Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-basierte Schnelldiagnose von Helicobacter pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz

H. pylori ist ein spiralförmiges, hochbewegliches, gramnegatives Bakterium, das hauptsächlich in der Pylorusregion des Magens^{lebt 1}. Es handelt sich um einen weit verbreiteten Krankheitserreger, der fast 50 % der Weltbevölkerung infiziert². Die meisten Menschen mit einer H. pylori-Infektion haben keine klinischen Manifestationen, und die meisten entwickeln nach mehreren Jahren der Infektion verschiedene Krankheiten, darunter chronische Gastritis, Magengeschwüre, Magengeschwüre und Magenkrebs³. In mehreren Studien, die auf verschiedenen Populationen basierten, wurde die Wirksamkeit der Eliminierung von H. pylori zur Vorbeugung von Magenkrebs und Krebsvorstufen nachgewiesen ^4,5. Daher hat die Internationale Agentur für Krebsforschung der Weltgesundheitsorganisation (WHO) die Ausrottung von H. pylori als vorbeugende Maßnahme empfohlen⁶.

Der Einsatz nicht-invasiver Methoden zur Identifizierung einer H. pylori-Infektion ist für die meisten Personen mit asymptomatischer Dyspepsie eine Schlüsselkomponente der Behandlung. Der Harnstoff-Atemtest (UBT), der H. pylori-Stuhlantigentest (SAT) und serologische Tests sind beliebte nichtinvasive Techniken. Unter diesen ist die UBT das am wenigsten einschneidende und genaueste Verfahren, das es gibt. UBT verwendet Urease, die in H. pylori reichlich vorhanden ist, um isotopenmarkierten Harnstoff zu Ammoniak und Kohlendioxid (13C oder 14C) zu hydrolysieren. Im Gegensatz dazu ist der immunchromatographische Assay (ICA)⁷ für die Probenahme bequem, einfach und nicht-invasiv. Die Genauigkeit des Tests wird jedoch von mehreren Faktoren beeinflusst, wie z. B. der Qualität der Stuhlprobe, der Temperatur und dem Intervall zwischen der Probenentnahme und dem Test. Ein weiterer Test, der auf der Immunantwort basiert, ist der H. pylori-Antikörpertest im Serum, der Antikörper im Serum eines Patienten nachweist. Dieser Test eignet sich jedoch nicht für die Analyse nach der Behandlung, da die Antikörper noch lange nach der Beseitigung der Bakterien vorhanden sind⁸. Ein weiterer großer Nachteil ist, dass diese Methoden nur eine H. pylori-Infektion diagnostizieren und keine Arzneimittelresistenztests zur Steuerung einer sensitivitätsbasierten Behandlung ermöglichen.

Für invasive Testmethoden muss das Magenbiopsiegewebe endoskopisch entnommen und anschließend histologisch, mit dem Urease-Schnelltest und der Bakterienkultur behandelt werden. Auch diese Testmethoden sind aufgrund mehrerer Faktoren sehr eingeschränkt. Derzeit sind diese Techniken auf ältere Patienten, Patienten mit hohem Risiko für präkanzeröse oder bösartige Erkrankungen und Patienten beschränkt, bei denen die Erstlinientherapie der gastroösophagealen Refluxkrankheit oder einer H. pylori-Infektion versagt hat⁹. Zweitens erreicht die Erfolgsrate der Bakterienkultur aufgrund der einzigartigen Wachstumseigenschaften von H. pylori nur 50 %¹⁰. Molekulare Nachweismethoden bieten daher neue Hoffnung, um die hohen Anforderungen invasiver Nachweismethoden zu überwinden und eine sensitivitätsbasierte Behandlung zu steuern. Unter den molekularen Nachweismethoden hat sich die quantitative PCR in den letzten Jahren enorm weiterentwickelt. Im Gegensatz zur herkömmlichen PCR erfordert die qPCR keine Gelelektrophorese und quantifiziert DNA/RNA in Proben genau, indem Primer und Sonden in der Annealing-Phase hinzugefügt werden. qPCR-Kits zum Nachweis von H. pylori-Infektionen und Arzneimittelresistenzen sind jetzt im Handel erhältlich. Dennoch hat jede Methode ihre Grenzen; Daher sollten die klinische Diagnose und Behandlung eines Patienten in Verbindung mit seinen Symptomen, Anzeichen, seiner Anamnese, anderen Labortests und dem Ansprechen auf die Behandlung betrachtet werden.

