Methodenartikel

Frühe ungesteuerte neurovaskuläre Nischenmodellierung des menschlichen Gehirns in die permissive Chorioallantoismembran des Hühnerembryos

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DOI:

10.3791/65710

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16. Februar 2024

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1Instituto de Biología Celular y Neurociencias “Prof. E. De Robertis” (IBCN), CONICET - Universidad de Buenos Aires, 2Facultad de Medicina, Departamento de Biología Celular, Histología, Embriología y Genética, Universidad de Buenos Aires, 3Institute of Neurosciences, Pathology and Experimental Therapeutics Dept, University of Barcelona, 4Functional Neurogenomics Group, Neurodevelopmental Disorders, IDIBELL, L’Hospitalet de Llobregat, 5IBE, Institute of Evolutionary Biology (UPF-CSIC), Department of Medicine and Life Sciences, Universitat Pompeu Fabra, 6Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA) and Universitat Pompeu Fabra, 7Center for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology, 8BarcelonaBeta Brain Research Center, Pasqual Maragall Foundation, 9Instituto de Investigación en Biomedicina (IBioBA) – CONICET – Instituto Partner de la Sociedad Max Planck

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um menschliche Gehirnorganoide in mehreren Reifungsstadien in die Chorioallantoismembran (CAM) des Kükens einzutransplantieren. Gehirnorganoide wurden nach ungesteuerten standardisierten Protokollen gezüchtet.

Zusammenfassung

Die Transplantation von Organoiden in vaskularisierte Gewebe von Modelltieren, wie z. B. der immundefizienten Chorioallantoismembran (CAM) von Maus- oder Hühnerembryonen, hat sich für die Modellierung der Neovaskularisation als effizient erwiesen. Die CAM ist eine reich vaskularisierte extraembryonale Membran, die eine begrenzte Immunreaktivität aufweist und somit zu einem hervorragenden Wirtsmodell für Zelltransplantationen menschlichen Ursprungs wird.

Diese Arbeit beschreibt die Strategie, menschliche Gehirnorganoide, die sich in mehreren Reifungsstadien differenziert haben, in die CAM zu transplantieren. Die zelluläre Zusammensetzung von Gehirnorganoiden ändert sich mit der Zeit und spiegelt die Meilensteine der menschlichen Gehirnentwicklung wider. Wir transplantierten Gehirnorganoide in relevanten Reifungsstadien: neuroepitheliale Expansion (18 DIV), frühe Neurogenese (60 DIV) und frühe Gliogenese (180 DIV) in das CAM von embryonalen Tag (E)7 Hühnerembryonen. Transplantierte Hirnorganoide wurden 5 Tage später entnommen und ihre histologischen Merkmale analysiert.

Es wurden keine histologischen Anzeichen einer Neovaskularisation in den transplantierten Organoiden oder abnormalen Blutgefäßen neben den Transplantaten festgestellt. Darüber hinaus wurden bemerkenswerte Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung der transplantierten Organoide beobachtet, nämlich eine Zunahme der Anzahl der sauren Gliaprotein-positiv-reaktiven Astrozyten. Die zytoarchitektonischen Veränderungen waren jedoch vom Organoid-Reifungsstadium abhängig. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Gehirnorganoide in der CAM wachsen können, und sie zeigen Unterschiede in der Zytoarchitektur in Abhängigkeit von ihrem Reifestadium bei der Transplantation.

Einleitung

Organoide des menschlichen Gehirns sind eine aufstrebende Technik, die es uns ermöglicht, die frühe Entwicklung des menschlichen Gehirns in vitro zu rekapitulieren 1,2,3. Eine der größten Einschränkungen dieses Modells ist jedoch die fehlende Vaskularisierung, die nicht nur bei der Homöostase des Gehirns, sondern auch bei der Entwicklung des Gehirns eine unverzichtbare Rolle spielt4. Zusätzlich zur Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass das Gefäßsystem des Gehirns die neuronale Differenzierung, Migration und Synaptogenese während der Entwicklung reguliert 5,6. Daher ist es dringend erforderlich, zuverlässige Modelle zu etablieren, die die fehlende vaskuläre Signalübertragung und Struktur für Gehirnorganoide liefern können, was die Komplexität der Generation menschlicher Gehirnorganoideerhöht 7.

