Methodenartikel

Verfolgung der Ausbreitung von Tumorzellen aus Lungenmetastasen mittels Photokonversion

DOI:

10.3791/65732

⸱

7. Juli 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 2Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 4Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 5Montefiore Einstein Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 6Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 7Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 8Department of Cancer and Cellular Biology, Lewis Katz School of Medicine, Fox Chase Cancer Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir stellen eine Methode zur Untersuchung der Redissemination von Tumorzellen aus Lungenmetastasen vor, die ein chirurgisches Protokoll zur selektiven Photokonversion von Lungenmetastasen beinhaltet, gefolgt von der Identifizierung von redisseminierten Tumorzellen in tertiären Organen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metastasen - die systemische Ausbreitung von Krebs - sind die häufigste krebsbedingte Todesursache. Obwohl die Metastasierung gemeinhin als unidirektionaler Prozess angesehen wird, bei dem sich Zellen aus dem Primärtumor ausbreiten und Metastasen säen, können sich Tumorzellen in bestehenden Metastasen auch wiederausbreiten und neue Läsionen in tertiären Lokalisationen hervorrufen, in einem Prozess, der als "Metastasierung-von-Metastasen" oder "Metastasen-zu-Metastase-Seeing" bekannt ist. Die Aussaat von Metastasen zu Metastasen kann die Metastasierungslast erhöhen und die Lebensqualität und das Überleben des Patienten beeinträchtigen. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die Prozesse hinter diesem Phänomen zu verstehen, um Behandlungsstrategien für Patienten mit metastasierendem Krebs zu verfeinern.

Über die Aussaat von Metastasen zu Metastasen ist wenig bekannt, was zum Teil auf logistische und technologische Einschränkungen zurückzuführen ist. Studien zur Metastasen-zu-Metastase-Aussaat stützen sich in erster Linie auf Sequenzierungsmethoden, die für Forscher, die den genauen Zeitpunkt von Metastasen-zu-Metastase-Seeding-Ereignissen untersuchen oder was sie fördert oder verhindert, möglicherweise nicht praktikabel sind. Dies unterstreicht den Mangel an Methoden, die die Untersuchung der Metastasen-zu-Metastasen-Aussaat erleichtern. Um dieses Problem anzugehen, haben wir ein murines chirurgisches Protokoll für die selektive Photokonversion von Lungenmetastasen entwickelt und beschreiben es hier, das eine spezifische Markierung und Schicksalsverfolgung von Tumorzellen ermöglicht, die sich von der Lunge in tertiäre Stellen ausbreiten. Unseres Wissens ist dies die einzige Methode zur Untersuchung der Redissemination von Tumorzellen und der Aussaat von Metastasen zu Metastasen aus der Lunge, die keine Genomanalyse erfordert.

Einleitung

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Metastasen sind die häufigste krebsbedingte Todesursache1. Metastasierender Krebs entsteht, wenn sich Zellen des Primärtumors im ganzen Körper ausbreiten und sich zu klinisch nachweisbaren Tumoren in entfernten Organen vermehren 2,3.

Obwohl die Metastasierung gemeinhin als unidirektionaler Prozess angesehen wird, bei dem sich Tumorzellen vom Primärtumor aus ausbreiten und entfernte Organe besiedeln4, deuten immer mehr klinische und experimentelle Beweise darauf hin, dass ein komplexerer, multidirektionaler Prozess im Spiel ist. Es hat sich gezeigt, dass zirkulierende Tumorzellen den Primärtumor wieder einsäen können (falls noch vorhanden)5,6,7,8,9, und Tumorzellen aus bestehenden metastasierten Herden können zu tertiären Stellen wandern und neue Läsionen hervorrufen 10,11,12,13. Tatsächlich deuten neuere Genomanalysen darauf hin, dass einige metastasierende Läsionen nicht vom Primärtumor, sondern von anderen Metastasen stammen - ein Phänomen, das als "Metastasierung von Metastasen" oder "Metastasen-zu-Metastase-Seeing" bekannt ist14,15,16. Die Aussaat von Metastasen zu Metastasen kann den Krankheitsprozess auch nach der Entfernung des Primärtumors fortsetzen, die Metastasierungslast erhöhen und die Lebensqualität und das Überleben der Patienten verringern. Daher ist das Verständnis der Prozesse, die hinter der Aussaat von Metastasen zu Metastasen stehen, von entscheidender Bedeutung, um Behandlungsstrategien für Patienten mit metastasierender Erkrankung zu verfeinern.

