfangslänge des EDL-Muskels der Maus beträgtL 0. Beachten Sie, dass der passive Ex-vivo-Spannungsanstieg mit dem in vivo-Spannungsanstieg in A, aber nicht in B übereinstimmt. Dickere Linien zeigen die Stimulation an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-protocol-3
Abbildung 3: Optimierung der Stimulationsdauer von Maus-EDL zur Anpassung an die in vivo-Kraft von Ratten-MG (schwarze Linie). Die Kraft, die von der Maus-EDL mit der EMG-basierten Stimulation (grüne gestrichelte Linie) erzeugt wird, nimmt früher ab als die in vivo-Kraft, wahrscheinlich aufgrund einer schnelleren Deaktivierung der Maus-EDL im Vergleich zu Ratten-MG. Um die Passung zwischen den in vivo und ex vivo Kräften zu optimieren, wurde die Maus-EDL über einen längeren Zeitraum stimuliert (durchgezogene grüne Linie). EMG-basierte Stimulation R2 = 0,55, optimierte StimulationR 2 = 0,91. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Ziel der "Avatar"-Experimente ist es, die in vivo Kraftproduktion und Arbeitsleistung während ex vivo Arbeitsschleifenexperimenten so genau wie möglich zu replizieren. In dieser Studie wurde Maus-EDL als "Avatar" für Ratten-MG verwendet, da Maus-EDL und Ratten-MG hauptsächlich aus schnell zuckenden Muskeln bestehen20,21. Beide Muskeln sind primäre Beweger des Sprunggelenks (EDL-Sprunggelenk-Dorsalflexor, MG-Sprunggelenk-Plantarflexor) mit äh...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Während sich Organismen nahtlos durch Landschaften bewegen, variieren die zugrunde liegenden Belastungen und Belastungen, denen die Muskeln ausgesetzt sind, drastisch 1,6,23. Sowohl bei der in vivo Fortbewegung 1,24 als auch in "Avatar"-Experimenten werden die Muskeln unter zyklischen, instationären Bedingungen submaximal stimuliert. Die isometrischen Kraft-Läng...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Autoren erkennen an, dass es keinen Interessenkonflikt gibt.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Dr. Nicolai Konow für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Daten. Finanziert durch NSF IOS-2016049 und NSF DBI-2021832.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Geflochtenes, nicht resorbierbares Seidennaht 4-0 Mersilk 734H
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2)Sigma-Aldrich1086436Krebs-Henseleit  Lösung
Dextrose Sigma-AldrichD9434Krebs-Henseleit  Lösung
HEPESSigma-AldrichPHR1428Krebs-Henseleit  Lösung
Hydorchlorsäure (HCl)  Sigma-Aldrich1.37055Krebs-Henseleit  Lösung
LabView Data Collection Lab-View
Magnesiumsulfat (MgSO4)Sigma-AldrichM7506Krebs-Henseleit  Lösung
Kaliumchlorid (KCl) Sigma-AldrichP3911Krebs-Henseleit  Lösung
Kaliumphosphat Monobasisch (KH2PO4)Sigma-Aldrich5.43841Krebs-Henseleit  Lösung
S88 StimulatorGrasM643H05Erhältlich bei Ebay Serie
300B HebelsystemAurora1200Abeinhaltet Wassermantel-Gewebebad
Natriumbicarbonat (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Krebs-Henseleit  Lösung
Natriumchlorid (NaCl) Sigma-AldrichS9888Krebs-Henseleit  Lösung
Natriumhydroxid (NaOH)Sigma-AldrichS5881Krebs-Henseleit  Lösung
Wildtyp-MäuseJackson LaboratoryB6C3Fe a/a Ttn mdm/J

References

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