Unter den vorgeschlagenen Methoden zur Vaskularisierung können zwei Hauptstromlinien in Betracht gezogen werden: die Organoid-Transplantation in einen lebenden Organismus und reine In-vitro-Technologien zur Kokultivierung von Endothelzellen und Nervenzellen 8,9,10,11,12. Die intrazerebrale Transplantation bei Mäusen ist kostspielig und zeitaufwändig, so dass andere Technologien für einfachere Modelle relevant sind. Der Chick Chorioallantoic Membran (CAM)-Assay wurde ausgiebig zur Untersuchung der Angiogeneseverwendet 13,14,15. In den letzten zehn Jahren haben mehrere Gruppen erfolgreich verschiedene Arten von Organoiden, darunter Nieren16,17, Herz18 und Tumororganoide19,20, in CAMs transplantiert. Dennoch ist wenig über die Wirksamkeit, Toxizität/Abstoßung, physiologische Wirkung und Methoden zur Transplantation menschlicher Gehirnorganoide in die CAM bekannt. Ein weiterer interessanter und noch unerforschter Aspekt ist die Bildung einer chimären Blut-Hirn-Schranke (BHS) zwischen der CAM und der organoiden astrozytischen Grenzfläche. Frühere Pionierarbeiten deuteten auf die mutmaßliche Machbarkeit der Erzeugung einer BHS in der CAM durch Transplantation von Astrozyten und Astrozyten-konditioniertem Mediumhin 21,22,23. Reife Astrozyten scheinen jedoch nicht in der Lage zu sein, dies zu erreichen24,25. Daher bleibt die Astrozyten-induzierte Bildung der BHS umstritten, und die Transplantation menschlicher Gehirnorganoide würde es uns ermöglichen, Licht in diese Kontroverse zu bringen.

Dieser Videoartikel beschreibt ein Protokoll für eine In-Ovo-Organoidtransplantation des menschlichen Gehirns in CAM, die Wachstum, Verbesserung und Vaskularisierung fördert und zu Organoiden führt, die histologisch kompatible BHS-Elemente umfassen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das das Überleben des Hühnerembryos sicherstellt, und berichten über die Permissivität der CAM zur Aufrechterhaltung des Wachstums von Gehirnorganoiden.

Protokoll

Die Embryonen des Weißen Leghornhuhns (Gallus gallus) wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, USA, behandelt, und die Experimente wurden vom Council for Care and Use of Experimental Animals der Universität Barcelona genehmigt.

1. Ungesteuerte Präparation von Gehirnorganoiden

  1. Halten Sie H9 humane embryonale Stammzellen (hESCs) in mTESR1, die bei Raumtemperatur (RT) unter einem Konfluenz von 70 % in 6-Well-Platten beschichtet sind, die mit in DMEM gelöstem Matrigel (1:40) beschichtet sind, in einem 5 % CO2 -Inkubator bei 37 °C.
    HINWEIS: Matrigel muss bis zu seiner Verwendung als Beschichtung in Eis aufbewahrt werden, um seine Polymerisation zu verhindern.
  2. Generieren Sie Gehirnorganoide nach dem ungesteuerten Gehirnprotokoll 2.
    1. Dissoziieren Sie H9-hES-Zellen mit 500 μl der Zelldissoziationslösung und inkubieren Sie sie 3-5 Minuten lang bei 37 °C. Resuspendieren Sie in mTESR1 mit einem ROCK-Inhibitor Y27632 (Endkonzentration 50 μM) und säen Sie 9.000 Zellen pro Well in einer vorbehandelten 96-Well-Platte mit geringer Adhäsion aus.
    2. Sobald die Organoide in mTESR1 mit einem ROCK-Inhibitor Y27632 (Endkonzentration 50 μM) aggregiert sind, werden sie für 5-6 Tage in Induktionsmedium überführt.
    3. Übertragen Sie die Organoide nach dem ungesteuerten Gehirn-Organoid-Protokoll26 an ~ Tagen 4-5 auf neuronale Induktionsmedien.
    4. Sobald sie die Größe und den Neuroepithelring angenommen haben, überführen Sie sie in einen eiskalten Matrigel-Tropfen. Sobald das Matrigel polymerisiert ist, werden die Organoide in eine 5 cm große, adhäsionsarme Petrischale mit 5 ml vorgewärmtem Reifungsmedium gegeben.
    5. Setzen Sie die Gehirnorganoide nach 4 Tagen unter orbitale Bewegung.
  3. Sammeln Sie die Organoide für die Ernte in frischem DPBS unmittelbar vor dem Pfropfen.