Trotz der potenziell schwerwiegenden klinischen Auswirkungen ist nur wenig über die Aussaat von Metastasen zu Metastasen bekannt, was zum Teil auf logistische und technologische Einschränkungen zurückzuführen ist. Studien am Menschen sind durch einen Mangel an klinischen Proben begrenzt. Klinische Resektionen und Biopsien von metastasierten Läsionen sind selten, ebenso wie die Biopsie von scheinbar gesunden Organen, in denen einzelne gestreute Tumorzellen lauern können. Das bedeutet, dass Studien am Menschen in der Regel nur mit Autopsieproben von Personen möglich sind, deren Primärtumoren entweder noch vorhanden sind oder zuvor reseziert wurden, aber den Forschern noch zur Verfügung stehen. Wenn solche Proben verfügbar sind, müssen Abstammungsanalysen der Krebsprogression mit Hilfe von Sequenzierungsmethodendurchgeführt werden 14. Die Massensequenzierung von übereinstimmenden Primärtumoren und Metastasen hat jedoch nicht die Sensitivität, die für eine umfassende Abstammungsverfolgung erforderlich ist. Zum Beispiel kann die Massensequenzierung einer Läsion einen Subklon aufdecken, der in keiner seiner passenden Läsionen nachweisbar ist. In diesem Fall wäre es nicht möglich, die Herkunft dieses Subklons zu bestimmen. Es kann im Primärtumor oder in einer anderen Metastase mit einer Häufigkeit unterhalb der Nachweisgrenze vorhanden gewesen sein, oder es kann nach der anfänglichen Kolonisierung der metastasierten Läsion entstanden sein, in der es gefunden wurde. Die Einzelzellsequenzierung bietet eine erhöhte Empfindlichkeit, aber ihre hohen Kosten schränken die großflächige Anwendung dieser Technik ein. Der retrospektive Charakter dieser Studien bedeutet auch, dass sie nur begrenzte Einblicke in transiente metastasierende Ereignisse und die Krankheitslandschaft zu verschiedenen Zeitpunkten bieten.

In Tiermodellen ermöglichen die jüngsten technologischen Fortschritte nun eine prospektive phylogenetische Kartierung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung 17,18,19,20. Diese Techniken nutzen die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung, um Zellen mit einem sich entwickelnden Barcode zu manipulieren - vererbbare Mutationen, die sich im Laufe der Zeit ansammeln. Bei der Sequenzierung kann die Abstammung jeder Zelle anhand des Mutationsprofils ihres Barcodes 17,18,19,20 zurückverfolgt werden. Tatsächlich wird eine solche Technologie bereits eingesetzt, um die Aussaat von Metastasen zu Metastasen abzubilden. In einer kürzlich erschienenen Arbeit zeigten Zhang et al., dass Brust- und Prostatakrebszellen in Knochenmetastasen aus dem Knochen zu sekundären Metastasen in mehreren Organen zurückkehren21.

