Hier stellen wir eine Affinitätsreinigungsmethode eines fibrinolytischen Enzyms aus Sipunculus nudus vor, die einfach, kostengünstig und effizient ist.
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Methodenartikel
Affinitätsreinigung eines fibrinolytischen Enzyms aus Sipunculus nudus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das fibrinolytische Enzym aus Sipunculus nudus (sFE) ist ein neuartiges Fibrinolytikum, das sowohl Plasminogen zu Plasmin aktivieren als auch Fibrin direkt abbauen kann, was große Vorteile gegenüber herkömmlichen Thrombolytika aufweist. Aufgrund des Mangels an strukturellen Informationen basieren jedoch alle Aufreinigungsprogramme für sFE auf mehrstufigen chromatographischen Aufreinigungen, die zu kompliziert und kostspielig sind. In dieser Arbeit wird erstmalig ein Affinitätsreinigungsprotokoll von sFE entwickelt, das auf einer Kristallstruktur von sFE basiert; Es umfasst die Vorbereitung der Rohprobe und der Lysin/Arginin-Agarose-Matrix-Affinitätschromatographie-Säule, die Affinitätsreinigung und die Charakterisierung der gereinigten sFE. Nach diesem Protokoll kann eine Charge sFE innerhalb von 1 Tag gereinigt werden. Darüber hinaus erhöht sich die Reinheit und Aktivität des gereinigten sFE auf 92 % bzw. 19.200 U/ml. Somit ist dies ein einfacher, kostengünstiger und effizienter Ansatz für die sFE-Reinigung. Die Entwicklung dieses Protokolls ist von großer Bedeutung für die weitere Verwendung von sFE und anderen ähnlichen Wirkstoffen.
Einleitung
Thrombosen stellen eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, insbesondere nach der globalen Covid-19-Pandemie 1,2. Klinisch werden viele Plasminogenaktivatoren (PAs), wie z. B. Gewebetyp-Plasminogenaktivatoren (tPA) und Urokinase (UK), häufig als thrombolytische Arzneimittel eingesetzt. PAs können das Plasminogen des Patienten in aktives Plasmin aktivieren, um Fibrin abzubauen. Daher ist ihre thrombolytische Effizienz durch den Plasminogenstatus der Patienten stark eingeschränkt 3,4. Fibrinolytika wie Metalloproteinase-Plasmin und Serin-Plasmin sind eine weitere Art von klinischen thrombolytischen Arzneimitteln, zu denen auch fibrinolytische Enzyme (FE) wie Plasmin gehören, die Gerinnsel direkt auflösen können, aber durch verschiedene Plasmininhibitoren schnell inaktiviert werden5. In der Folge wurde über eine neuartige Art von Fibrinolytikum berichtet, das den Thrombus auflösen kann, indem es nicht nur das Plasminogen in Plasmin aktiviert, sondern auch das Fibrindirekt abbaut 6-das fibrinolytische Enzym aus dem alten Erdnusswurm Sipunculus nudus (sFE)6. Diese Bifunktion verleiht sFE weitere Vorteile gegenüber herkömmlichen Thrombolytika, insbesondere in Bezug auf den abnormen Plasminogenstatus. Im Vergleich zu anderen bifunktionellen Fibrinolytika 7,8,9 weist sFE mehrere Vorteile, einschließlich der Sicherheit, gegenüber Non-Food-Wirkstoffen für die Arzneimittelentwicklung, insbesondere für orale Arzneimittel, auf. Dies liegt daran, dass die biologische Sicherheit und Biokompatibilität von Sipunculus nudus gut belegt sind10.
Ähnlich wie bei den anderen natürlichen Fibrinolytika, die aus Mikroorganismen, Regenwürmern und Pilzen isoliert werden, ist die Reinigung von sFE aus S. nudus sehr kompliziert und umfasst mehrere Stufen wie Gewebehomogenisierung, Ammoniumsulfatausfällung, Entsalzung, Anionenaustauschchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie und Molekularsiebung10,11,12. Ein solches Reinigungssystem hängt nicht nur von kompetenten Fähigkeiten und teuren Materialien ab, sondern benötigt auch mehrere Tage, um das gesamte Verfahren abzuschließen. Daher ist ein einfaches Reinigungsprogramm von sFE von großer Bedeutung für die weitere Entwicklung von sFE. Glücklicherweise konnten zwei Kristalle von sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) erfolgreich erhalten wurden (siehe Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2). Durch Strukturanalysen und molekulare Docking-Experimente fanden wir heraus, dass der katalytische Kern von sFE spezifisch an Targets binden kann, die Arginin- oder Lysinreste enthalten.