2. Eierhaltung, Entwicklungsaktivierung und Eierschalenpunktion

  1. Befruchtete Eier (am Tag 0) bis zur Verwendung in einem Inkubator bei 18 °C lagern.
    HINWEIS: Bei dieser Temperatur entwickeln sie sich nicht und bleiben im gleichen Reifestadium.
  2. Bei Bedarf bei 38 °C und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit mit sanfter Schaukelrotation in einem Winkel von 45 °C inkubieren.
  3. Reinigen Sie an Tag 1 die Eierschalenoberfläche mit 70% Ethanol und trocknen Sie sie mit einem Papiertuch ab, um sie zu sterilisieren.
  4. Legen Sie einen chirurgischen Papierklebeverband, im Folgenden als "Verband" bezeichnet, auf das Ei und bedecken Sie die Luftkammer des Eies.
    Anmerkungen: Dadurch wird verhindert, dass Staub von der Eierschale in das CAM fällt, wo er stecken bleibt.
  5. Führen Sie die Luftkammerperforationspunktion, im Folgenden als Luftkammerloch (ACH) bezeichnet, mit einer sterilen Nadel 21 G x 11/2'' durch und stechen Sie die Eierschale sanft durch. Öffnen Sie den ACH an der oberen Spitze des Eies, um das CAM nicht zu stören, das an dieser Stelle von der Schale getrennt liegt.
  6. Um die beste Position zum Durchstechen des ACH zu finden, verwenden Sie eine Lampe, um die dünnste Eierschalenoberfläche an der oberen Spitze des Eies zu bestimmen. Die direkte Lichtdurchlässigkeit zeigt die beste Position zum Bohren an.
  7. Decken Sie den ACH mit einem neuen Verband ab, um den Embryo vor der äußeren Umgebung zu schützen, und legen Sie das Ei zurück in den Inkubator.
  8. Beenden Sie von diesem Moment an die Rotation im Inkubator und halten Sie die Eier in vertikaler Position mit dem Fenster oben.
    HINWEIS: Dies erleichtert die Entwicklung des Embryos, und die CAM wird oben mit einer Luftkammer zwischen dem Embryo und der Eierschale verfügbar, was eine anschließende Transplantation ermöglicht.
  9. Öffnen Sie das ACH von Tag 1 bis Tag 4. Die Lebensfähigkeit nimmt am Tag 4 (3 Tage vor dem Transplantationstag) zu.

3. Transplantation von Gehirnorganoiden

  1. Führen Sie die Transplantation am 7. Tag durch, wenn die CAM gut entwickelt und vaskularisiert ist, und bedecken Sie die Eizelle über den gesamten Embryo.
  2. Entfernen Sie den Verband und wischen Sie die Oberfläche der Eierschale mit 70% Ethanol ab, um die Eierschale zu sterilisieren, bevor Sie den ACH vorsichtig in ein Veredelungsfenster erweitern.
  3. Legen Sie einen neuen, größeren Verband an, der die Verlängerung über das endgültige Pfropffenster hinaus abdeckt, um zu vermeiden, dass Eierschalenfragmente in das CAM fallen, während das Pfropffenster vergrößert wird.
    HINWEIS: Dieses größere Fenster wird benötigt, um die beste Pfropfposition auszuwählen und anschließend zu pfropfen.
  4. Vergrößern Sie das Veredelungsfenster, indem Sie die Eierschale sanft durchstechen, bis das Fenster einen Durchmesser von ca. 2 cm erreicht. Entfernen Sie vorsichtig die Ränder des Eierschalenfensters mit einer Pinzette, bis das Fenster vergrößert ist. Entfernen Sie den restlichen Staub und die Eierschalenstücke, die am Verband haften, indem Sie den Verband vorsichtig abziehen.
  5. Platzieren Sie das Organoid mit einer automatischen P200-Pipette. Schneiden Sie die Spitzen mit einer sterilen und scharfen Schere ab, um die Öffnung entsprechend der Größe des Organoids zu vergrößern und eine Beschädigung des Organoids zu vermeiden, oder verwenden Sie sterile Breitbandspitzen. Sammeln Sie das Organoid in einem maximalen Volumen von 50 μl PBS und übertragen Sie es direkt in das CAM auf einer Seite, die der Position des Embryos gegenüberliegt.
  6. Stellen Sie sicher, dass die Position des Transplantats vom Eigelb entfernt ist, um einen Bruch während der Entnahme zu vermeiden, und legen Sie es vorzugsweise in die Nähe eines Blutgefäßes.
  7. Geben Sie einen Tropfen von 7 μl Matrigel um das Organoid, nachdem Sie das Organoid auf das CAM gelegt haben.
    HINWEIS: Dadurch wird verhindert, dass sich das Organoid um die Membran bewegt.
  8. Schließen Sie das Fenster mit einem kleinen Stück Parafilm, das genau auf die Größe des Fensters passt, und befestigen Sie es mit einem Klebeverband an der Schale.
    HINWEIS: Es ist wichtig, das Fenster vollständig mit dem Parafilm abzudecken, um ein Austrocknen des Embryos zu verhindern und gleichzeitig einen Gasaustausch zu ermöglichen. Die Ausdehnung der Fensterabdeckung ist richtig abzugrenzen und eine Überschreitung des Fensters zu vermeiden, da dies den notwendigen Gasaustausch für eine korrekte Embryonalentwicklung behindern könnte27.