Während diese neuartigen Methoden ein großes Potenzial haben, detaillierte, hochauflösende phylogenetische Karten der Krebsprogression zu erstellen, sind sie höchst unpraktisch für diejenigen, die den genauen Zeitpunkt von Metastasierungs-zu-Metastasen-Seeing-Ereignissen untersuchen und was sie fördert oder verhindert. Die Schließung dieser Wissenslücken ist von entscheidender Bedeutung, um unser Verständnis und die Behandlung von metastasierendem Krebs zu verfeinern, aber es gibt einen deutlichen Mangel an Technologien, die solche Studien ermöglichen. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, haben wir kürzlich eine neuartige Technik entwickelt, die es uns ermöglicht, Tumorzellen durch Photokonversion in einer metastasierten Stelle (der Lunge) spezifisch zu markieren und sie anschließend in tertiären Organen zu reidentifizieren. Mit dieser Technik haben wir kürzlich gezeigt, dass sich Brustkrebszellen aus Lungenmetastasen und Seed-Tertiärorganen reseminieren13. Diese Technik kann auch verwendet werden, um den Zeitpunkt von Redisseminationsereignissen innerhalb eines engen Zeitfensters zu bestimmen und redisseminierte Tumorzellen zu quantifizieren, was die Untersuchung des Organotropismus von redisseminierten Zellen und der Frage, was die Redissemination fördert/verhindert, erleichtert.

Während Photokonversion und lokal induzierbare cre/lox-Systeme, die ein fluoreszierendes Protein dauerhaft durch ein anderes ersetzen, bereits zuvor zur Markierung und Verfolgung von Tumorzellen verwendet wurden 11,22,23, wurde unseres Wissens nach kein Ansatz für die räumlich-zeitliche Markierung von Tumorzellen optimiert, um auf die Lunge abzuzielen - eine der häufigsten Metastasierungsstellen bei Männern und Frauen, bei denen eine der 14 häufigsten Krebsarten diagnostiziert wurde 24. Jeder Krebszelltyp und jedes Protokoll zur Generierung von Lungenmetastasen kann mit unserem Verfahren verwendet werden, was es für Metastasenforscher allgemein nützlich macht. Alle Krebszellen, die zur Bildung von Lungenmetastasen verwendet werden, sollten ein photokonvertierbares oder photoschaltbares Protein exprimieren, und die Forscher können je nach ihren spezifischen Bedürfnissen und Ressourcen auswählen, welches Protein sie verwenden möchten. In dieser Studie verwendeten wir 6DT1-Brustkrebszellen, die stabil das photokonvertierbare grün-rot fluoreszierende Protein Dendra2 (6DT1-Dendra2-Zellen)25 exprimierten, das an das Histon H2B gebunden war. Wir injizierten 5,0 × 104 6DT1-Dendra2-Zellen in das vierte Brustfettpolster weiblicher Rag2-/- Mäuse. Die Primärtumoren waren zwischen 12 und 16 Tagen nach der Injektion tastbar und wurden für die Dauer des Experiments nicht reseziert. Spontane Lungenmetastasen entwickelten sich zwischen 19 und 26 Tagen nach der Injektion von Tumorzellen. Photokonversionsoperationen wurden zwischen 26 und 29 Tagen nach der Injektion der Tumorzellen durchgeführt. Die Mäuse wurden 72 Stunden nach der Operation aufgrund der Belastung durch Lungenmetastasen getötet.

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Protokoll

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Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften für die Verwendung von Wirbeltieren durchgeführt, einschließlich der vorherigen Genehmigung durch das Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.

Vor der Operation sollen Lungenmetastasen in Mäusen mit Hilfe von Krebszellen erzeugt werden, die ein photokonvertierbares/photoschaltbares Protein exprimieren; Es wurden mehrere Protokolle zur Generierung von Lungenmetastasen veröffentlicht 26,27,28.