Derzeit ist die primäre Methode zur Behandlung von H. pylori-Infektionen die Einnahme von Antibiotika, aber in letzter Zeit wird es aufgrund der Zunahme von Antibiotikaresistenzen immer schwieriger, diese Infektionen zu behandeln. In der Folge wurde weltweit ein deutlicher Rückgang der Wirksamkeit der Behandlung von H. pylori beobachtet, was die Ausrottung von H. pylori zu einem großen Problem für die öffentliche Gesundheit macht¹¹.

Clarithromycin und Levofloxacin sind die beiden Breitbandantibiotika, die zur Behandlung von Infektionen eingesetzt werden, die durch H. pylori verursacht werden, aber mehrere Studien haben eine weit verbreitete Resistenz gegen diese beiden Medikamente in H. pylori-Isolaten berichtet. A2143G, A2142G und A2142C sind drei der zahlreichen Punktmutationen, die im 2,9 kb 23S rRNA-Gen gefunden wurden und zu einer Clarithromycin-Resistenz führen, indem sie die Bindung des Makrolids verhindern. Gleichzeitig befinden sich die Mutationsorte des Levofloxacin-Resistenzgens hauptsächlich in den sechs Mutationsstellen (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) des gyrA-Gens ¹². Die Entdeckung dieser Resistenzmechanismen, die auf genetischen Mutationen beruhen, hat zu einer allmählichen Verlagerung des Nachweises von H. pylori durch kulturbasierte Studien hin zu molekularen Tests geführt.

Insgesamt besteht ein dringender klinischer Bedarf an einer nicht-invasiven, effektiven und simultanen diagnostischen Methode zum Nachweis von H. pylori-Infektionen und Arzneimittelresistenzen. Wir haben eine kombinierte String-Test- und qPCR-Methode eingesetzt, um die Schwierigkeiten bei der Probenahme zu überwinden und das Ziel des gleichzeitigen Nachweises von H. pylori-Infektionen und Arzneimittelresistenzen mit verschiedenen Primersonden zu erreichen.

Die vorliegende Studie wurde in Übereinstimmung mit ethischen Erwägungen durchgeführt, die von der Ethikkommission des Guangdong Provincial People's Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, China, aufgestellt wurden (Zulassungsnummer: KY-Q-2022-384-02). Patienten im Alter von 18 bis 60 Jahren wurden in diese Studie eingeschlossen. Patienten, die innerhalb von 2 Wochen vor der Testung Antibiotika, antibakterielle chinesische Medikamente, Medikamente wie Protonenpumpenhemmer (PPI) oder H2-Rezeptor-Antagonisten usw. einnahmen, wurden nicht in diese Studie eingeschlossen. Diejenigen Patienten, die in den letzten 3 Monaten eine Behandlung gegen H. pylori erhalten hatten, wurden ebenfalls von dieser Studie ausgeschlossen. Personen mit schweren Herz-, Leber-, Nierenproblemen, schwerer Neuropathie oder psychischen Erkrankungen durften ebenfalls nicht an dieser Studie teilnehmen. Es wurden keine schwangeren Frauen und stillenden Mütter in diese Studie eingeschlossen. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Verbrauchsmaterialien (Reagenzien, Chemikalien, Ausrüstung und Software) sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. String-Test zur Magenflüssigkeitsentnahme

