Affinitätsreinigung eines fibrinolytischen Enzyms aus Sipunculus nudus

Thrombosen stellen eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, insbesondere nach der globalen Covid-19-Pandemie ^1,2. Klinisch werden viele Plasminogenaktivatoren (PAs), wie z. B. Gewebetyp-Plasminogenaktivatoren (tPA) und Urokinase (UK), häufig als thrombolytische Arzneimittel eingesetzt. PAs können das Plasminogen des Patienten in aktives Plasmin aktivieren, um Fibrin abzubauen. Daher ist ihre thrombolytische Effizienz durch den Plasminogenstatus der Patienten stark eingeschränkt ^3,4. Fibrinolytika wie Metalloproteinase-Plasmin und Serin-Plasmin sind eine weitere Art von klinischen thrombolytischen Arzneimitteln, zu denen auch fibrinolytische Enzyme (FE) wie Plasmin gehören, die Gerinnsel direkt auflösen können, aber durch verschiedene Plasmininhibitoren schnell inaktiviert werden⁵. In der Folge wurde über eine neuartige Art von Fibrinolytikum berichtet, das den Thrombus auflösen kann, indem es nicht nur das Plasminogen in Plasmin aktiviert, sondern auch das Fibrin^{direkt abbaut} 6-das fibrinolytische Enzym aus dem alten Erdnusswurm Sipunculus nudus (sFE)⁶. Diese Bifunktion verleiht sFE weitere Vorteile gegenüber herkömmlichen Thrombolytika, insbesondere in Bezug auf den abnormen Plasminogenstatus. Im Vergleich zu anderen bifunktionellen Fibrinolytika ^7,8,9 weist sFE mehrere Vorteile, einschließlich der Sicherheit, gegenüber Non-Food-Wirkstoffen für die Arzneimittelentwicklung, insbesondere für orale Arzneimittel^, auf. Dies liegt daran, dass die biologische Sicherheit und Biokompatibilität von Sipunculus nudus gut belegt sind¹⁰.

Ähnlich wie bei den anderen natürlichen Fibrinolytika, die aus Mikroorganismen, Regenwürmern und Pilzen isoliert werden, ist die Reinigung von sFE aus S. nudus sehr kompliziert und umfasst mehrere Stufen wie Gewebehomogenisierung, Ammoniumsulfatausfällung, Entsalzung, Anionenaustauschchromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie und Molekularsiebung^10,11,12. Ein solches Reinigungssystem hängt nicht nur von kompetenten Fähigkeiten und teuren Materialien ab, sondern benötigt auch mehrere Tage, um das gesamte Verfahren abzuschließen. Daher ist ein einfaches Reinigungsprogramm von sFE von großer Bedeutung für die weitere Entwicklung von sFE. Glücklicherweise konnten zwei Kristalle von sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) erfolgreich erhalten wurden (siehe Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2). Durch Strukturanalysen und molekulare Docking-Experimente fanden wir heraus, dass der katalytische Kern von sFE spezifisch an Targets binden kann, die Arginin- oder Lysinreste enthalten.

In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein Affinitätsreinigungssystem vorgeschlagen, das auf der Kristallstruktur von sFE basiert. Durch die Befolgung dieses Protokolls konnte hochreines und hochaktives sFE aus den Rohextrakten in einer einzigen Affinitätsreinigungsstufe gereinigt werden. Das hier entwickelte Protokoll ist nicht nur für die großtechnische Herstellung von sFE wichtig, sondern kann auch für die Aufreinigung anderer Fibrinolytika eingesetzt werden.

1. Vorbereitung

1. Probenbehandlung
   1. Frischen S. nudus (100 g) vorsichtig präparieren und den Darm und seine innere Flüssigkeit auffangen.
   2. Zur Homogenisierung (1.000 U/min, 60 s) werden 300 ml Tris-HCl-Puffer (0,02 M, pH 7,4) zugegeben.
   3. Das Homogenat 3x einfrieren und auftauen.
   4. Die Probe wird zentrifugiert (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C) und der Überstand aufgefangen. Lagern Sie die Probe bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
2. Protein-Fällung
   1. Mischen Sie den Überstand mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung (neun Volumen) und lassen Sie die Mischung 12 h bei 4 °C stehen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert und später fortgesetzt werden.
   2. Zentrifugieren (10.956 × g, 0,5 h, 4 °C), um den Proteinausschlag zu erhalten; Lagern Sie es bei 4 °C für die spätere Verwendung.
3. Protein-Resuspension
   1. Resuspendieren Sie das Proteinpräzipitat mit 30 ml Tris-HCl-Puffer (0,02 M, pH 7,4). Lagern Sie diese Rohproteinlösung für die spätere Verwendung bei 4 °C.