1. Vorbereitung auf die Operation

  1. Bereiten Sie verschiedene Arbeitsbereiche für die Vorbereitung der Maus (Haarentfernung und Intubation), die Operation und die Genesung vor.
  2. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente in einem Autoklaven.
    HINWEIS: Da bei dieser Operation nur eine Tips-Technik verwendet wird, kann ein Heißperlen-Sterilisator verwendet werden, um Instrumente für nachfolgende Eingriffe zu resterilisieren.
  3. Schalten Sie die beheizte Operationsplattform ein und lassen Sie sie bei 37-40 °C erreichen und stabilisieren.
  4. Induzieren Sie eine Anästhesie mit 5 % Isofluran und senken Sie dann das Isofluran auf 3 %. Führen Sie während des gesamten Eingriffs regelmäßig Zehenklemmtests durch, um die Angemessenheit der Anästhesie zu beurteilen.
  5. Bringen Sie die anästhesierte Maus in eine rechte seitliche Dekubitusposition. Entfernen Sie die Haare der oberen linken Brust/des seitlichen Körpers (siehe Abbildung 1A), indem Sie Enthaarungscreme auf den Bereich auftragen. Befeuchten Sie ein Stück Gaze oder Papiertuch mit Wasser und wischen Sie das Haar und die Enthaarungscreme weg. Wiederholen Sie den Vorgang nach Bedarf, bis alle Haare aus dem Operationsfeld entfernt sind.
    HINWEIS: Lassen Sie die Enthaarungscreme nicht länger als 20 s auf der Maus, da dies die Haut schädigen kann.
  6. Binden Sie einen Doppelknoten ~3 mm über der Basis eines 22-G-Katheters mit 2-0-Seidennaht. Lassen Sie 2 Zoll lange Schwänze stehen.
  7. Intubieren Sie die Maus mit diesem Katheter wie zuvor beschrieben29,30. Um eine erfolgreiche Intubation zu bestätigen, befestigen Sie eine Aufblasbirne am Ende des Katheters und drücken Sie sie vorsichtig zusammen.
    HINWEIS: Bei Mäusen, die erfolgreich intubiert wurden, kommt es zu einer beidseitigen Anhebung des Brustkorbs mit Bulbusquetschung.
  8. Befestigen Sie die 2-0-Seidennaht mit einem Doppelknoten fest um die Schnauze der Maus, um den Intubationskatheter an Ort und Stelle zu halten.

2. Operation zur Freilegung der Lunge

HINWEIS: Führen Sie alle Schritte der Operation (Abbildung 1), einschließlich der Photokonversion, in einer Haube oder einem Laminar-Flow-Schrank durch, um eine Kontamination des Operationsfeldes zu vermeiden.