1. Bitten Sie den Patienten, vor der Probenentnahme über Nacht zu fasten.
2. Öffnen Sie am nächsten Tag das Saitentestkit, nehmen Sie die Kapsel und halten Sie die Schlaufe am Ende der Schnur fest.
3. Kleben Sie die Schnur auf die Wange des Patienten und bitten Sie ihn, die Kapsel auf seiner Zunge in der Nähe des hinteren Rachens zu platzieren und mit einem Schluck Wasser zu schlucken.
4. Lassen Sie die Kapsel im Magen des Patienten auflösen, wodurch der Strang in der Kapsel freigelegt wird, um Magenschleim aufzunehmen.
5. Bitten Sie einen geschulten Assistenten, die Schnur 1 Stunde nach dem Schlucken der Kapsel vorsichtig herauszuziehen.
6. Schneiden Sie das untere Ende der in der Magenflüssigkeit getränkten Schnur (40 cm) ab, legen Sie sie in die TSE-Probenkonservierungslösung (Tris/Kochsalzlösung/EDTA) und senden Sie sie dann bei Raumtemperatur (RT) an das klinische Labor zur anschließenden Detektion von H. pylori und zur Bestimmung der Antibiotikaresistenzprofile mittels qPCR.

2. DNA-Extraktion

1. Legen Sie die Probenröhrchen auf ein ordnungsgemäß beschriftetes Reagenzglasgestell und benetzen Sie sie 10 s lang.
2. Drehen Sie die 32-Well-Platte (Nukleinsäureextraktions- oder Aufreinigungskit) mehrmals auf den Kopf, um die magnetischen Beads wieder zu suspendieren. Entfernen Sie nach einem kurzen Wirbel für 10 s vorsichtig die Aluminiumfoliendichtung von der Platte.
3. Übertragen Sie 200 μl Magenflüssigkeit aus jeder Probe und H. pylori-DNA als Positivkontrolle in die separaten Vertiefungen.
4. Platzieren Sie die 32-Well-Platte für die automatische DNA-Extraktion in den entsprechenden Probenschlitz der Nukleinsäure-Extraktionsmaschine.
5. Nach der DNA-Extraktion und -Bestätigung wird der Antibiotikaresistenztest auf Clarithromycin und Levofloxacin durch qPCR an den positiven Proben eingeleitet.
6. Legen Sie die überschüssige Magenflüssigkeit und die extrahierten DNA-Proben auf −20 °C, um sie langfristig zu lagern und später zu verwenden.
7. Führen Sie alle diese Schritte in einer Biosicherheitswerkbank durch, um eine Kontamination zu vermeiden.

3. qPCR zum Nachweis von H. pylori und Resistenz gegen Antibiotika (Clarithromycin und Levofloxacin)