2. Affinitätschromatographie

1. Filtration der Lösung
   1. Filtrieren Sie die Rohproteinlösung durch eine 0,22 μm dicke Filtermembran. Bewahren Sie diese Probe zur späteren Verwendung bei 4 °C auf.
2. Kolonnen-Packung
   1. Packen Sie die Arginin-Agarose-Matrix-Affinitätschromatographie-Säule und die Lysin-Agarose-Matrix-Affinitätschromatographie-Säule, indem Sie eine geeignete Menge Lysin-Agarose-Matrixmedium und Arginin-Agarose-Matrix-Matrixmedium in leere 5-ml-Chromatographiesäulen füllen.
      HINWEIS: Die Säule kann bei 2-8 °C gelagert werden, wobei die Matrix in einen Speicherpuffer (20 % Ethanol) getaucht wird.
3. Reinigung der Affinität
   1. Äquilibrieren Sie die Affinitätschromatographiesäule zuerstmit ddH2O (1 ml/min, 10 Säulenvolumen), gefolgt von Tris-HCl-Puffer (0,02 M, pH 8,0, 1 ml/min, 5 Säulenvolumen).
   2. Laden Sie die Proteinlösungsprobe auf die voräquilibrierte Säule (1 ml/min, 1/3 Säulenvolumen).
      HINWEIS: Das Volumen der Probenbeladung hängt von der sFE-Konzentration ab.
   3. Waschen Sie die Säule mit Tris-HCl-Puffer (0,02 M, pH 8,0, fünf Säulenvolumen).
   4. Die Säule wird nacheinander mit 0,15 m, 0,25 m, 0,35 m, 0,45 m, 0,55 m und 0,65 m NaCl (1 ml/min, fünf Säulenvolumina) eluiert.
   5. Suchen Sie nach dem Elutionspeak, der in der 0,15 M NaCl-Elution erscheinen sollte, und sammeln Sie dann die Fraktionen in 5-ml-Röhrchen.
   6. Die Elutionsprobe wird mit einem 3 kD Ultrazentrifugalfilter (3.944 × g, 1,5 h, 4 °C) konzentriert. Lagern Sie diese Probe zur späteren Verwendung bei -80 °C.

3. Bewertung der Reinheit

1. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gelpräparation (SDS-PAGE)
   1. Bereiten Sie das SDS-PAGE-Gel nach der Laemmli-Methode mit 5 % konzentriertem Gel und 12 % Trenngel¹³ vor.
2. Elektrophorese
   1. Mischen Sie die Probe (15 μL) mit 5x SDS-PAGE-Proteinladepuffer (1/4 Volumen), erhitzen Sie sie 5 min lang in kochendem Wasser, laden Sie sie auf das SDS-PAGE-Gel und lassen Sie das Gel 1,5 h lang bei 80 V, 60 mA laufen.
3. Analyse
   1. Färben Sie das Gel nach der Elektrophorese mit einem Silberfärbe-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers und beobachten Sie das gefärbte Gel mit einem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem.
   2. Analysieren Sie die Reinheit des Zielproteins mit der folgenden Formel: Reinheit des Zielproteins = Intensitätswert des Zielproteins / Intensitätswert des Gesamtproteins.

