Gaschromatographie-Massenspektrometrie-basierte gezielte Metabolomik von Hartkorallenproben

Zusammenfassung

Hier stellen wir die Extraktion und Präparation von polaren und semipolaren Metaboliten aus einem Korallenholobionten, sowie getrenntem Korallenwirtsgewebe und Symbiodiniaceae-Zellfraktionen für die gaschromatographische Massenspektrometrie-Analyse vor.

Zusammenfassung

Auf Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) basierende Ansätze haben sich als leistungsfähig erwiesen, um die metabolischen Grundlagen der Nesseltier-Dinoflagellaten-Symbiose aufzuklären und wie Korallen auf Stress reagieren (z. B. während der temperaturinduzierten Bleiche). Das Steady-State-Metaboliten-Profiling des Korallen-Holobionten, der den Nesseltierwirt und seine assoziierten Mikroben (Symbiodiniaceae und andere Protisten, Bakterien, Archaeen, Pilze und Viren) umfasst, wurde erfolgreich unter Umgebungs- und Stressbedingungen angewendet, um den ganzheitlichen Stoffwechselstatus der Koralle zu charakterisieren.

Um die Fragen rund um die symbiotischen Interaktionen zu beantworten, ist es jedoch notwendig, die Metabolitenprofile des Korallenwirts und seiner Algensymbionten unabhängig voneinander zu analysieren, was nur durch eine physikalische Trennung und Isolierung der Gewebe erreicht werden kann, gefolgt von einer unabhängigen Extraktion und Analyse. Während die Anwendung der Metabolomik im Korallenbereich relativ neu ist, haben die anhaltenden Bemühungen von Forschungsgruppen zur Entwicklung robuster Methoden zur Analyse von Metaboliten in Korallen geführt, einschließlich der Trennung des Korallenwirtsgewebes und der Algensymbionten.

In diesem Artikel wird eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Holobiontentrennung und die Extraktion von Metaboliten für die GC-MS-Analyse vorgestellt, einschließlich der wichtigsten Optimierungsschritte, die in Betracht gezogen werden sollten. Wir zeigen, dass das kombinierte Metabolitenprofil der beiden Fraktionen (Koralle und Symbiodiniaceae) nach unabhängiger Analyse dem Profil des Ganzen (Holobiont) ähnelt, aber durch die Trennung der Gewebe können wir auch wichtige Informationen über den Stoffwechsel und die Wechselwirkungen zwischen den beiden Partnern erhalten, die aus dem Ganzen allein nicht gewonnen werden können.

Einleitung

Metaboliten stellen die Endprodukte zellulärer Prozesse dar, und die Metabolomik - die Untersuchung der von einem bestimmten Organismus oder Ökosystem produzierten Metaboliten - kann ein direktes Maß für die Funktionsweise von Organismen liefern¹. Dies ist besonders wichtig für die Erforschung von Ökosystemen, symbiotischen Interaktionen und Wiederherstellungswerkzeugen, da das Ziel der meisten Managementstrategien darin besteht, bestimmte Ökosystemdienstleistungen zu erhalten (oder wiederherzustellen)². Korallenriffe sind ein aquatisches Ökosystem, das den potenziellen Wert der Metabolomik für die Aufklärung symbiotisch....

Protokoll

ANMERKUNG: Der Versuchsaufbau, die Probenentnahme und die Lagerung wurden an anderer Stelle ausführlich beschrieben 2,30,31. Die Genehmigung für das Sammeln von Wildkorallen muss vor dem Sammeln und Experimentieren eingeholt werden. Die Proben hier stammen aus Kolonien von Montipora mollis (grüne Farbmorphe), die von Batavia Coral Farms (Geraldton, WA) importiert wurden und ursprünglich von einem Riff vor den Abrohlos-Inseln (Westaustralien; 28°52'43.3"S 114°00'17.0"E) in einer Tiefe von 1 m unter der Aquakulturlizenz AQ1643 gesammelt wurden. Vor der Probenahme wurde....

Ergebnisse

Alle Daten, die während dieser Arbeit erstellt wurden, sind in den Zusatzinformationen verfügbar.

Wirt-Symbionten-Trennung

Abbildung 1: Aufbau und Validierung der Trennung von Korallenwirtsgewebe und Symbiodiniaceae-Zellen. (A) Der Luftpistolenaufbau zur Entnah.......

Diskussion

Die Trennung von Wirt und Symbiont ist durch einfache Zentrifugation leicht und schnell zu erreichen, und die Ergebnisse hier zeigen, dass die Trennung der Fraktionen wertvolle Informationen liefern kann, die auf spezifische Beiträge von Holobiontenmitgliedern hinweisen, die zur funktionellen Analyse der Korallengesundheit beitragen können. In erwachsenen Korallen wird die Lipidsynthese hauptsächlich vom ansässigen Algensymbionten 40 durchgeführt, der Lipide (z. B. Triacylglycerin und Phospholipide)41 und Fettsä.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100% Methanol in LC-Qualität	Merck	439193	LC-Qualität essentielle
2 mL Mikrozentrifugenröhrchen, PP	Eppendorf	30121880	Polypropylen bietet eine hohe Beständigkeit gegen Chemikalien, mechanische Beanspruchung und extreme Temperaturen
2030 Shimadzu Gaschromatograph	Shimadzu	GC-2030
710-1180 & Mikro; m säuregewaschene Glasperlen	Merck	G1152	Diese Größe ist optimal zum Aufbrechen der Symbiodiniaceae-Zellen
AOC-6000 Plus Multifunktionaler Autosampler	Shimadzu	AOC6000
Bradford-Reagenz	Merck	B6916	Jedes kolorimetrische Proteinreagenz ist akzeptabel
Druckluftpistole	Ozito	6270636	Ähnliches Design akzeptabel. Es ist von entscheidender Bedeutung, eine Armatur für einen 1-ml-Kipper zu haben.
DB-5 Säule mit 0,25 mm Innendurchmesser Säule und 1 & micro; m Schichtdicke	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-Sorbitol-6-13C und/oder 13C5– 15N Valin	Merck	605514/ 600148	Dem Methanol können einer oder beide internen Standards zugesetzt werden.
96-Well-Platte mit flachem Boden	Merck	CLS3614
Glasszintillationsfläschchen	Merck	V7130	20 mL, mit nicht-plastischem Siegel
Immunoglogin G	Merck	56834	wenn nicht verfügbar, Rinderserumalbumin ist akzeptabel
Primer	v4
		v3.6
Natriumhydroxid	Merck	S5881	Pellets zur Herstellung von 1 M Lösung
Tidyverse		v1.3.1	R Paket
TissueLyser LT	Qiagen	85600	Oder ähnlich
TQ8050NX Triple Quadrupol Massenspektrometer	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
UV-96 Well-Platte	Greiner	M3812
Whirl-Pak Probenbeutel	Merck	WPB01018WA	Probenentnahmebeutel; Größe: groß genug, um ein ~5 cm großes Korallenfragment aufzunehmen, aber nicht zu groß, dass das Wasser zu weit gestreut wird

: , , R v4.1.2 Shimadzu LabSolutions Insight Software