Method Article

Hochdurchsatz-Optogenetik-Experimente in Hefe mit der automatisierten Plattform Lustro

DOI:

10.3791/65686

⸱

August 4th, 2023

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2University of Wisconsin Carbone Cancer Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Verwendung der automatisierten Plattform Lustro zur Durchführung einer Hochdurchsatz-Charakterisierung optogenetischer Systeme in Hefe.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Optogenetik bietet eine präzise Kontrolle des zellulären Verhaltens durch die Verwendung genetisch kodierter lichtempfindlicher Proteine. Die Optimierung dieser Systeme, um die gewünschte Funktionalität zu erreichen, erfordert jedoch oft mehrere Design-Build-Test-Zyklen, die zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein können. Um dieser Herausforderung zu begegnen, haben wir Lustro entwickelt, eine Plattform, die Lichtstimulation mit Laborautomatisierung kombiniert und so ein effizientes Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung optogenetischer Systeme ermöglicht.

Lustro verfügt über einen Automationsarbeitsplatz, der mit einer Beleuchtungsvorrichtung, einer Schüttelvorrichtung und einem Plattenleser ausgestattet ist. Durch den Einsatz eines Roboterarms automatisiert Lustro die Bewegung einer Mikrotiterplatte zwischen diesen Geräten und ermöglicht so die Stimulation optogenetischer Stämme und die Messung ihrer Reaktion. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verwendung von Lustro zur Charakterisierung optogenetischer Systeme zur Genexpressionskontrolle in der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae. Das Protokoll umfasst die Einrichtung der Lustro-Komponenten, einschließlich der Integration des Beleuchtungsgeräts in die Automatisierungsstation. Es enthält auch detaillierte Anweisungen für die Programmierung des Beleuchtungsgeräts, des Plattenlesers und des Roboters, um einen reibungslosen Betrieb und eine reibungslose Datenerfassung während des gesamten Versuchsprozesses zu gewährleisten.

Introduction

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Die Optogenetik ist eine leistungsfähige Technik, die lichtempfindliche Proteine nutzt, um das Verhalten von Zellen mit hoher Präzision zu steuern 1,2,3. Das Prototyping optogenetischer Konstrukte und die Identifizierung optimaler Beleuchtungsbedingungen können jedoch zeitaufwändig sein, was die Optimierung optogenetischer Systeme erschwert 4,5. Hochdurchsatzmethoden zum schnellen Screening und zur Charakterisierung der Aktivität optogenetischer Systeme können den Design-Build-Test-Zyklus für das Prototyping von Konst....

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Protocol

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Die in dieser Studie verwendeten Hefestämme sind in der Materialtabelle dokumentiert. Diese Stämme weisen ein robustes Wachstum im Temperaturbereich von 22 °C bis 30 °C auf und können in verschiedenen Standardhefemedien kultiviert werden.

1. Einrichten des Automationsarbeitsplatzes

  1. Statten Sie die automatisierte Workstation mit einem Roboter-Greifarm (RGA, siehe Materialtabelle) aus, der in der Lage ist, Mikrotiterplatten zu bewegen (Abbildung 1).
  2. Installieren Sie einen Mikroplatten-Heizschüttler (siehe Materialtabelle) in d....

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Results

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Abbildung 4A zeigt die Fluoreszenzwerte über die Zeit für einen optogenetischen Stamm, der einen fluoreszierenden Reporter exprimiert, der durch einen lichtinduzierbaren Split-Transkriptionsfaktor gesteuert wird. Die unterschiedlichen Lichtverhältnisse, die im Experiment verwendet werden, spiegeln sich in Schwankungen des Tastverhältnisses wider, das den Prozentsatz der Zeit darstellt, in der das Licht eingeschaltet ist. Es wird beobachtet, dass das Gesamtfluoreszenzniveau proportional zum T.......

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Discussion

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Das hier vorgestellte Lustro-Protokoll automatisiert die Kultivierungs-, Beleuchtungs- und Messprozesse und ermöglicht so das Hochdurchsatz-Screening und die Charakterisierung optogenetischer Systeme6. Dies wird durch die Integration eines Beleuchtungsgeräts, eines Mikroplatten-Readers und eines Schüttelgeräts in einen Automatisierungsarbeitsplatz erreicht. Dieses Protokoll demonstriert insbesondere die Nützlichkeit von Lustro für das Screening verschiedener optogenetischer Konstrukte, die in die .......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde durch das National Institutes of Health Grant R35GM128873 und das National Science Foundation Grant 2045493 (vergeben an M.N.M.) unterstützt. Megan Nicole McClean, Ph.D., ist Trägerin des Career Award am Scientific Interface des Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. wurde durch ein NHGRI-Schulungsstipendium für das Genomic Sciences Training Program 5T32HG002760 unterstützt. Wir danken den fruchtbaren Gesprächen mit den Mitgliedern des McClean-Labors und insbesondere Kieran Sweeney für die Bereitstellung von Kommentaren zum Manuskript.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-Well-Glasbodenplatte mit  #1,5 DeckglasCellvisP96-1.5H-N
BioShake 3000-T Ulme (Heizerschüttler)QINSTRUMENTS
Fluent Automation WorkstationTecan
LITOS (alternatives Beleuchtungsgerät)Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (Beleuchtungsgerät)Bugaj, et al. Nature Protocols. 2019
Roboter-GreifarmTecan
Spark (Plattenleser)Tecan
Synthetic Completemedia SigmaAldrichY1250
Tecan Connect (Benutzerwarn-App)Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' Ura3-Homologie, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3'-Homologie  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' Ura3-Homologie, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' Homologie  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' Ura3-Homologie, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3'-Homologie  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD AgarSigmaAldrichY1500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839(2022).
  2. Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Tre....

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