Methodenartikel

Screening der Empfindlichkeit von Sphäroiden in Gliom-Stammzelllinien

1.2K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/65655

⸱

2. Februar 2024

 ,  ,  ,  , 
1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 3School of Medicine, University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In-vitro-Sensitivitätsscreenings sind wichtige Instrumente zur Entdeckung von Kombinationen von Krebsmedikamenten. Zellen, die in Kugeln gezüchtet werden, aktivieren unterschiedliche Signalwege und gelten als repräsentativer für in vivo-Modelle als Monolayer-Zelllinien. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum in vitro Wirkstoffscreening auf Sphäroidlinien.

Zusammenfassung

In-vitro-Sensitivitätsscreenings sind wichtige Instrumente bei der Entdeckung von Kombinationstherapien gegen Krebsmedikamente. In der Regel werden diese In-vitro-Wirkstoffscreenings an Zellen durchgeführt, die in einer Monoschicht gezüchtet wurden. Diese zweidimensionalen (2D) Modelle gelten jedoch im Vergleich zu dreidimensionalen (3D) Sphäroidzellmodellen als weniger genau. Dies gilt insbesondere für Gliom-Stammzelllinien. Zellen, die in Kugeln gezüchtet werden, aktivieren unterschiedliche Signalwege und gelten als repräsentativer für in vivo-Modelle als Monolayer-Zelllinien. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für das In-vitro-Wirkstoffscreening von Sphäroidlinien; Als Beispiel dienen Stammzelllinien von Maus und humanen Gliomen. Dieses Protokoll beschreibt einen 3D-Sphäroid-Sensitivitäts- und Synergie-Assay, mit dem bestimmt werden kann, ob ein Medikament oder eine Wirkstoffkombination den Zelltod induziert und ob zwei Medikamente synergistisch wirken. Gliom-Stammzelllinien werden so modifiziert, dass sie RFP exprimieren. Die Zellen werden in geringer Bindung um die Platten mit dem Boden von 96 plattiert, und die Kugeln werden über Nacht gebildet. Medikamente werden hinzugefügt, und das Wachstum wird überwacht, indem das RFP-Signal im Laufe der Zeit mit dem Incucyte Live Imaging System gemessen wird, einem Fluoreszenzmikroskop, das in den Gewebekultur-Inkubator eingebettet ist. Anschließend werden die Hälfte der maximalen Hemmkonzentration (IC50), der medianen letalen Dosis (LD50) und des Synergie-Scores berechnet, um die Empfindlichkeit gegenüber Arzneimitteln allein oder in Kombination zu bewerten. Die dreidimensionale Natur dieses Assays ermöglicht eine genauere Reflexion des Tumorwachstums, des Verhaltens und der Arzneimittelempfindlichkeit in vivo und bildet somit die Grundlage für weitere präklinische Untersuchungen.

Einleitung

Das Glioblastom ist eine verheerende, hochgradige Neubildung des Gehirns mit einer Gesamtüberlebensrate von 5 % über fünf Jahre1. Hochgradige Gliome (HGG) wie das Glioblastom stellen die häufigste Ursache für krebsbedingte Mortalität in der pädiatrischen Bevölkerungdar 2 und sind auch bei Erwachsenen eine der hartnäckigsten Tumoren, die behandelt werdenmüssen 3. Trotz erheblicher Fortschritte in unserem Verständnis der molekularen Treiber von HGG sind die Behandlungsmöglichkeiten nach wie vor begrenzt3, was den Bedarf an Wirkstoff-Screening-Methoden unterstreicht, die die therapeutische Sensitivität in der Klinik genauer vorhersagen.

3D-Zellkulturen werden bisher vor allem für die Modellierung physiologisch relevanten Zellverhaltens eingesetzt4. Darüber hinaus kann die 3D-Architektur der Tumormikroumgebung in vitro durch die Etablierung von 3D-Wachstumsassays rekapituliert werden5. Das Sphäroidwachstum aktiviert auch verschiedene Signalwege und gilt daher als repräsentativer für in vivo-Modelle 6,7 im Vergleich zur 2D-Kultur. Pädiatrische HGG-Stammzellen und unsere Maus-NF1-Gliom-Stammzelllinien wachsen auf natürliche Weise als Neurosphären und verwendeten diese Maus-NF1-Gliom-Zelllinien in einem Wirkstoffscreening mit mittlerem Durchsatz8. Die hier verwendeten pädiatrischen Linien stammen aus hemisphärischem, mittellinienförmigem und zerebellärem pädiatrischem HGG und wurden aus dem Children's Brain Tumor Network gewonnen und vollständig charakterisiert (Mutations- und Genexpressionsprofile)9. Diese Linien wurden so modifiziert, dass sie ein nukleäres rot fluoreszierendes Protein (RFP) exprimieren, das die Überwachung der Proliferation und des Überlebens mit dem Incucyte-Live-Imaging-System ermöglicht. Die Intensität des RFP-Signals ist repräsentativ für die Anzahl der vorhandenen Zellen. Andere Fluorophore, wie das grün fluoreszierende Protein (GFP), könnten ebenfalls verwendet werden.