In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein Affinitätsreinigungssystem vorgeschlagen, das auf der Kristallstruktur von sFE basiert. Durch die Befolgung dieses Protokolls konnte hochreines und hochaktives sFE aus den Rohextrakten in einer einzigen Affinitätsreinigungsstufe gereinigt werden. Das hier entwickelte Protokoll ist nicht nur für die großtechnische Herstellung von sFE wichtig, sondern kann auch für die Aufreinigung anderer Fibrinolytika eingesetzt werden.
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Protokoll
1. Vorbereitung
- Probenbehandlung
- Frischen S. nudus (100 g) vorsichtig präparieren und den Darm und seine innere Flüssigkeit auffangen.
- Zur Homogenisierung (1.000 U/min, 60 s) werden 300 ml Tris-HCl-Puffer (0,02 M, pH 7,4) zugegeben.
- Das Homogenat 3x einfrieren und auftauen.
- Die Probe wird zentrifugiert (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) und der Überstand aufgefangen. Lagern Sie die Probe bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
- Protein-Fällung
- Mischen Sie den Überstand mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung (neun Volumen) und lassen Sie die Mischung 12 h bei 4 °C stehen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert und später fortgesetzt werden. - Zentrifugieren (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C), um den Proteinausschlag zu erhalten; Lagern Sie es bei 4 °C für die spätere Verwendung.
- Mischen Sie den Überstand mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung (neun Volumen) und lassen Sie die Mischung 12 h bei 4 °C stehen.
- Protein-Resuspension
- Resuspendieren Sie das Proteinpräzipitat mit 30 ml Tris-HCl-Puffer (0,02 M, pH 7,4). Lagern Sie diese Rohproteinlösung für die spätere Verwendung bei 4 °C.
2. Affinitätschromatographie
- Filtration der Lösung
- Filtrieren Sie die Rohproteinlösung durch eine 0,22 μm dicke Filtermembran. Bewahren Sie diese Probe zur späteren Verwendung bei 4 °C auf.
- Kolonnen-Packung
- Packen Sie die Arginin-Agarose-Matrix-Affinitätschromatographie-Säule und die Lysin-Agarose-Matrix-Affinitätschromatographie-Säule, indem Sie eine geeignete Menge Lysin-Agarose-Matrixmedium und Arginin-Agarose-Matrix-Matrixmedium in leere 5-ml-Chromatographiesäulen füllen.
HINWEIS: Die Säule kann bei 2-8 °C gelagert werden, wobei die Matrix in einen Speicherpuffer (20 % Ethanol) getaucht wird.
- Packen Sie die Arginin-Agarose-Matrix-Affinitätschromatographie-Säule und die Lysin-Agarose-Matrix-Affinitätschromatographie-Säule, indem Sie eine geeignete Menge Lysin-Agarose-Matrixmedium und Arginin-Agarose-Matrix-Matrixmedium in leere 5-ml-Chromatographiesäulen füllen.
- Reinigung der Affinität
- Äquilibrieren Sie die Affinitätschromatographiesäule zuerstmit ddH2O (1 ml/min, 10 Säulenvolumen), gefolgt von Tris-HCl-Puffer (0,02 M, pH 8,0, 1 ml/min, 5 Säulenvolumen).
- Laden Sie die Proteinlösungsprobe auf die voräquilibrierte Säule (1 ml/min, 1/3 Säulenvolumen).
HINWEIS: Das Volumen der Probenbeladung hängt von der sFE-Konzentration ab. - Waschen Sie die Säule mit Tris-HCl-Puffer (0,02 M, pH 8,0, fünf Säulenvolumen).