  1. Waschen Sie sich die Hände mit antiseptischer Seife und ziehen Sie neue sterile Handschuhe an.
    HINWEIS: Da bei dieser Operation nur Spitzen verwendet werden, können auch unsterile Handschuhe verwendet werden. Es wird empfohlen, unsterile Handschuhe mit einem Desinfektionsmittel auf Alkoholbasis zu desinfizieren.
  2. Bereiten Sie eine Dosis von 0,1 mg/kg Buprenorphin (0,03 mg/ml) vor und injizieren Sie es subkutan zur Analgesie.
    HINWEIS: Multimodale Analgesie, einschließlich lokaler Schmerzblocker und nichtsteroidaler Antirheumatika, sollte in Verbindung mit Buprenorphin angewendet werden, wenn nicht zu erwarten ist, dass sie die Biologie von Interesse beeinträchtigen.
  3. Tragen Sie Augensalbe auf beide Mäuseaugen auf, um Hornhautschäden zu vermeiden.
  4. Platzieren Sie die Maus in der rechten seitlichen Dekubitusposition auf der beheizten Operationsplattform.
  5. Schließen Sie das Beatmungsgerät an den Intubationskatheter an. Achten Sie darauf, den Katheter ruhig zu halten, da bereits leichte Bewegungen die Katheterplatzierung stören und zu einer schlechten Belüftung führen können.
  6. Beobachten Sie ein stabiles, beatmungsgesteuertes, beidseitiges Heben und Senken des Brustkorbs.
  7. Befestigen Sie die Gliedmaßen mit Beschriftungsband an der Operationsplattform. Stabilisieren Sie das Operationsfeld, indem Sie ein weiteres Stück Klebeband entlang des Rückens der Maus anbringen und die Rückenhaut und das Fell an der Operationsplattform befestigen (Abbildung 1A).
  8. Öffnen Sie die sterilisierten chirurgischen Instrumente.
  9. Tragen Sie Chlorhexidinlösung auf die Haut der Maus auf, um die Operationsstelle zu sterilisieren.
  10. Identifizieren Sie den Bereich ~7 mm links vom Brustbein und ~7 mm über dem subkostalen Rand. Heben Sie die Haut mit einer Pinzette über diesen Bereich und machen Sie einen ~10 mm kreisförmigen Schnitt mit einer scharfen Mikropräparierschere, wobei Sie darauf achten, nur die Haut zu schneiden.
  11. Entfernen Sie das Weichgewebe über dem Brustkorb (Abbildung 1B). Kauterisieren Sie alle größeren Gefäße an beiden Enden mit einem Kauterstift.
    HINWEIS: Zusätzlich zur Entfernung des gesamten Weichgewebes unter dem 10 mm kreisförmigen Hautschnitt erleichtert die Entfernung von zusätzlichem nicht-muskulärem Weichgewebe vom Umfang zukünftige Schritte des Eingriffs.
  12. Verwenden Sie mit einer Hand eine Pinzette, um die 6. oder 7. Rippe anzuheben. Mit der anderen Hand wird eine einzelne Klinge der stumpfen Mikropräparierschere - schräg zur Brustwand, abgerundete Kante nach unten - verwendet und den 6. oder 7. Zwischenrippenmuskel vorsichtig durchstochen, um in die Brusthöhle einzudringen (Abbildung 1C). Drehen Sie die Schere vorsichtig nach Bedarf und schneiden Sie, um einen ~10 mm langen Schnitt im Zwischenrippenraum zu machen, wobei Sie darauf achten müssen, dass Sie das Lungengewebe nicht berühren und die Rippen schneiden.
  13. Leiten Sie die Druckluft vorsichtig in Richtung des Zwischenrippenschnitts ab, um den Abstand zwischen der Lunge und der Brustwand zu vergrößern. Lassen Sie die Luft zuerst am Handgelenk oder an der Hand ab, um die richtige Strömungsstärke zu finden und die Düse von Schmutz zu befreien, und dann in kurzen Stößen am Einschnitt, um Lungenverletzungen zu vermeiden.
  14. Verwenden Sie mit einer Hand eine Pinzette, um die 6. oder 7. Rippe anzuheben. Mit der anderen Hand halten Sie den Retraktor geschlossen und führen ihn in den Interkostalschnitt ein. Richten Sie die Klingen des Retraktors so aus, dass sie parallel zur Brustwand verlaufen, und achten Sie darauf, dass Sie die Lunge selbst nicht berühren (Abbildung 1D).
  15. Sobald der Retraktor an Ort und Stelle ist, lassen Sie den Griff langsam los, damit sich der Retraktor öffnen und die Lunge freilegen kann (Abbildung 1E). Abbildung 2A zeigt repräsentative Bilder von exponierten Lungenmetastasen vor der Photokonversion, einschließlich ihres Aussehens mit bloßem Auge und in den FITC- (grün, nicht photokonvertierten) und TRITC- (rot, photokonvertierten) Fluoreszenzkanälen unter Verwendung von Weitfeldbeleuchtung.

3. Photokonversion von Lungenmetastasen

HINWEIS: Details und Variationen der folgenden Schritte finden Sie in der Diskussion.

  1. Tragen Sie vorsichtig 2-3 Tropfen steriles, auf 37 °C erwärmtes PBS auf das freiliegende Lungengewebe auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
  2. Legen Sie ein Stück sterile Alufolie mit einem kleinen Ausschnitt über die Maus. Positionieren Sie den Ausschnitt direkt über dem freigelegten Lungengewebe und legen Sie ihn so fest, dass nur der offene Teil des Thorax und einige Millimeter des umgebenden Weichgewebes und der Haut freigelegt werden, um die Photokonversion nur der freigelegten Lunge zu gewährleisten.
  3. Legen Sie eine Schachtel mit einem Ausschnitt über die Maus und die Alufolie. Stellen Sie sicher, dass sich der Ausschnitt direkt über der freiliegenden Lunge befindet.
  4. Platzieren Sie die Fotokonversionslampe direkt über der Aussparung an der Box (Abbildung 1F).
  5. Schalten Sie die Photokonversionslampe ein und lassen Sie das freiliegende Lungengewebe 6 Minuten lang ununterbrochen beleuchten.
    HINWEIS: Überwachen Sie die Vitalfunktionen der Maus mit den physiologischen Überwachungsprogrammen am Beatmungsgerät.
  6. Schalten Sie nach der Fotokonvertierung die Lampe aus und entfernen Sie die Lampe, die Box und die Aluminiumfolienmaske von der Maus.