4. Bewertung der fibrinolytischen Aktivität

1. Vorbereitung der Fibrinplatte
   1. Bereiten Sie die Fibrinogenlösung vor, indem Sie 25 mg Fibrinogen mit 1,25 ml physiologischer Kochsalzlösung mischen.
   2. Bereiten Sie die Thrombinlösung vor, indem Sie 100 U Thrombin vollständig mit 1,05 ml physiologischer Kochsalzlösung mischen.
   3. Bereiten Sie die Agaroselösung vor, indem Sie 0,5 g Agarose zu 22,5 ml Tris-HCl-Puffer (0,02 mol/l, pH 7,4) hinzufügen. Mischen und erhitzen Sie die Agaroselösung bei 100 °C, bis sie sich vollständig aufgelöst hat.
   4. Die Agaroselösung auf ca. 50 °C abkühlen lassen und Fibrinogenlösung zugeben. Fügen Sie dann sofort die Thrombinlösung hinzu, mischen Sie sie schnell und gießen Sie sie in eine 60-mm-Kulturschale.
2. Laden
   1. Stanzen Sie mit einem sterilen Bohrer 3 mm Wells auf die vorbereiteten Fibrinplatten und füllen Sie die Wells mit 10 μL Proben.
3. Analyse
   1. Messen Sie nach 18 Stunden Inkubation bei 37 °C die fibrinolytische Aktivität, indem Sie die Größe ihrer Abbauzonen berechnen. Fibrinolytische Aktivität = (Zonengröße der Probe/Zonengröße der Urokinase) x 100 U. Zonengröße = Durchmesser x Durchmesser.
      ANMERKUNG: Physiologischer Kochsalzpuffer, Rohprotein (Probe aus Protokollschritt 1.3.1) und Urokinase wurden für die Blind-, Negativ- bzw. Positivkontrolle verwendet. Im Vergleich zur Urokinase fanden wir heraus, dass die fibrinolytische Aktivität der gereinigten sFE ~19.200 U/ml betrug.

Nach diesem Protokoll wurden Rohgewebelysate extrahiert, Arginin-Agarose-Matrix- und Lysin-Agarose-Matrix-Affinitätschromatographie-Säulen gebaut, gereinigte sFE erhalten und die Reinheit und fibrinolytische Aktivität der gereinigten sFE mit SDS-PAGE- bzw. Fibrinplatten gemessen.

Nach der Zentrifugation war der gesammelte Überstand eine durchsichtige, hellbraune, viskose Flüssigkeit. Die Ausfällung begann, wenn dieser Überstand mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung (neun Volumen) gemischt wurde. Nach 12 h Standzeit bildete sich ein starker Niederschlag am Boden des Rohres. Wenn es mit Tris-HCl-Puffer resuspendiert wurde, verschwand der Proteinniederschlag schnell und löste sich im Puffer auf, so dass er als durchsichtige blassgelbe Flüssigkeit erschien.

Wenn die Proteinlösung auf die Arginin-Agarose-Matrix-Affinitätssäule geladen wurde, erschien ein offensichtlicher Peak (Peak 1, Flowthrough-Peak) bei ~40 min und hörte bei ~66 min auf zu eluieren. In der Gradienten-Elutionsphase erschien bei der Eluation mit 0,15 M NaCl ein deutlicher Peak (Peak 2, Elutionspeak) bei ~94 min und hörte bei ~110 min auf zu eluieren. In den übrigen Elutionsstufen (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M und 0,65 M NaCl) traten keine offensichtlichen Elutionspeaks auf (Abbildung 1A). In dieser Studie haben wir die Arginin-Agarose-Matrix-Affinitätssäule bis zu 10 Mal wiederverwendet und festgestellt, dass die Leistung der Säule nicht signifikant verändert wurde.

Als die Proteinlösung in die Lysin-Agarose-Matrix-Affinitätssäule geladen wurde, trat ein deutlicher Peak (Peak 1, Flowthrough-Peak) bei ~38 min auf und hörte bei ~60 min auf zu eluieren. In der Gradienten-Elutionsphase trat bei der Eluation mit 0,15 M NaCl ein deutlicher Peak (Peak 2, Elutionspeak) bei ~80 min auf und hörte bei ~86 min auf zu eluieren. In den übrigen Elutionsstufen (0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M und 0,65 M NaCl) traten keine offensichtlichen Elutionspeaks auf (Abbildung 1B). Die Elutionsprofile der Arginin-Agarose-Matrix-Affinitätssäule und der Lysin-Agarose-Matrix-Affinitätssäule waren ähnlich. Wie bereits erwähnt, hat die bis zu 10-malige Wiederverwendung der Arginin-Agarose-Matrix-Affinitätsspalte die Leistung dieser Säule nicht verändert.