Die Kombinationschemotherapie bei akuter lymphatischer Leukämie im Kindesalter, Lymphomen, epithelialen Malignomen und vielen anderen Krebsarten ist ein wirksames Mittel, um Tumore auszurotten und eine Arzneimittelresistenz gegen einzelne Wirkstoffe zu verhindern10,11. Es gibt jedoch nur begrenzte Informationen darüber, welche Wirkstoffe kombiniert werden müssen, um therapeutische Sensitivitäten bei HGG zu erreichen, was die Verwendung genauerer Sphäroidmodelle in In-vitro-Arzneimitteltests fördert.

Protokoll

Alle protokollarischen Verfahren wurden vom Institutional Review Board (IRB) des Kinderkrankenhauses von Philadelphia genehmigt.

1. 3D Sphäroid-Zellplattierung

  1. Präparat des Gliom-Stammzellmediums: Um das Basismedium herzustellen, fügen Sie dem Basalmedium (500 ml) 50 ml des Proliferationspräparats und 5 ml einer 100-fachen Penicillin-Streptomycin-Lösung (10.000 U/ml) hinzu. Zur Herstellung von Gliom-Stammzellmedien fügen Sie den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) in einer Endkonzentration von 20 ng/ml bzw. 10 ng/ml hinzu, wie in der Herstellerbeschreibung angegeben.
    HINWEIS: Gliom-Stammzellmedien können bei Lagerung bei 4 °C 1 Woche lang verwendet werden.
  2. Dissoziieren Sie RFP-exprimierende Zellen:
    HINWEIS: In diesem Beispiel wird die Maus NF1 HGG-Stammzelllinie 5746 verwendet.
    1. Übertragen Sie die Gliomkugeln in ein konisches 15-ml-Röhrchen und schleudern Sie die Gliomkugeln in einer Zentrifuge (150 x g für 5 Minuten). Den Überstand entfernen und 300 μl Accutase zugeben, um die Kugeln zu dissoziieren (5 min bei 37 °C inkubieren).
    2. Fügen Sie 1 ml Gliom-Stammzellmedium hinzu und zerkleinern Sie die Kugeln durch sanftes Pipettieren. Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen 5 Minuten lang bei 150 x g, aspirieren Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in 1 ml Gliom-Stammzellmedium auf.
  3. Messen Sie die Konzentration der Zellen mit einem Zellzähler oder Hämozytometer. Wenn Sie einen Fluoreszenzzellzähler verwenden, fügen Sie 18 μl der Zellsuspension zu 2 μl Acridinorange/Propidiumiodid-Färbung hinzu. Laden Sie 12 μl dieser Suspension in ein Hämozytometer, um die Anzahl der in der Suspension vorhandenen lebenden/toten Zellen zu zählen.
  4. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von 2.000 Zellen pro 100 μl Gliom-Stammzellmedium.
    HINWEIS: Änderungen an der Zellkonzentration können von der Zelllinie abhängen und entsprechend angepasst werden.
  5. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl der Zellsuspension (2.000 Zellen pro 100 μl) in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit rundem Boden und niedrigem Aufsatz durch umgekehrtes Pipettieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie niedrige Befestigungsplatten mit rundem Boden; Diese Platten stimulieren die Bildung einer einzelnen Gliomkugel in jeder Vertiefung. Durch das Rückwärtspipettieren wird die Bildung von Blasen vermieden, die die Bilderfassung des Lebendzellanalysesystems beeinträchtigen.
  6. Die Platten bei 150 x g 5 min zentrifugieren.
    HINWEIS: Die Zentrifugation ist ein kritischer Schritt, um die Bildung von 3D-Neurosphären zu initiieren.
  7. Über Nacht inkubieren, damit sich in jeder Vertiefung eine einzelne Kugel bilden kann.