4. Verfahren zum Schließen der Brustwand

  1. Wiederholen Sie Schritt 2.13, um die Lunge von der Brustwand zu trennen.
  2. Fassen Sie vorsichtig den Griff des Retraktors und drücken Sie ihn, um die Klingen zu schließen.
  3. Manövrieren Sie den geschlossenen Retraktor aus dem Interkostalraum heraus und achten Sie darauf, das Lungengewebe nicht zu berühren.
  4. Mit dem 5-0-Seidennaht wird der Interkostalschnitt mit einem einfachen durchgehenden Nahtmuster verschlossen, das die Rippe auf beiden Seiten des Einschnitts einschließt (Abbildung 1G). Ziehen Sie die Naht fest, um sicherzustellen, dass die Wundränder appositional sind und die Integrität der Brustwand wiederhergestellt wird (Abbildung 1H). Achten Sie darauf, die Naht nicht zu straffen, da dies die Zwischenrippenmuskeln reißen kann.
  5. Befestigen Sie die Naht, indem Sie die beiden Enden der Naht 4x miteinander verknoten. Schneiden Sie die Nahtenden so nah wie möglich am Knoten ab.
  6. Verschließen Sie die Haut mit chirurgischen Klammern.
  7. Entfernen Sie überschüssige Luft aus der Brusthöhle mit einer 1-ml-Insulinspritze mit einer 28-G-Nadel. Lokalisieren Sie den Processus xiphoideus taktil und führen Sie die Nadel direkt darunter in Richtung der linken Schulter ein, um durch das Zwerchfell in die Brusthöhle einzudringen. Ziehen Sie die Spritze auf ~1 ml zurück; Entfernen Sie die Nadel von der Maus und lassen Sie die Luft aus der Spritze ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-4x.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, keine inneren Organe zu punktieren. Darüber hinaus ist es wichtig, eine 1-ml-Spritze zu verwenden und den Vorgang 3-4x zu wiederholen, anstatt eine Spritze mit größerem Volumen zu verwenden und zu versuchen, die gesamte Luft auf einmal zu entfernen. Die Verwendung einer Spritze mit größerem Volumen kann zu einem zu großen Vakuum in der Brusthöhle führen und zu einer Dehnung und Schädigung des Lungengewebes führen.
  8. Schalten Sie das Isofluran aus.
  9. Beatmung mit 100 % Sauerstoff fortsetzen, bis die Maus Anzeichen eines Erwachens zeigt.
  10. Sobald die Maus Anzeichen des Erwachens zeigt, trennen Sie den Intubationskatheter vom Beatmungsgerät, durchtrennen Sie die Naht um die Schnauze und extubieren Sie die Maus.
  11. Entklebe die Maus und lege sie in einen sauberen Käfig, der ~2 Fuß unter einer Wärmelampe steht. Überwachen Sie, bis Sie sich vollständig erholt haben. Wenn die Maus Anzeichen von Atembeschwerden oder mangelnder Beweglichkeit zeigt, betäuben Sie sie 5 Minuten lang mit 5% Isofluran, sorgen Sie für eine angemessene Anästhesie, indem Sie einen Verlust der Reflexe beim Einklemmen der Zehen beobachten, und euthanasieren Sie sie durch Zervixluxation.
  12. Sobald die Maus vollständig aus der Narkose erwacht ist und sich zu bewegen beginnt, bereiten Sie eine weitere Dosis von 0,1 mg/kg Buprenorphin vor und injizieren Sie es subkutan zur postoperativen Analgesie.
  13. Stellen Sie nach der Operation sicher, dass die Mäuse einzeln untergebracht werden. Geben Sie Antibiotika in das Trinkwasser (Enrofloxacin, Endkonzentration 0,4 mg/ml).
  14. Untersuchen Sie die Maus in den 3 Tagen nach der Operation zweimal täglich auf Anzeichen von Leiden. Zur Schmerzbehandlung 0,1 mg/kg Buprenorphin (0,03 mg/ml) alle 4-6 Stunden subkutan verabreichen. Euthanasieren Sie die Maus, wenn sie Anzeichen von Infektion, Immobilität oder Atembeschwerden zeigt. Nach dem dritten Tag können die Mäuse einmal täglich kontrolliert werden.