- Die Säule wird nacheinander mit 0,15 m, 0,25 m, 0,35 m, 0,45 m, 0,55 m und 0,65 m NaCl (1 ml/min, fünf Säulenvolumina) eluiert.
- Suchen Sie nach dem Elutionspeak, der in der 0,15 M NaCl-Elution erscheinen sollte, und sammeln Sie dann die Fraktionen in 5-ml-Röhrchen.
- Die Elutionsprobe wird mit einem 3 kD Ultrazentrifugalfilter (3.944 × g, 1,5 h, 4 °C) konzentriert. Lagern Sie diese Probe zur späteren Verwendung bei -80 °C.
3. Bewertung der Reinheit
- Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gelpräparation (SDS-PAGE)
- Bereiten Sie das SDS-PAGE-Gel nach der Laemmli-Methode mit 5 % konzentriertem Gel und 12 % Trenngel13 vor.
- Elektrophorese
- Mischen Sie die Probe (15 μL) mit 5x SDS-PAGE-Proteinladepuffer (1/4 Volumen), erhitzen Sie sie 5 min lang in kochendem Wasser, laden Sie sie auf das SDS-PAGE-Gel und lassen Sie das Gel 1,5 h lang bei 80 V, 60 mA laufen.
- Analyse
- Färben Sie das Gel nach der Elektrophorese mit einem Silberfärbe-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers und beobachten Sie das gefärbte Gel mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem.
- Analysieren Sie die Reinheit des Zielproteins mit der folgenden Formel: Reinheit des Zielproteins = Intensitätswert des Zielproteins / Intensitätswert des Gesamtproteins.
4. Bewertung der fibrinolytischen Aktivität
- Vorbereitung der Fibrinplatte
- Bereiten Sie die Fibrinogenlösung vor, indem Sie 25 mg Fibrinogen mit 1,25 ml physiologischer Kochsalzlösung mischen.
- Bereiten Sie die Thrombinlösung vor, indem Sie 100 U Thrombin vollständig mit 1,05 ml physiologischer Kochsalzlösung mischen.
- Bereiten Sie die Agaroselösung vor, indem Sie 0,5 g Agarose zu 22,5 ml Tris-HCl-Puffer (0,02 mol/l, pH 7,4) hinzufügen. Mischen und erhitzen Sie die Agaroselösung bei 100 °C, bis sie sich vollständig aufgelöst hat.
- Die Agaroselösung auf ca. 50 °C abkühlen lassen und Fibrinogenlösung zugeben. Fügen Sie dann sofort die Thrombinlösung hinzu, mischen Sie sie schnell und gießen Sie sie in eine 60-mm-Kulturschale.
- Laden
- Stanzen Sie mit einem sterilen Bohrer 3 mm Wells auf die vorbereiteten Fibrinplatten und füllen Sie die Wells mit 10 μL Proben.
- Analyse
- Messen Sie nach 18 Stunden Inkubation bei 37 °C die fibrinolytische Aktivität, indem Sie die Größe ihrer Abbauzonen berechnen. Fibrinolytische Aktivität = (Zonengröße der Probe/Zonengröße der Urokinase) x 100 U. Zonengröße = Durchmesser x Durchmesser.
ANMERKUNG: Physiologischer Kochsalzpuffer, Rohprotein (Probe aus Protokollschritt 1.3.1) und Urokinase wurden für die Blind-, Negativ- bzw. Positivkontrolle verwendet. Im Vergleich zur Urokinase fanden wir heraus, dass die fibrinolytische Aktivität der gereinigten sFE ~19.200 U/ml betrug.
- Messen Sie nach 18 Stunden Inkubation bei 37 °C die fibrinolytische Aktivität, indem Sie die Größe ihrer Abbauzonen berechnen. Fibrinolytische Aktivität = (Zonengröße der Probe/Zonengröße der Urokinase) x 100 U. Zonengröße = Durchmesser x Durchmesser.
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Ergebnisse
Nach diesem Protokoll wurden Rohgewebelysate extrahiert, Arginin-Agarose-Matrix- und Lysin-Agarose-Matrix-Affinitätschromatographie-Säulen gebaut, gereinigte sFE erhalten und die Reinheit und fibrinolytische Aktivität der gereinigten sFE mit SDS-PAGE- bzw. Fibrinplatten gemessen.