2. Hinzufügen von Medikamenten für den Synergie-Assay (Abbildung 1)

  1. Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung der 96-Well-Platte eine bestimmte Konzentration der Arzneimittel 1 und 2 erhält. Erstellen Sie ein Raster, in dem jede Konzentration von Wirkstoff 1 mit jeder Konzentration von Wirkstoff 2 in doppelter Kombination kombiniert wird.
  2. Führen Sie eine serielle Verdünnung der beiden Arzneimittel durch, für die die Synergie bestimmt wird (5 Verdünnungen von Arzneimittel 1 und 7 Verdünnungen von Arzneimittel 2) unter Verwendung des Gliom-Stammzellmediums (Abbildung 1A).
    HINWEIS: In dieser Studie wird eine serielle Verdünnungsreihe von 50 % verwendet; Es können jedoch beliebige Verdünnungsreihen verwendet werden.
    1. Die Verdünnungsreihe sollte 7x konzentrierter sein als die gewünschte Endkonzentration in jeder Vertiefung. Wenn z. B. die höchste Endkonzentration für Arzneimittel 1 1 μM beträgt, wird die erste Konzentration der Verdünnungsreihe für Arzneimittel 1, 7 μM (1 ml, Röhrchen B oder I in Abbildung 1A) hergestellt.
    2. Geben Sie 500 μl Gliom-Stammzellmedium in jedes weitere Röhrchen der Verdünnungsreihe (Röhrchen C-H und J-M, wie in Abbildung 1 gezeigt).
    3. Um die Verdünnungsreihe zu erzeugen, aspirieren Sie 500 μl des Wirkstoffgemisches aus Röhrchen B oder Röhrchen I und geben Sie es in das nächste Röhrchen der Verdünnungsreihe Röhrchen C bzw. Röhrchen J (das 500 μl Gliom-Stammzellmedium enthält). Gut mischen und bis zum nächsten Röhrchen in der Verdünnungsreihe wiederholen. Führen Sie eine DMSO-Kontrolle (Röhre A) durch und stellen Sie sicher, dass die DMSO-Konzentration unter allen Bedingungen gleich ist.
      HINWEIS: Änderungen an den Arzneimittelkonzentrationen und Verdünnungsreihen können vorgenommen werden. Stellen Sie sicher, dass die korrekten Arzneimittelkonzentrationen in der Zusatzdatei 1 aufgeführt sind, wenn die Verdünnungsreihe geändert wird.
  3. In jede Vertiefung der 96-Well-Platten werden 20 μl Wirkstoff 1 und 20 μl Wirkstoff 2 durch Rückwärtspipettieren gegeben, wie in Abbildung 1B gezeigt, für ein Endvolumen von 140 μl pro Vertiefung; Medikamentenkombinationen werden doppelt bewertet. Wenn Sie die mitgelieferte Downstream-Analyse für IC50 und LD50 verwenden, verwenden Sie das Wirkstofflayout wie in Abbildung 1B gezeigt.
    1. Bei diesem Assay wird auch die Wirkung jedes Medikaments für sich (ohne dass das andere Medikament vorhanden ist) gemessen. Stellen Sie sicher, dass Sie 20 μl DMSO-Kontrollmedium (Röhrchen A in Abbildung 1B) in diese einzelnen Wirkstoffvertiefungen geben, um das endgültige Volumen jeder Vertiefung auf 140 μl zu bringen.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen keine Blasen enthalten, da dies die Bildgebung beeinträchtigt.
      HINWEIS: Änderungen am endgültigen Volumen können vorgenommen werden. Es ist jedoch darauf zu achten, dass die Konzentrationen in Nummer 2.2 angepasst werden.
  4. Platzieren Sie die Platten in den Live-Imager und überwachen Sie das Wachstum jeder Kugel in jeder Vertiefung mit dem Sphäroidmodul, Einzelkugeleinstellung, wobei sowohl Hellfeld als auch RFP bei 4-facher Vergrößerung abgebildet werden.
  5. Überwachen Sie die Platten 72 Stunden lang, wobei Sie jede Vertiefung der Platte in einem regelmäßigen Zeitintervall abbilden, in der Regel 2 Stunden.
    HINWEIS: Laden Sie eine korrekte Plattenkarte hoch; Dies gewährleistet eine ordnungsgemäße nachgelagerte Analyse (Abbildung 1C).