4. Transplantierte Organoid-Ernte

  1. Ernten Sie die gepfropften Organoide und das umgebende CAM am Tag 12 der Hühnerentwicklung, entsprechend 38 Hamburger und Hamilton Entwicklungsstadium (HH38)28, 5 Tage nach der Pfropfung. In diesem Stadium ist die CAM mit dem reifen Gefäßsystem vollständig differenziert, während die Federkeime sowohl die Flügel als auch das obere Augenlid des Embryos bedecken.
  2. Vergrößern Sie nach dem Entfernen des Klebeverbandes das Fenster weiter, um die Probenentnahme mit einer Schere und einer feinen Pinzette zu erleichtern.
  3. Visualisieren Sie das Organoid bei Bedarf mit Hilfe einer binokularen Dissektionsmikroskopie, gefolgt von einem 2-minütigen Präfixierungsschritt mit 4 % Paraformaldehyd (PFA), um die Organoid- und CAM-Ernte zu unterstützen.
  4. Entnehmen Sie einen 1,5 cm2 großen Abschnitt des CAM, der das Organoid enthält.
  5. Probenfixierung
    1. Waschen Sie die Proben mit 1x PBS und fixieren Sie sie mit 4% PFA (in PBS, pH 7,2) für 30 min bei 4 °C. Waschen Sie die Proben dann 3 x 5 Minuten lang in PBS.
    2. Lagern Sie die Proben bei 4 °C in PBS mit Natriumazid oder kryokontieren Sie sie direkt in 30 % Saccharose-PBS über Nacht bei 4 °C.
    3. Betten Sie die Proben nach der Kryoprotektion in eine Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) ein und lagern Sie sie bis zum Schneiden bei -20 °C. Schneiden Sie 20 μm dicke Gewebescheiben mit einem Kryostaten und sammeln Sie sie auf xylanisierten Objektträgern. Lagern Sie die Objektträger bei -20 °C, bis sie zum Färben verwendet werden.

5. Immunfluoreszenz

  1. OCT. mit einer PBS-Lösung mit 0,1% Triton X-100 (PBS-T) für 10 min bei Raumtemperatur (RT) aus den Schnitten entfernen.
  2. Behandeln Sie die Schnitte mit einer Blockierungslösung (BS) mit einer 2% BSA, 3% Eselsserum PBS-T 0,01% Lösung für 1 h bei RT.
  3. Verdünnen Sie den ausgewählten Primärantikörper (siehe Materialtabelle) in BS und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 4 °C.
  4. Am nächsten Tag waschen Sie die Proben 3 x 10 min in 1x PBS bei RT.
  5. Verdünnen Sie den Sekundärantikörper in BS und inkubieren Sie ihn 2 h lang bei RT (siehe Materialtabelle).
  6. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), um die Zellkerne bei RT zu markieren, verdünnt in PBS-T in einer Verdünnung von 1:1.000.
  7. Montieren Sie die Dias mit Montagemedium und decken Sie sie mit Glasabdeckgläsern ab.
  8. Nehmen Sie alle Bilder mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop bei 2,5, 10, 20 und 40x auf.
  9. Die Scheiben bei 4 °C lagern.

6. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H & E)

HINWEIS: Um zu beweisen, dass die Transplantation funktioniert hat, führen Sie eine H&E-Färbung durch.