5. Probenaufbereitung und Detektion photokonvertierter Zellen mittels Tissue Clearing

  1. Zwischen 3 und 5 Tagen (oder der gewünschten Zeitspanne) nach der Photokonversionsoperation wird die Maus mit 5 % Isofluran betäubt, Isofluran nach der Induktion von 5 % auf 2,5 % reduziert, eine angemessene Anästhesie sichergestellt, indem ein Verlust der Reflexe beim Einklemmen der Zehen beobachtet wird, und eine terminale transkardiale Perfusion mit 10 ml PBS bei Raumtemperatur durchgeführt, gefolgt von 10 ml 4%igem Paraformaldehyd, das auf 4 °C gekühlt wird, wie zuvor beschrieben31.
  2. Sammeln Sie die interessierenden Organe ein und reinigen Sie sie optisch, wie zuvor beschrieben31.
  3. Stellen Sie das gereinigte Gewebe mit einem Lichtblattmikroskop ab, wie zuvor beschrieben31. Alternativ können Sie das gereinigte Gewebe in eine Glasbodenschale geben und in den FITC- und TRITC-Kanälen abbilden, um grüne (nicht photokonvertierte) und rote (photokonvertierte) Zellen mit einem konfokalen, rotierenden Scheiben- oder Multiphotonenmikroskop zu visualisieren.

6. Probenverarbeitung und Detektion photokonvertierter Zellen mittels Gewebedisaggregation

  1. Betäuben Sie die Maus 5 Minuten lang mit 5% Isofluran, sorgen Sie für eine angemessene Anästhesie, indem Sie einen Verlust der Reflexe beim Einklemmen der Zehen beobachten, und opfern Sie 3-5 Tage nach der Photokonversion durch zervikale Luxation.
  2. Sammeln und verdauen Sie die Organe von Interesse, wie zuvor beschrieben13.
  3. Tellern Sie das verdaute Gewebe und legen Sie es in einen Inkubator, damit es über Nacht anhaftet, wie zuvor beschrieben13.
  4. Am nächsten Tag werden die plattierten Zellen in den FITC- und TRITC-Kanälen abgebildet, um grüne (nicht photokonvertierte) und rote (photokonvertierte) Zellen zu visualisieren, wie zuvor beschrieben13.

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Ergebnisse

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Die in diesem Protokoll beschriebenen Operationsschritte sind in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, die Maus wird betäubt und Haare aus dem linken Brustkorb entfernt. Die Maus wird dann intubiert und beatmet, so dass die Maus Sauerstoff erhalten kann, während die Brusthöhle geöffnet ist. Weichgewebe wird entfernt, um den Brustkorb freizulegen, und es wird ein Schnitt im 6. oder 7. Zwischenrippenmuskel gemacht. Ein Retraktor wird in den Interkostalbruch eingeführt und...

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Diskussion

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In dieser Arbeit beschreiben wir ein chirurgisches Protokoll für die selektive Photokonversion von Tumorzellen in der Lunge. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, Tumorzellen in der Lunge selektiv zu markieren und ihr Schicksal zu verfolgen, indem sie sie zu einem späteren Zeitpunkt im ganzen Körper neu identifizieren, was die Untersuchung der Metastasierung von Lungenmetastasen erleichtert. Mit diesem Protokoll war es möglich, photokonvertierte Zellen im Gehirn, in der Leber und in der nicht photokonvertierten rech...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.