3. Berechnung von IC50, LD50 und Synergie-Score (Abbildung 2 und Abbildung 3)

  1. Analysieren Sie die RFP-Intensität für jedes Well und jeden Zeitpunkt mit der Live-Imager-Software. Die verwendeten Analyseparameter sind in den Zusatzdateien (Zusatzdatei 2) aufgeführt.
    HINWEIS: Es können je nach Wunsch unterschiedliche Analyseparameter verwendet werden.
  2. Exportieren Sie die RFP-Daten als Total Red Integrated RFP Intensity für jedes Bohrloch und stellen Sie sicher, dass die nicht gruppierten Rohdaten exportiert werden (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Bei Verwendung der mitgelieferten Vorlage (Ergänzungsdatei 1) zur Berechnung von IC50 und LD50 ist unbedingt Punkt 3.2 einzuhalten
  3. Bestimmen Sie den Durchschnitt und die Standardabweichung für jede Wirkstoffkombination aus (1) der Faltenänderung im Vergleich zu DMSO (für diese Berechnung werden die 0-h-Werte nicht benötigt) und (2) dem Log2 der Faltenänderung im Vergleich zu 0 h, indem Sie die Rohdaten in die bereitgestellte Excel-Tabelle einfügen (Abbildung 2B und siehe Beispiel in der Ergänzungsdatei 1).
  4. Passen Sie die maximale Konzentration der Arzneimittel 1 und 2 in der Tabelle an (Abbildung 2B).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie die Konzentrationen der Arzneimittel 1 und 2 anpassen. Andernfalls werden falsche LD50- und IC50-Werte berechnet.
  5. Berechnen Sie IC50-Werte mit einer geeigneten Datenanalyse-Software (hier kommt GraphPad zum Einsatz). Verwenden Sie für die Berechnung des IC50-Wertes die durchschnittliche Faltungsänderung und die Standardabweichungsänderung der Faltung im Vergleich zu DMSO, die nur in Schritt 3.4 ermittelt wurden, und kopieren Sie die IC50-Tabellen der Medikamente 1 und 2 in die Datenanalysesoftware (Log(inhibitor) vs. normalisierte Reaktion, variable Steigung) (Abbildung 3A).
    1. Verwenden Sie für die IC50-Berechnungen nur Daten aus Bohrlöchern, zu denen eine einzelne Komponente hinzugefügt wurde. Verwenden Sie die Protokollwerte für die Arzneimittelkonzentration in der Datenanalysesoftware, die automatisch in der bereitgestellten Tabelle berechnet werden.
  6. Synergie-Score berechnen:
    1. Verwenden Sie nur die durchschnittliche Fold-Änderung im Vergleich zu DMSO jeder Kombination, um den Synergie-Score mithilfe eines Softwarepakets oder einer Website zu berechnen. Zum Beispiel https://synergyfinder.fimm.fi/ 12 (Parameter: LL4-Kurvenanpassung, ZIP-Methode zur Berechnung des Synergie-Scores). Ergänzende Datei 1 berechnet automatisch die Werte, die zum Erstellen der Synergie-Eingabetabelle erforderlich sind, die in SynergyFinder hochgeladen werden kann (Abbildung 3B). Ein Beispiel für die Eingabetabelle für Synergien finden Sie in der Zusatzdatei 3.
      HINWEIS: Eine Punktzahl über 10 bedeutet Synergie, eine unter -10 bedeutet Antagonismus und ein Wert zwischen -10 und 10 zeigt additive Effekte.
  7. Berechnen Sie den LD50-Score:
    1. Berechnen Sie für jede Konzentration von Arzneimittel 1 die LD50 von Arzneimittel 2. Die Zusatzdatei berechnet automatisch den Log2-Wert und die Standardabweichung für jede Konzentration (Abbildung 3C).
    2. Geben Sie den Durchschnitt und die Standardabweichung der Log2-Faltungsänderung im Vergleich zu 0 h sowie die Anzahl der Wiederholungen in der Datenanalysesoftware ein (in dieser Studie 2,) und berechnen Sie den LD50-Wert und die LD50-Standardabweichung, indem Sie die Konzentration bei -1 bestimmen (Log2 = -1 steht für den log2-Wert, bei dem 50% des Signals im Vergleich zu 0 h verloren gehen). Verwenden Sie in diesen Berechnungen das Modell Log(inhibitor) vs. response, variable slope 4 parameters.
      HINWEIS: Die Datenanalysesoftware berechnet nicht automatisch die Arzneimittelkonzentration, die einem log2 = -1-Wert entspricht; Dieser Wert kann jedoch als benutzerdefinierte Gleichung zu den gemeldeten Berechnungen der Datenanalysesoftware addiert werden (Abbildung 3C). Stellen Sie sicher, dass Sie die Log-Konzentrationswerte in der Datenanalysesoftware verwenden, die automatisch in der bereitgestellten Tabelle berechnet werden. Die ergänzende Datei 4 zeigt die Panels IC50 und LD50 in der GraphPad-Software.