  1. OCT mit PBS-T 0,1% für 10 min bei RT entfernen.
  2. Führen Sie die serielle Dehydratisierung in einer Haube wie folgt durch: 10 min in destilliertem Wasser (DW), 45 s in Hämatoxylin, 1 min in DW, 20 s in PBS, 2 x 30 s in 70 % EtOH, 2 x 30 s in 80 % EtOH, 2 x 30 s in 96 % EtOH, 30 s in Eosin, 2 x 15 s in 96 % EtOH, 2 x 15 s in 100% EtOH, 1 min in Xylol-100% ETOH, 1 min in Xylol, 1 min in Xylol (frisch).
  3. Montieren Sie die Glasdeckgläser mit einem Eindeckmedium auf Xylolbasis.

Ergebnisse

Auswahl des Embryoreifungsplans für die Transplantation
Das Experiment beginnt bei D0, wenn befruchtete Eier bei 38 °C und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit bebrütet werden. Die Chorioallantoismembran (CAM) ist eine stark vaskularisierte extraembryonale Membran, die sich nach der Inkubation von Eiern entwickelt. Es entsteht durch die Verschmelzung von Allantois und Chorion. Bei D1, nach 24 Stunden Inkubation, wird die Luftkammer punktiert, um zu verhindern, dass sich das CAM an der inneren Schalenmembran festsetzt. Das Durchstechen der Luftkammer bei D1 verbessert die Qualität der Luftkammer im Vergleich zur Punktion in späteren Stadien (D4). Das CAM wächst bis D12 weiter, wenn es den gesamten Eiinhalt umhüllt und fest an der inneren Schalenmembran haftet (Abbildung 1). Das Loch bei D7 wird vergrößert, um die Probenentnahme zu erleichtern. D7 ist der optimale Zeitpunkt für die Transplantation, wenn die CAM reif ist und den Dottersack und die Embryooberfläche bedeckt. In diesem Stadium wird das Luftkammerloch vergrößert und die Organoide werden mit Hilfe einer automatischen Pipette in das CAM übertragen.

Transplantation von Gehirnorganoiden
Während der inhärenten Reifung von Gehirnorganoiden in vitro ändert sich ihre zelluläre Zusammensetzung von neuronalen Vorläuferzellen zu reifen Neuronen und Gliazellen. Neurovaskulatur und Neurogenese sind vermischte und voneinander abhängige Entwicklungsprozesse bei Wirbeltieren, und die Signalübertragung, die zu diesem Crosstalk führt, hängt stark vom Reifungsstadium des neuronalen Gegenstücksab 29. Neuronale Vorläuferzellen sind die Hauptquelle für proangiogene Faktoren im sich entwickelnden Gehirn29,30. Im Gegensatz dazu unterstützen Neuronen und Astrozyten die Neoangiogenese im reifen Stadium und im Erwachsenenalter durch die Sekretion des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors31,32. Diese Veränderungen in der Zytoarchitektur des Gehirns, die sich auch in Gehirnorganoiden widerspiegeln, können je nach Reifungsstadium der Gehirnorganoide zu unterschiedlichen Veränderungen in der Integration und Reaktion auf die CAM-Transplantation führen. Daher transplantierten wir Gehirnorganoide am Differenzierungstag 13 in vitro (DIV), wenn sich Neuroepithelzellen und radiale Gliazellen ausdehnen; bei DIV 37, zu Beginn der Neurogenese; bei DIV 60, wenn die Neurogenese robust ist und Neuronen verschiedener Identitäten endgültig differenziert sind; und bei DIV 120, wenn eine Vielzahl reifer Neuronen das Organoid besiedelt, erzeugt ein gut entwickeltes neuronales Netzwerk und die Astrogenese ist ebenfalls weit verbreitet.

In allen Fällen wurden die Proben nach 5 Tagen In-Ovo-Inkubation (DIO) entnommen. Um Verzerrungen aufgrund des Batch-Effekts in Gehirnorganoiden zu vermeiden, wurden alle Vergleiche zwischen transplantierten und nicht transplantierten Organoiden in derselben Charge paarweise durchgeführt. Organoide wurden aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten pro Zeitpunkt und insgesamt sechs unabhängigen Differenzierungen abgeleitet. Die Veredelung mehrerer Reifungsstadien wurde in jedem Pfropfexperiment parallel durchgeführt. Nach der Transplantation setzten die Organoide den Reifungsprozess neben den CAM-Gefäßen fort, ohne dass eine Infiltration von Blutgefäßen in das Organoid nachgewiesen wurde (Abbildung 2).