Danksagungen

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Die Autoren danken Wade Koba für seine Unterstützung bei der Mikro-Computertomographie (S10RR029545), Vera DesMarais und Hillary Guzik von der Analytical Imaging Facility für ihre Ausbildung und Unterstützung bei der Mikroskopie, dem Einstein Montefiore Cancer Center, dem National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), dem Gruss Lipper Biophotonics Center, dem Integrated Imaging Program for Cancer Research, ein Sir Henry Wellcome Postdoctoral Fellowship (221647/Z/20/Z) und einen METAvivor Career Development Award.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0-30 V, 0-3 A NetzteilMPJA9616 PS
12 VDC, 1,2 A Ungeregelter Stecker VersorgungMPJA17563 PD
28 G 1 mL BD InsulinspritzeBD329410
400 nm Leuchtdioden-Array-LampeLedEngin Inc.897-LZPD0UA00Fotokonversionslampe, Sonderanfertigung (Einzelteile unten enthalten)
5-0 geflochtenes Seidennaht mit RB-1Schneidenadel Ethicon, Inc.774B
9 cm 2-0 Krawatte aus SeideEthicon, Inc.LA55G
Baytril 100 (Enrofloxacin)Bayer (Santa Cruz Biotechnology)sc-362890RxAntibiotikum für Trinkwasser
BuprenorphinHospira0409-2012-32Analgetische
Kabel (Kabelkonfektionen) 2,5 JK-ST 72" ZIP CDMouser172-0250
ChlorhexidinlösungDurvet7-45801-10258-3Chlorhexidin Desinfektionslösung
DruckluftkanisterFalconDPSJB-12
Extra feine Mikro-Präparierschere 4" Gerade Scharf/Scharf 24 mmRoboz SurgicalRS-5912Scharfe Mikro-Präparierschere
Faseroptische BeleuchtungO.C. White CompanyFL3000Wird bei der Intubation von Mäusen
verwendet Gemini Cautery KitHarvard Apparatus726067Kauter-Stift
Keimer 500CellPoint ScientificDER  5287-120VBead Sterilisator
Graefe PinzetteRobozRS-5135
Hochleistungs-LEDs - einfarbig ultraviolett 90 WattMouserLZP-D0UA00
Infrarot-WärmelampeBraintree ScientificHL-1
Isofluran SOL 250 mL PVLCovetrus29405Anästhetikum
Isofluran-VerdampferSurgiVetVCT302
Jacobson Nadelhalter mit SchlossKalson SurgicalT1-140
BeschriftungsbandFisher ScientificS68702
LED Beleuchtung Reflektoren CREE MP-L SNGL OBJEKTIV REFLEKTOR & LOC PINMouser928-C11395TM
Applikatoren mit langer WattespitzeMedline IndustriesMDS202055
Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4 / Celeron bis zu 3,4 GHz / Kugellager / Kupferkern / CPU-LüfterCompUSA#S457-1023
Mikro-Präparierschere 4" Gerade Blunt/BluntRoboz SurgicalRS-5980Blunt Mikro-Präparierschere
Beatmungsgerät für MausKent Scientific PS-02PhysioSuite
Nair HaarentfernungslotionAmazonB001RVMR7KEnthaarungscreme
Personnet Mini-RetraktorRobozRS-6504Retraktor
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung 1xFisher Scientific14190144PBS
pLenti.CAG.H2B-Dendra2.WAddgene51005Dendra2 Lentivirus
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Eye Lubricant
Nagetier IntubationsständerBraintree ScientificRIS 100
Kleintier-LungenaufblasbirneHarvard Apparatus72-9083
SurgiSuite Multifunktionale chirurgische Plattform für Mäuse, mit wärmenderKent ScientificSURGI-M02Beheizte chirurgische Plattform
Messleitungen 48" TESTLEITUNG BANANE - SchwarzMouser565-1440-48-0
Messleitungen 48" MESSLEITUNG BANANE - RotMouser565-1440-48-2
Trachealkatheter Exelint International2674622 G Katheter
Wundverschlusssystem Veterinär-KitClay AdamsIN015Veterinärchirurgisches Heftset

Referenzen

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