Ergebnisse

Als Beispiel wurde die Synergie von Trametinib (MEK-Inhibitor) und GDC-0941 (PI3K-Inhibitor) untersucht, die zwei RAS-Downstream-Effektorwege in der Maus-Gliom-Stammzelllinie 5746 (RFP-exprimierend) hemmen (Abbildung 4). Abbildung 4A zeigt die gleiche Kugel bei 0 h und 72 h, behandelt mit einer Kombination aus Trametinib und GDC-0941. Diese Bilder wurden direkt aus der Live-Imager-Software exportiert. IC50 und LD50 wurden wie in GraphPad beschrieben berechnet (Abbildung 4B,D), die Synergie wurde mit SynergyFinder berechnet (Abbildung 4C). Abbildung 4B zeigt die Ausgabe für die IC50-Berechnungen; Für beide Arzneimittel werden LogIC50-, Hillslope- und IC50-Werte sowie das 95 %-Konfidenzintervall und die Güte der Anpassung angezeigt. Abbildung 4C zeigt die Dosis-Wirkungs-Kurve für jedes Medikament allein (Wirkstoffkonzentration versus prozentuale Hemmung), eine farbcodierte Matrix, die die prozentuale Hemmung des Wachstums für jede Wirkstoffkombination zeigt, und ein 3D-Diagramm des Synergie-Scores zwischen beiden Medikamenten, in diesem Fall beträgt der Synergie-Score 22,356. Abbildung 4D zeigt die Ausgabe für die LD50-Werte der Medikamente allein oder in Kombination. Von Bedeutung sind die LogLD50- und LD50-Werte und deren jeweilige 95%-Konfidenzintervalle. Wie erwartet sind die LD50-Werte für Trametinib bei niedrigeren GDC-0941-Konzentrationen niedriger. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass LD50 ein Zelltodmarker ist und einen Zelltod von 50 % im Vergleich zum Ausgangspunkt des Assays bedeutet.

figure-results-1
Abbildung 1: Aufbau einer 96-Well-Platte mit 2-Wirkstoff-Synergie. (A) Schematische Darstellung der 1/2-Verdünnungsreihe der Arzneimittel 1 und 2. Die Wirkstoffkonzentrationen müssen 7x höher sein als die Endkonzentration in jeder Vertiefung. (B) Bild des 0-h-Punktes einer 96-Well-Platte mit 5746 RFP-Kugeln. Die Verdünnungsreihe des Arzneimittels 1 wird zu jeder Reihe hinzugefügt, wie für insgesamt 7 Verdünnungen und eine DMSO-Kontrolle angegeben. Die Verdünnungsreihe von Wirkstoff 2 wird jedes Mal zu 2 Säulen addiert, wie für insgesamt 5 Verdünnungen und eine DMSO-Kontrolle angegeben. (C) Beispiel für die Tafelkarte, die in der Live-Imager-Software hochgeladen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-2
Abbildung 2: Exportieren der erfassten Daten. (A) Nach 72 Stunden Messungen wird die gesamte integrierte Intensität des roten Objekts für jedes Well und jeden Zeitpunkt exportiert. Die Gruppierung ist auf Keine festgelegt. Wählen Sie für die Exportoptionen (rechts) die Option Nach Replikaten organisieren und Ziel in Zwischenablage aus. (B) Fügen Sie die exportierten Daten in die angegebene Zelle der Tabelle ein (Zusatzdatei 1). Aktualisieren Sie die höchste Konzentration für jedes Medikament wie angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-3
Abbildung 3: Verarbeitung der erfassten Daten. (A) IC50-Eingabetabellen, die zur Analyse in die Datenanalyse-Software kopiert werden können (Ergänzungsdatei 4, IC50-Panel). Diese Tabellen werden automatisch in der Zusatzdatei 1 generiert. (B) Eine Synergie-Eingabetabelle für das SynergyFinder-Programm kann erstellt werden, indem die Viabilitätstabelle in die Zusatzdatei 3 kopiert wird. Diese Datei wird auf https://synergyfinder.fimm.fi/ mit der angegebenen Auswahl hochgeladen. Der Synergie-Score und die Matrix werden automatisch berechnet. (C) LD50-Eingabetabellen, die zur Analyse in die Datenanalysesoftware (Ergänzungsdatei 4, LD50-Panel) kopiert werden können. Diese Tabellen werden automatisch in der Zusatzdatei 1 generiert. Die untere Seite zeigt, wie der LD50 zu den in der Datenanalysesoftware gemeldeten Werten addiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