Das Überleben von Organoiden nach der Transplantation reicht von 80 % bei den Jüngsten und sinkt bei reifen Organoiden 5 Tage nach der Transplantation auf ~66 %, was darauf hindeutet, dass sich die Permissivität und die Plastizität der Organoidtransplantation im Laufe der Zeit ändern können (Tabelle 1). Die Organoid-Viabilität wurde durch das Vorhandensein von pyknotischen Kernen in H&E-Färbungen bestimmt. Die Anzahl der pyknotischen Kerne war zwischen transplantierten und nicht transplantierten Kontrollorganoiden ähnlich (Abbildung 3), was darauf hindeutet, dass CAM das lebende Organoid nach der Transplantation permissiv erhält. Darüber hinaus wurde an der CAM keine histologische oder hämogene Freisetzung festgestellt, und die Embryonen bleiben am Leben, was darauf hindeutet, dass weder das Transplantationsverfahren noch das Organoid die Integrität der CAM stören oder die Embryonalentwicklung signifikant beeinträchtigen.

Zellzusammensetzung in transplantierten Hirnorganoiden
Ungesteuerte Hirnorganoide weisen eine ausgeprägte inter- und intraorganoide zelluläre Variabilität auf. Sie sind jedoch überwiegend neuronal und erzeugen Wellen von Vorläufern, Neuronen und Astrozyten in einem sequentiellen Tempo 2,26. Als nächstes untersuchten wir, ob die Transplantation die neuronale Zusammensetzung in den Gehirnorganoiden verändert. Jüngere Organoide (13 DIV + 5 DIO: 18 Tage) zeigen in Gegenwart von Neuronen (TUBB3+) keine Unterschiede zu ihren nicht transplantierten Kontrollorganoiden. In späteren Reifungsstadien (60 DIV + 5 DIO: 65 Tage und 120 DIV + 5 DIO: 125 Tage) ist der Anteil der Neuronen (TUBB3+) im Vergleich zu nicht transplantierten Organoiden dramatisch verringert (Abbildung 4). In nicht transplantierten Organoiden, die für 60 DIV gereift sind, sind Neuronen weit um die Organoide herum verteilt.

Insbesondere die Anzahl und Lokalisation von Gliafibrillär-Acid-Protein-positiven (GFAP+) Astrozyten zeigte einen Anstieg im Vergleich zu denen, die bei den nicht transplantierten Kontrollen beobachtet wurden. Darüber hinaus erhielten diese GFAP+ -Astrozyten eine unerwartete Lokalisation an der Außenseite des Organoids. In 18 DIV sind freie Organoide (nicht transplantiert), wenige Astrozyten zu sehen und es konnte keine strukturelle Verteilung nachgewiesen werden; im Gegenteil, sie scheinen homogen über das Organoid verteilt zu sein (Abbildung 3).