1. Führen Sie eine qPCR zum Nachweis von H. pylori und den vermuteten Antibiotikaresistenzmutationen in seinem Genom durch.
   1. Tauen Sie die qPCR-Reaktionsmischung (H. pylori-Nukleinsäure-Nachweiskit) auf Eis auf und mischen Sie sie durch Schnippen und Drehen, um einen Reagenzverlust zu vermeiden.
   2. Mischen Sie für jede Probe auf einer 32-Well-Platte 20 μl PCR-Reaktionsmischung (Genotypisierungs-Reaktionsvormischung [mit dem Taq-Enzym, Desoxyribonukleosidtriphosphat, Reaktionspuffer und Magnesiumchlorid] mit Harnstoff-Vorwärts- und Rückwärtsprimern und einer Harnstoff-Sonde ) und 5 μl der extrahierten DNA.
   3. Führen Sie die 32-Well-qPCR-Platte auf dem qPCR-Gerät aus. Thermocycler programmieren: Das Reaktionsgemisch wird zunächst nacheinander bei 42 °C und 95 °C (beide für einen Zyklus) für jeweils 2 min umgesetzt; dann 40 Zyklen bei 95 °C, Denaturierung für 10 s und Glühen und Ausdehnung bei 58 °C für 45 s.
   4. Stellen Sie die Fluoreszenzsignalerfassung auf FAM (H. pylori) und die Datenerfassung auf die Verstärkungsverlängerungsperiode ein. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, speichern Sie die Daten für zukünftige Ergebnisanalysen.
   5. Analysieren Sie die Daten mit einer speziellen Software für die qPCR, da das Gerät automatisch Baseline-Schwellenwerte auswählt.
   6. Wenn das Testergebnis für H. pylori positiv ist, beginnt das Gerät automatisch mit der Prüfung der Arzneimittelresistenz an der Probe. Ersetzen Sie das Reagenzien-Kit durch Nachweisreagenzien für 23S rRNA-Gen- und gyrA-Genmutationen im H. Pylori (qPCR)-Kit.
      HINWEIS: Das Reagenzien-Kit (Nachweisreagenzien für 23S rRNA-Gen- und gyrA-Genmutationen in Helicobacter pylori [qPCR]) enthält die PCR-Reaktionsmischung (Genotypisierungs-Reaktionsvormischung [enthält das Taq-Enzym, Desoxyribonukleosidtriphosphat, Reaktionspuffer, Magnesiumchlorid], Primer und Sonden). Bei allen Produkten zur negativen Qualitätskontrolle handelt es sich um steriles, gereinigtes Wasser. Das Produkt zur positiven Qualitätskontrolle im H. pylori-Nukleinsäurenachweiskit sind inaktivierte H. pylori-Standardbeads (ATCC 43504). Die starken H. pylori-positiven und schwach positiven Qualitätskontrollprodukte im Kit (Nachweisreagenzien für 23S rRNA-Gen- und gyrA-Genmutationen in H. pylori) sind die DNA des inaktivierten H. pylori-Stammes, der das Zielgen enthält, und das mutierte Gen. In ähnlicher Weise werden auf der Grundlage der tatsächlichen Situation alle diagnostischen Standards, einschließlich des Vorliegens einer H. pylori-Infektion oder Arzneimittelresistenz, auf CT ≤ 35 eingestellt und haben eine typische S-förmige Kurve. Die Konzentration der schwachen Qualitätskontrolle beträgt 1,0 x 10³ Kopien/ml, während die Konzentration der starken Qualitätskontrolle 1,0 x 10⁸ Kopien/ml beträgt.