Gereinigtes sFE (10 μL, Elutionspeakprobe, Peak 2) wurde der präparierten Fibrinplatte zugesetzt. Zusätzlich wurden 10 μl Urokinase (100 U), 10 μl physiologischer Kochsalzpuffer und 10 μl Rohprotein (Probe aus Protokollschritt 1.3.1) für die Positiv-, Blind- bzw. Negativkontrolle verwendet. Nach 18 h Inkubation zeigten zwei Fibrinplatten ähnliche Ergebnisse: Eine Lysezone (1,3 cm Durchmesser) erschien in der Urokinase-Kontrolle; Es wurde keine Lysezone im physiologischen Kochsalzpuffer beobachtet; In der Rohproteinvertiefung erschien eine Lysezone (2,1 cm Durchmesser); und eine Lysezone (1,8 cm Durchmesser) erschien in der gereinigten sFE-Vertiefung (Abbildung 2). Im Vergleich zur Urokinase fanden wir heraus, dass die fibrinolytische Aktivität der gereinigten sFE ~19.200 U/ml betrug. Da die Elutionspeakprobe auf das gleiche Volumen wie das der auf die Affinitätssäule geladenen Probe eingestellt wurde, wird die Wiederfindungsrate der Affinitätssäule durch die Größe (Durchmesser x Durchmesser) der Lysezone auf der Fibrinplatte angegeben. Die Wiederfindungsrate der Affinitätsspalte betrug ~73,5 %.

Für die Reinheitsanalyse wurden das Rohprotein (im Protokollschritt 1.3.1 gewonnene Probe) und das gereinigte sFE (Elutionspeakprobe, Peak 2) verwendet. Nach SDS-PAGE und Färbung wurden drei Hauptproteinbanden (25, 26 und 27 kD) und sechs Nebenbanden (20, 24, 28, 35, 40 und 45 kD) im Rohprotein präsentiert. Eine Hauptbande (27 kD) und zwei Nebenbanden (26 und 28 kD) wurden in der gereinigten sFE dargestellt (Abbildung 3). Durch die Grauwertanalyse stellten wir fest, dass die Reinheit von gereinigtem sFE bis zu ~92% betrug.

Abbildung 1: Das Profil der Affinitätsreinigung . (A) Die rohe sFE-Probe wurde durch Arginin-Agarose-Matrix-Affinitätsreinigung gereinigt. Ein deutlicher Durchflusspeak trat bei ~40 min auf und hörte bei ~66 min auf zu eluieren. Ein deutlicher Elutionspeak trat bei ~94 min auf und hörte bei ~110 min auf zu eluieren. (B) Die rohe sFE-Probe wurde durch Lysin-Agarose-Matrix-Affinitätsreinigung gereinigt. Ein deutlicher Durchflusspeak trat bei ~38 min auf und hörte bei ~60 min auf zu eluieren. Ein deutlicher Elutionspeak trat bei ~80 min auf und hörte bei ~86 min auf zu eluieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Bewertung der fibrinolytischen Aktivität. Die Proben wurden in die Fibrinplatte gegeben und ihre fibrinolytische Aktivität wurde anhand ihrer Abbauzonen auf der Platte nach 18 h gemessen und bewertet. Unterschiedlich behandelte Proben sind durch rote arabische Ziffern gekennzeichnet. (A) Die fibrinolytische Aktivität von sFE, gereinigt durch eine Arginin-Agarose-Matrix-Affinitätssäule. #1, 100 U Urokinase; #2, physiologischer Kochsalzpuffer; #3, Rohprotein (Probe aus Protokollschritt 1.3.1); #4, gereinigte sFE (Elutionspeakprobe, Peak 2). (B) Die fibrinolytische Aktivität von sFE, gereinigt durch die Affinitätssäule der Lysin-Agarose-Matrix. #1, 100 U Urokinase; #2, physiologischer Kochsalzpuffer; #3, Rohprotein (Probe aus Protokollschritt 1.3.1); #4, gereinigte sFE (Elutionspeakprobe, Peak 2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Reinheitsanalyse. Die Reinheit von gereinigtem sFE wurde mittels SDS-PAGE analysiert. (A) Die Reinheit von sFE, gereinigt durch die Arginin-Agarose-Matrix-Affinitätssäule. M: Protein-Marker; Spur 1: Rohprotein (Probe aus Protokollschritt 1.3.1); Spur 2: gereinigte sFE (Elutionspeakprobe, Peak 2). (B) Die Reinheit von sFE, gereinigt durch die Lysin-Agarose-Matrix-Affinitätssäule. M: Protein-Marker; Spur 1: Rohprotein (Probe aus Protokollschritt 1.3.1); Spur 2: gereinigte sFE (Elutionspeakprobe, Peak 2). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzungsdatei 1: 8ZHP: Kristallstruktur von snFPITE-n1. Ein PDB-Röntgen-Strukturvalidierungsbericht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsdatei 2: 8ZHO: Kristallstruktur von snFPITE-n2. Ein PDB-Röntgen-Strukturvalidierungsbericht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.