Nach der Zentrifugation war der gesammelte Überstand eine durchsichtige, hellbraune, viskose Flüssigkeit. Die Ausfällung begann, wenn dieser Überstand mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung (neun Volumen) gemischt wurde...
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Diskussion
Da die exakte Gensequenz von sFE nicht verfügbar war, wurde die derzeit verwendete sFE aus frischem S. nudus14 extrahiert. Darüber hinaus waren die in der Literatur beschriebenen Reinigungsverfahren von sFE kompliziert und kostspielig, da sie auf einigen allgemeinen Merkmalen von sFE basierten, wie z. B. Molekulargewicht, isoelektrischer Punkt, Ionenstärke und Polarität15,16. Bisher wurde kein Affinitätsreinigungsprotokoll von sFE...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Forschung wurde vom Wissenschafts- und Technologiebüro der Stadt Xiamen (3502Z20227197) und dem Wissenschafts- und Technologiebüro der Provinz Fujian (Nr. 2019J01070, Nr. 2021Y0027) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 30% Acrylamid-Bisacrylamid (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammoniumpersulfat | SINOPHARM | ||
| Ammoniumsulfat | SINOPHARM | ||
| Arginin-Sepharose 4B | Solarbio | Arginin-Agarose-Matrix | |
| Bromoxylenolblau (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycin | , Solarbio | ||
| Salzsäure | , SINOPHARM | ||
| Kinase, | RHAWN | ||
| , Lysin-Sepharose 4B | Solarbio | Lysin-Agarose-Matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Vorgefärbter Farbproteinmarker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Natriumchlorid | SINOPHARM | ||
| Natriumdodecylsulfonat (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Natriumhydroxid | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris (Hydroxymethyl) Aminomethan | Solarbio | ||
| Tris (Hydroxymethyl) Aminomethan Hydrochlorid | Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Aufreinigungssystem rein | GE | ||
| Automatischer vertikaler Druckdampfsterilisator MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemilumineszenz-Bildgebungssystem | GE | ||
| Konstantstrompumpe BT-100 | QITE | ||
| Inkubator mit konstanter Temperatur | JINGHONG | ||
| Desktop-Kühlzentrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Serie Heiz- und Trockenofen DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Elektrischer Glashomogenisator DY89-II | SCIENTZ | ||
| Elektronische Analysenwaage | DENVER | ||
| Elektrothermostatisches Wasserbad DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontaler Entfärbungsschüttler | Kylin-Bell | ||
| Eismaschine AF 103 | Schotte | ||
| KQ-500E Ultraschallreiniger | ShuMei | ||
| Magnetrührer | Zhi wei | ||
| Mikrokühlzentrifuge H1650-W | Cence | ||
| Mikrowellenherd | Galanz | ||
| Milli-Q Referenz | Millipore | ||
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Präzisions-Desktop>pH-Messgerät | Sartorious | ||
| kleiner Vortex-Oszillator | Kylin-Bell | ||
| Vertikales Elektrophoresesystem | Bio-Rad | ||
| 200 & Mikro L PCR-Röhrchen (200 & Mikro; L) | Axygene | ||
| Zentrifugenröhrchen (1,5 mL) | Biosharp | ||
| Zentrifugenröhrchen (5 mL) | Biosharp | ||
| Zentrifugenröhrchen (50 mL) | NEST | ||
| Zentrifugenröhrchen (7 mL) | Biosharp | ||
| Kulturschale (60 mm) | NEST | ||
| Filtermembran (0,22 &Mikro; m) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipettenspitze (1 mL) | KIRGEN | ||
| Pipettenspitze (10 & Mikro; L) | Axygene | ||
| Pipettenspitze (200 &Mikro; L) | Axygene | ||
| Spezial-Indikatorpapier | TZAKZY | ||
| Ultra Zentrifugalfiltereinheit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Zentrifugalfiltereinheit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indikator | SSS Reagenz |
Referenzen
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