Nachweis von H. pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz in der Magenflüssigkeit mittels qPCR
Wir führten eine qPCR zum Nachweis einer H. pylori-Infektion durch, indem wir das ureA-Gen amplifizierten und sein Antibiotikaresistenzprofil bestimmten, indem wir auf Punktmutationen im 23S rRNA-Gen und im gyrA-Gen abzielten (Tabelle 1). Die CT-Werte der Qualitätskontrolle lagen in allen drei Gruppen der qPCR-Experimente innerhalb des empfohlenen Bereichs, was darauf hindeutet, dass sich die Proben zum Zeitpunkt des Experiments alle in einem normalen Zustand befanden und die Testergebnisse zuverlässig waren. In dieser Studie wurden fünf Proben mit unterschiedlichen Testergebnissen (S1-S5) ausgewählt, um die Zuverlässigkeit des experimentellen Protokolls zu charakterisieren. S1 stellt einen repräsentativen Stamm von H. pylori ohne Infektion dar, während es sich bei den S2-S5-Proben um mit H. pylori infizierte Proben mit unterschiedlichen Resistenzergebnissen handelt (Abbildung 1). Wir stellten das System so ein, dass keine weiteren Resistenztests mit den nicht mit H. pylori infizierten Proben durchgeführt wurden, so dass die S1-Probe nicht in den Resistenztest aufgenommen wurde, nachdem der Systemtest ein negatives Ergebnis für H. pylori ergab. In Bezug auf die Proben, die positiv auf eine H. pylori-Infektion waren, lagen die S2-CT-Werte alle innerhalb des Nachweisbereichs, was darauf hindeutet, dass die Probe H. pylori-positiv war und eine doppelte Resistenz gegen Clarithromycin und Levofloxacin aufwies, und den Ärzten wurde empfohlen, andere Behandlungsmethoden nach eigenem Ermessen zu wählen. Die S3-CT-Werte lagen innerhalb des Nachweisbereichs für eine H. pylori-Infektion und den Levofloxacin-Resistenztest, während im Clarithromycin-Resistenztest keine CT-Werte nachgewiesen wurden, was darauf hindeutet, dass die S3-Probe von einem Levofloxacin-resistenten Patienten stammte. In ähnlicher Weise lag der CT-Wert der S4-Probe innerhalb des Nachweisbereichs für eine H. pylori-Infektion und eine Clarithromycin-Resistenz, während kein CT-Wert für eine Levofloxacin-Resistenz nachgewiesen wurde, was darauf hindeutet, dass dieser Patient gegen Clarithromycin resistent war, und es wurde empfohlen, Levofloxacin zur Behandlung einzunehmen. Schließlich zeigte der S5-Stichprobentest CT-Werte innerhalb des Nachweisbereichs nur für den Nachweis einer H. pylori-Infektion, was darauf hindeutet, dass dieser Patient auf beide Antibiotika empfindlich reagierte und mit einem der beiden Medikamente behandelt werden konnte. Im Vergleich zur Bakterienkulturmethode, die auch H. pylori-Infektionen und Arzneimittelresistenzen nachweist, ist diese Methode sicher und effektiv beim Nachweis von H. pylori-Infektionen und Arzneimittelresistenzen, ohne dem Patienten Schaden zuzufügen, und kann als Anleitung für den Arzt bei der Formulierung eines geeigneten Behandlungsplans verwendet werden.

Abbildung 1: Nachweis von H. pylori und seiner Antibiotikaresistenz in Magenflüssigkeit mittels qPCR.
(A) Quantitative PCR-Amplifikation der H. pylori-Infektion , (B) Nachweis der Clarithromycin-Resistenz und (C) Nachweis der Levofloxacin-Resistenz. "S" steht für Sample. "S1" ist eine Probe, die negativ auf eine H. pylori-Infektion zurückkam und auch auf Antibiotikaresistenz getestet wurde. "S2" ist eine mit H. pylori infizierte Probe mit Resistenz gegen Clarithromycin und Levofloxacin; "S3" ist ebenfalls eine H. pylori-positive Probe, aber Clarithromycin-anfällig und Levofloxacin-resistent; "S4" ist ebenfalls eine H. pylori-positive Probe, aber Clarithromycin-resistent und levofloxacin-empfindlich; "S5" ist eine H. pylori-positive Probe, ist aber sowohl für Clarithromycin als auch für Levofloxacin empfänglich. Die Konzentration der schwachen Qualitätskontrolle beträgt 1,0 x 103 Kopien/ml, während die Konzentration der starken Qualitätskontrolle 1,0 x 108 Kopien/ml beträgt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Tabelle mit den qPCR-Ergebnissen des Nachweises einer H. pylori-Infektion und einer Resistenz gegen Clarithromycin und Levofloxacin. Diese Tabelle zeigt die qualitativen Ergebnisse für eine H. pylori-Infektion , den Nachweis von 23S rRNA-Genmutationen, die zeigen, dass das Isolat gegen Clarithromycin resistent ist, und den Nachweis von Mutationen im gyrA-Gen , die zeigen, dass das Isolat gegen Levofloxacin resistent ist. +/−, qualitatives Ergebnis; +, positives Ergebnis; −, negatives Ergebnis.

Nichts.