figure-results-4
Abbildung 4: Beispiel für die Ergebnisse einer Synergiestudie von Trametinib und GDC-0941 in 5746 Gliom-Stammzellkugeln. (A) Bild einer 5746 RFP-Kugel, die mit 10 nM Trametinib und 1000 nM GDC-0941 behandelt wurde, 0 h und 72 h nach der Behandlung. (B) Ausgabe der IC50-Berechnungen, die den IC50-Wert und die Standardabweichung des IC50 anzeigen. (C) Ausgabe des SynergyFinder-Programms. Links: Inhibitionskurven, Mitte: Tabelle der prozentualen Inhibition, rechts: Synergiekarte, die zeigt, dass Trametinib und GDC-0941 einen Synergiewert von 22,3 haben. (D) Ausgabe der LD50-Berechnungen mit LD50-Werten und der auf dem LD50 berechneten Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Parameter, die zur Analyse des RFP-Signals im Incucyten verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Tabelle, in der die generierten Daten verarbeitet und Eingabetabellen für GraphPad und SynergyFinder erstellt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: Tabelle der SynergyFinder-Eingabetabelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: GraphPad-Datei zur Berechnung von IC50- und LD50-Werten Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die 3D-Wirkstoffscreening-Assays, die effektiv zur Bewertung von Arzneimittelanfälligkeiten in Sphäroidmodellen von Gliomen8 eingesetzt wurden. Dieses 3D-Sphäroid-Assay-System wurde speziell entwickelt, um eine genauere präklinische Untersuchung von kombinatorischen Chemotherapien für Gliomzelllinien zu ermöglichen, die in Kugeln gezüchtet wurden. Für HGG bietet diese Methode einen Rahmen für die Identifizierung potenzieller Anfälligkeiten für Medikamente für diese verheerende Krankheit. Die potenziellen Anwendungen dieses Systems sind jedoch nicht auf Gliome beschränkt, und dieses Protokoll kann verwendet werden, um neuartige Therapeutika in 3D-Modellen verschiedener anderer Erkrankungen zu bewerten.

Ziel dieser Studie ist es, die Vorhersagbarkeit von In-vitro-Wirkstoffscreenings zu verbessern, um diejenigen Wirkstoffkombinationen zu priorisieren, die in präklinischen Studien und schließlich in der Klinik die höchste Erfolgswahrscheinlichkeit haben. Insbesondere bei Gliomen ist die Identifizierung wirksamer Wirkstoffkombinationen mithilfe von In-vitro-Wirkstoffscreenings, die sich gut auf die Klinik übertragen lassen, bisher begrenzt. Dies ist zum Teil auf die Verwendung weniger idealer serumgezüchteter Gliomzelllinien13, die Verwendung von 2D-Monolayer-Assays4 und die Fokussierung auf IC50 (50 % reduziertes Wachstum) anstelle von LD50 (50 % weniger Zellen im Vergleich zum Beginn des Assays)14 zurückzuführen. In-vitro-Sphäroidwachstumsassays von Gliom-Stammzellen werden verwendet, um Wirkstoffkombinationen zu priorisieren, die in unseren präklinischen Modellen bewertet werden sollen. Bei unserer Priorisierung von Wirkstoffkombinationen werden einige Maßnahmen berücksichtigt: 1) Niedrige LD50-Werte, ein Fokus auf den Zelltod statt auf eine reduzierte Proliferation erhöhen den potenziellen Erfolg; 2) Im Idealfall liegen diese LD50-Werte unter dem Cmax-Wert, der maximalen Serumkonzentration, die bei pharmakokinetischen Arzneimittelstudien für klinische Studien sicher erreicht werden kann, sofern verfügbar; 3) Ein hoher Synergiewert, wenn beide Medikamente synergistisch wirken, deutet dies auf eine mechanistische Zusammenarbeit zwischen beiden Medikamenten hin. Obwohl dieser letzte Punkt nicht erforderlich ist, um wirksame Arzneimittelkombinationen zu identifizieren, kann die Synergie die Wirksamkeit des Arzneimittels verbessern, ohne die Arzneimitteltoxizität zu erhöhen.

Wichtig ist, dass die In-vitro-Bewertung von Arzneimittelempfindlichkeiten nach wie vor ein wichtiges Instrument ist, um neuartige Therapien oder Medikamentenkombinationen zu entdecken, die Tumore schrumpfen lassen können. Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht es uns, die Empfindlichkeit und Synergie von Medikamenten mit einem 3D-Sphäroidwachstums-Assay-System zu bestimmen, das zur Priorisierung von Wirkstoffkombinationen für die Bewertung in präklinischen Modellen verwendet werden kann.