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Abbildung 1: Zeitleiste des CAM-Assay-Setups für die Organoidtransplantation. (A) Anlegen eines chirurgischen Papierklebeverbandes auf der Eizelle. (B) Mit einer Nadel über dem Klebeverband ein Loch in die Schale bohren. (C) Öffnen Sie das Fenster der Eierschale, Blick von oben, bereit für die Transplantation eines (D) menschlichen Gehirnorganoids (Tag 60). Maßstabsbalken = 100 μm. (E) Visualisierung des transplantierten Organoids am CAM nach 5 Tagen In-Ovo-Inkubation . (F) Kennzeichen der Entwicklung von Gehirnorganoiden von Tag 0 bis Tag 120. Der Pfeil zeigt die Position des Organoids an. Abkürzung: CAM = chorioallantoische Membran. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 2: Hämatoxylin- und Eosinfärbung von transplantierten Organoiden in der Chorioallantoismembran. (A) 13 DIV + 5 DIO-Organoid; (B) 37 DIV + 5 DIO-Organoid, (C) 60 DIV + 5 DIO-Organoid, und (D) 120 DIV + 5 DIO-Organoid; rote Quadrate markieren das Organoid. Maßstabsleiste = 500 μm. Abkürzungen: DIV = Tag in vitro; DIO = Tag in ovo. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 3: Immunzytochemie von Organoiden in verschiedenen Entwicklungsstadien. GFAP wurde für die Färbung und DAPI für die Zellkerne verwendet. Maßstabsbalken = 100 μm. (A,B) Bilder desselben 13 DIV + 5 DIO transplantierten Organoids, bei dem Astrozyten am Rand des Organoids zu sehen sind. (C) Bild von 18 DIV-freien Organoiden, bei denen Astrozyten kaum sichtbar sind. Der Unterschied zwischen freien und gepfropften Organoiden ist sehr auffällig. (D,E) Bilder von 37 DIV + 5 DIO transplantierten Organoiden, bei denen nur wenige Astrozyten zu sehen sind. (F) Bild von 42 DIV-freien Organoiden. Gelbe Pfeile zeigen die Position der Astrozyten an. Abkürzungen: DIV = Tag in vitro; DIO = Tag in Ovo; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; GFAP = saures Gliafibrillenprotein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Abbildung 4: Immunzytochemie von 120 DIV-Organoiden. TUBB3 wurde für die Färbung der Neuronen und DAPI für die Zellkerne verwendet. Maßstabsleiste = 100 μm; Die Bilder wurden bei 20x aufgenommen. (A) Ein 120 DIV +5 DIO transplantiertes Organoid, bei dem nur wenige Neuronen zu sehen sind. (B) Ein 125 DIV, freies Organoid mit vielen Neuronen. Das Sternchen zeigt die Position des Organoids an, während die gestrichelte Linie die Grenze zwischen dem Organoid und dem CAM darstellt (bestimmt durch histologische Analyse). Abkürzungen: DIV = Tag in vitro; DIO = Tag in Ovo; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; CAM = chorioallantoische Membran. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Organoide13 DIV37 DIV60 DIV120 DIV
Lebendig6 (75%)10 (83%)6 (66%)6 (66%)
Tot2 (25%)2 (16%)3 (34%)3 (34%)

Tabelle 1: Embryonale Überlebensraten nach CAM-Organoidtransplantation .Abkürzungen: DIV = Tag in vitro; DIO = Tag in Ovo; CAM = chorioallantoische Membran.

Diskussion

In dieser Studie beschreiben wir ein detailliertes Protokoll mit zahlreichen Schlüsselschritten, die ein günstiges Wachstum und eine günstige Entwicklung menschlicher Gehirnorganoide nach der Transplantation ermöglichen, ohne das Überleben der Hühnerembryonen zu beeinträchtigen. Wir empfahlen die Verwendung steriler Nadeln, um die Luftkammer des Eies nach 24 Stunden Inkubation (Tag 1) zu punktieren. Zusätzlich versuchten wir auch, die Punktion an Tag 4 durchzuführen (nachdem wir die Eierschale mit Licht überprüft hatten, um die Entwicklung des Gefäßsystems zu testen, um sicherzustellen, dass wir nur mit gesunden Embryonen arbeiteten). Dies führte jedoch zu einer Abnahme der Lebensfähigkeit der Embryonen aufgrund der Nähe der CAM-Gefäße zur Eierschale. Es ist zu beachten, dass zu viel Kraft zum Bruch der Eierschale mit anschließender Schädigung des CAM-Gefäßsystems führen kann. Die Verwendung einer Lichtquelle zur Erkennung verdünnter Bereiche der Eierschale war hilfreich, um stumpfe Löcher zu bohren und gleichzeitig eine Überpenetration und das Passieren der Eizelle zu verhindern, was zu einer Invasion der CAM führte.