Das Protokoll umfasst mehrere kritische Schritte. Wir messen das Wachstum einzelner Kolonien in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte. Die Verwendung von runden Bottom-Well-Platten mit geringer Bindung ist entscheidend, um sicherzustellen, dass sich die Zellen nicht an die Vertiefung anheften und die Kugelbildung stimuliert wird. Die Vertiefung mit rundem Boden sorgt dafür, dass sich die einzelne Kugel immer an der gleichen Stelle der 96-Well-Platte befindet.

Nach dem Plattieren der Zellen müssen die Platten zentrifugiert werden, um sicherzustellen, dass alle plattierten Zellen am tiefsten Punkt der Vertiefung mit rundem Boden zusammenkommen und eine einzige 3D-Kugel gebildet wird. Das Gesamtvolumen jeder Vertiefung muss 140 μl betragen. Dadurch werden die korrekten Endkonzentrationen der jeweiligen Arzneimittel in jeder Vertiefung sichergestellt.

Verwenden Sie beim Pipettieren in die 96-Well-Platte die umgekehrte Pipettiertechnik, dies verringert das Risiko, Luftblasen in den Wells zu erzeugen. Luftblasen hindern den Live-Imager daran, jedes Well korrekt abzubilden, und die Intensität der Fluoreszenz ist falsch, was sich auf die nachgelagerte Analyse der Ergebnisse auswirkt.

Das bereitgestellte Plattenlayout und die Tabellenkalkulationen sind spezifisch für das beschriebene Protokoll. Weicht man von der Beschichtung ab, werden falsche IC50- und LD50-Werte berechnet. Die Tabelle berechnet automatisch die Verdünnungen, wenn die höchste Konzentration bereitgestellt wird. Aktualisieren Sie für jedes Experiment die höchste Konzentration, da sonst falsche IC50- und LD50-Werte berechnet werden.

Graphpad verwendet logarithmische Konzentrationen, um IC50- und LD50-Werte zu berechnen. Diese logarithmischen Konzentrationen werden automatisch in der bereitgestellten Tabelle berechnet und können direkt in die Software kopiert werden. Die Nichtverwendung logarithmischer Konzentrationen führt zu falschen IC50- und LD50-Werten.

Wir verwenden Zelllinien, die von Natur aus als Kugeln wachsen. Mit diesem Protokoll kann man adhärente Zellen in eine Kugel zwingen; Es ist jedoch nicht garantiert, dass sie sich vermehren können. Die Anzahl der Zellen, die in jeder Vertiefung plattiert werden, kann von der Zelllinie abhängen und hängt von den einzigartigen Wachstumseigenschaften der einzelnen Zelllinien ab, die leicht angepasst werden können. Die vorgeschlagenen Verdünnungskurven sind nur Vorschläge. Änderungen an Arzneimittelkonzentrationen und Verdünnungsreihen können vorgenommen werden. Es ist jedoch wichtig, die korrekten Wirkstoffkonzentrationen in der Zusatzdatei 1 aufzuführen, wenn die Verdünnungsreihe geändert wird; Andernfalls sind die berechneten IC50- und LD50-Werte falsch. Man kann sich für ein anderes Plattenlayout entscheiden; Verwenden Sie z. B. nur ein Replikat anstelle von zwei. Zu diesem Zweck muss der Benutzer die Tabelle aktualisieren, um diese Änderung widerzuspiegeln.

Nach dem Plattieren bilden sich in seltenen Fällen mehrere 3D-Kugeln in einer einzigen Vertiefung. In einem solchen Fall führt die Wiederholung des Zentrifugationsschritts (150 x g) dazu, dass diese Kugeln zu einer einzigen Kugel verschmelzen. Wenn ein Beschichtungsfehler auftritt, der zu einem anderen Plattenlayout führt, kann die bereitgestellte Tabelle geändert werden, um die neue Plattenkarte widerzuspiegeln. Wenn ein Datenpunkt ein Ausreißer ist und aus der Analyse entfernt werden muss, kann die bereitgestellte Tabelle aktualisiert werden.

Die Haupteinschränkung dieses Systems besteht darin, dass es Zelllinien verwendet, die auf natürliche Weise als Kugeln gezüchtet wurden, und keine adhärenten Linien, die in Monolayern gezüchtet wurden. Wenn Zelllinien keine Kugeln bilden können, sollten herkömmliche 2D-Proliferationsassays verwendet werden. Der Vorteil der Verwendung von 3D-Organoid-ähnlichen Wachstumsassays wie diesem im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Monoschichten besteht darin, dass die Architektur und die aktivierten Signalwege die in In-vivo-Modellen menschlicher Krankheiten beobachteten genauer widerspiegeln, was das translationale Potenzial und die Anwendbarkeit dieser Methoden unterstreicht.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15-ml-ZentrifugationsröhrchenCELLTREAT22941115-ml-Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen, sterile
96-Well-PlatteS-bioMS9096UZ96-Well-Platte mit rundem Boden und ultraniedriger Bindung
AccutaseSTEMCELL Technologies7922Lösung zur Zellablösung
Acridin Orange/Propidiumiodid StainLogos BiosystemsF23001Lebend/tot Farbstoff für die Zellzählung
bFGFSTEMCELL Technologies78003.2Humaner rekombinanter bFGF-Zellzähler
Logos BiosystemsL20001LUNA-FL Dual-Fluoreszenz-Zellzählerzentrifuge
Eppendorf5810RZentrifuge Zellen und Platten zentrifugieren
DMSOPierce20688Lösungsmittel für Verbindungen
EGFSTEMCELL Technologien78006.2Humane rekombinante
EGF-Eppendorf-RöhrchenCostar07-200-534Mikrozentrifugenröhrchen
Excel MicrosoftMicrosoft Excel
GDC-0941SelleckchemS1065Medikament 1
GraphPadGraphPad GraphPad Prism 9Berechnung von IC50- und LD50-Hämozytometer-Logos
BiosystemsLGBD10008Luna PhotonSlide
IncucyteSartoriusS3Fluoreszenzmikroskop, das in den Gewebekultur-Inkubator eingebettet ist und jede Vertiefung in bestimmten Zeitintervallen abbildet.
Inzozyten-SoftwareSartoriusIncucyte 2022BAnalyse von Proliferationsdaten
MedienSTEMCELL Technologies5702NeuroCult (Maus und Ratte) Proliferationskit mit Basalmedium und Wachstumsergänzung
Penicillin-Streptomycin Gibco15140122Antibiotika zur Zugabe zu Medien
TrametinibSelleckchemS2673Wirkstoff 2

Referenzen

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2013-2017. Neuro-Oncology. 22 (22 Suppl 2), v1-v95 (2020).
  2. Jones, C., et al. Paediatric and adult malignant glioma: close relatives or distant cousins. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (7), 400-413 (2012).
  3. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacological Research. 171, 105780(2021).
  4. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Molecular Oncology. 1 (1), 84-96 (2007).
  5. Lv, D., et al. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  6. Ghosh, S., et al. Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: a high density oligonucleotide array study. Journal of Cellular Physiology. 204 (2), 522-531 (2005).
  7. Kim, H., et al. Changes in global gene expression associated with 3D structure of tumors: an ex vivo matrix-free mesothelioma spheroid model. PLoS One. 7 (6), e39556(2012).
  8. Dougherty, J., et al. Identification of therapeutic sensitivities in a spheroid drug combination screen of Neurofibromatosis Type I associated high grade gliomas. Plos One. 18 (2), e0277305(2023).
  9. Ijaz, H., et al. Pediatric high-grade glioma resources from the Children's Brain Tumor Tissue Consortium. Neuro Oncology. 22 (1), 163-165 (2020).
  10. Chabner, B. A., Roberts, T. G. Jr Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nature Reviews. Cancer. 5 (1), 65-72 (2005).
  11. Al-Lazikani, B., et al. Combinatorial drug therapy for cancer in the post-genomic era. Nature Biotechnology. 30 (7), 679-692 (2012).
  12. Ianevski, A., et al. SynergyFinder 3.0: an interactive analysis and consensus interpretation of multi-drug synergies across multiple samples. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W739-W743 (2022).
  13. Ledur, P. F., et al. Culture conditions defining glioblastoma cells behavior: What is the impact for novel discoveries. Oncotarget. 8 (40), 69185-69197 (2017).
  14. Sazonova, E. V., et al. Drug toxicity assessment: cell proliferation versus cell death. Cell Death Discovery. 8 (1), 417(2022).

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Wirkstoff Screening an Sph roidenGliom StammzellenWirkstoff Sensitivit tsassay3D ZellmodelleKombinationstherapieZelltod AssaySynergie ScoreRFP ExpressionLive ImagingIC50 Berechnung

Dieser Artikel wurde veröffentlicht

Video demnächst verfügbar

Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.