Obwohl die Eirotation für die ordnungsgemäße Entwicklung der Hühnerembryonen während der Inkubation obligatorisch erscheint, muss sie nach dem Durchstechen der Luftkammer vermieden werden. Die Entfernung von Albumin war für dieses Modell nicht gerechtfertigt, ebenso wenig wie die Zugabe von PBS, um eine Dehydrierung des Eies zu vermeiden. Darüber hinaus sollte die Verwendung von 70%iger Ethanollösung mit Bedacht erfolgen, wobei besonders darauf geachtet werden sollte, verbleibende Ethanollösung auf der Schale zu trocknen, um die Lebensfähigkeit der Embryonen zu erhalten. Ein weiterer kritischer Punkt ist die Größe des Eierschalenlochs, das für die Transplantation verwendet wird, was das Ausbalancieren des kleinstmöglichen Lochs erfordert, das den Komfort der Transplantationsmanipulation ermöglicht. Die Auswahl des Embryonalstadiums für die Transplantation (E7) wurde durch das Reifungsstadium des CAM und seine relative Größe bestimmt, was die Integration des Transplantats begünstigte. Für den Fall, dass die transplantierten Organoide jedoch eine längere Eizellreifung benötigen, kann die Transplantation am Tag E5,5/6 durchgeführt werden. Die Variabilität von Gehirnorganoiden wird kontrolliert, um die experimentelle Durchführbarkeit zu gewährleisten. Organoide gleichen Alters weisen ähnliche Größen auf, und es ist wichtig zu beachten, dass sie unabhängig vom Alter der Organoide alle 5 Tage nach der Transplantation inkubiert wurden. Darüber hinaus wurden die Kontrollorganoide aus Gründen der Konsistenz sorgfältig ausgewählt, um der genauen Größe ihrer transplantierten Gegenstücke zu entsprechen. Ein weiterer technischer Aspekt, der für das Überleben sowohl der transplantierten Organoide als auch des Embryos relevant ist, ist das Verschließen des Transplantatlochs mit einem quadratischen Stück Parafilm, um eine kontrollierte Umgebung im Eileiter aufrechtzuerhalten.

Entgegen unseren ursprünglichen Annahmen überlebten junge Organoide nach dem Pfropfprozess und der CAM-Integration besser als die älteren. Wir stellten die Hypothese auf, dass jüngere Organoide aufgrund ihrer angereicherten Präsenz in frühen Vorläuferzellen plastischer sind33, während reife Neuronen eine permissive neuronale Umgebung für ihre Aufrechterhaltung benötigen. Darüber hinaus wurden zytoarchitektonische Veränderungen in den frühen (D18) Organoidtransplantationen des Gehirns in der Verteilung von Astrozyten festgestellt. Insbesondere konnten wir feststellen, dass sich Astrozyten in diesem frühen Stadium nur differenzierten, wenn sie transplantiert wurden, und sie verteilten sich, um eine Pseudokapsel unter der Organoidoberfläche zu erzeugen. Diese Struktur könnte eine Reminiszenz an das Potenzial des Organoids sein, eine neurovaskuläre Schnittstelle zu erzeugen, die die BHS nachahmen könnte. Alternativ könnte die erhöhte Reaktivität von Astrozyten, die in einer barriereartigen Struktur positioniert sind, auf eine immunogene Reaktion des Organoids auf sezernierte Signale von der CAM hinweisen. Es sind jedoch weitere Arbeiten erforderlich, um diese Hypothese zu demonstrieren. Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit die Schritte zur Transplantation von Organoiden mehrerer Entwicklungsstadien in die Hühner-CAM, die eine freizügigere Situation für frühe Entwicklungsorganoide darstellen, und die zelluläre Wirkung dieser Transplantation in Neuronen und GFAP.

Offenlegungen

Die Autoren berichten nicht über Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Dr. Alcántara und Dr. Ortega von der UB und den übrigen Mitgliedern in Dr. Acostas Labor für die aufschlussreichen Diskussionen. S.A. ist Serra-Hunter-Assistenzprofessor an der Generalitat de Catalunya an der Universitat de Barcelona.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-TUBB3 [Tuj1], Maus BioLegend8012011:1.000
Anti-GFAP, KaninchenGeneTexGTX1087111:500
Anti-Kaninchen AlexaFluor 488, Ziege.InvitrogenA-212061:1.000
Anti-Maus AlexaFluor 594, ZiegeJackson ImmunoResearch715-585-1501:500
Befruchtete Eier aus weißem Leghorn (Gallus gallus)Granja Gibert (Cambrils, Spanien)
DAPIInvitrogenD13061:10.000
DPXSigma100579Eindeckmedium auf Xylolbasis 
Sanfte DissoziationslösungCreativeBiolabsITS-0622-YT187Zelldissoziationslösung
MatrigelBD Biosciences356234
Mowiol 4-88 EindeckmittelMerk81381
Papiertuch,Laborqualität Sigma-AldrichZ188956 ROCK-Inhibitor
Y27632MilliporeSCM07510 nM
Chirurgische Schere mit scharfer SpitzeVWR470106-340
Superfrost Plus Adhäsionsmikroskop-ObjektträgerEprediaJ1800AMNZ

Referenzen

  1. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
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